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Biology

DNA-RNA combinato fluorescente Published: June 14, 2014 doi: 10.3791/51628
Automatic Translation
1, 1
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

Summary

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette la rilevazione di acidi nucleici nel loro ambiente nativo all'interno delle cellule. Noi descriviamo qui un protocollo per la, rilevazione simultanea combinata di RNA e DNA mediante FISH, che può essere usato per studiare inattivazione del cromosoma X in cellule staminali embrionali di topo.

Abstract

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è una tecnica molecolare che consente il rilevamento di acidi nucleici nelle cellule. FISH DNA è spesso usato in citogenetica e diagnostica del cancro, e può rilevare aberrazioni del genoma, che spesso ha importanti implicazioni cliniche. RNA FISH può essere utilizzato per rilevare molecole di RNA in cellule e ha fornito spunti importanti nella regolazione dell'espressione genica. La combinazione di DNA e RNA FISH all'interno della stessa cellula è tecnicamente impegnativo, in quanto le condizioni adatte per FISH DNA potrebbe essere troppo duro per i fragili, molecole di RNA a singolo filamento. Riportiamo un protocollo facilmente applicabile, che consente, rilevazione simultanea combinata di Xist RNA e DNA codificato dai cromosomi X. Questo protocollo FISH DNA-RNA combinato può probabilmente essere applicata ad altri sistemi in cui sia RNA e DNA devono essere rilevata.

Introduction

Studiando cellule e tessuti mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH) ha, sin dalla sua introduzione nel tardo 1970 1, ha permesso ai ricercatori di studiare i geni, l'organizzazione della cromatina e l'espressione genica a livello subcellulare. FISH DNA è spesso usato in citogenetica, cariotipo 2, diagnostica oncologica 3 e pre-impianto screening genetico 4, ed ha un ruolo importante nella ricerca molecolare 5-6 in quanto permette la rilevazione di acidi nucleici nel loro ambiente nativo. Singolo analisi di espressione cella RNA FISH in grado di rilevare trascritti primari autoctone ed RNA non codificanti essere trascritto da cromosomi, e offre vantaggi ad altre tecniche che valutano l'espressione genica a livello di popolazione, tra cui ad esempio RT-PCR quantitativa, genoma vasta analisi di espressione o Northern blotting . Visualizzando trascritti di RNA provenienti direttamente dai loro luoghi di origine, è stato per esempionotato che l'espressione genica è stocastico 7, e può a volte essere allele specifico 8. Miglioramenti nella tecnica hanno anche permesso l'individuazione e la quantificazione di molecole di mRNA singoli all'interno delle cellule 9-11.

Il principio di base della FISH consiste di ibridazione di acidi nucleici all'interno della cella a una sonda di acido nucleico mediante altamente specifico Watson e Crick base-accoppiamento. La sonda può essere direttamente o indirettamente rilevato, risultando in un segnale che può essere visualizzata microscopicamente. I tentativi iniziali consistevano di sonde marcati radioattivamente, che aveva inconvenienti basato su questioni di sicurezza, la risoluzione spaziale limitata e la capacità di rilevare solo un obiettivo alla volta 12-14. Il successivo sviluppo di marchi non radioattivi, tra cui fluorocromi, apteni, ed enzimi, ha permesso l'uso diffuso di pesce come una tecnica di biologia molecolare di routine. La sonda FISH può o essere etichettato direttamente con fluorochRomes collegando chimica delle molecole fluorescenti di acido nucleico sequenze 15 e l'integrazione dei nucleotidi fluorescente 16-19, o la sonda può essere indirettamente visualizzate dopo integrazione di apteni (compresi biotina e digossigenina) e rivelazione immunologica di apteni da anticorpi specifici coniugati con aptene reporter fluorescente molecole 20-21. Quest'ultimo approccio permette l'amplificazione del segnale utilizzando diversi strati di fluorescente anticorpi che vengono utilizzati per migliorare il segnale originale, e consente il rilevamento di specie di RNA che sono espressi a livelli bassi. Combinando tecniche di etichettatura diretti e indiretti e vari apteni, diversi obiettivi possono essere contemporaneamente visualizzati all'interno della stessa cella.

Uno dei passi più importanti nei protocolli di pesce è l'ibridazione della sonda al suo obiettivo. Sebbene in teoria, una sonda verrà specificatamente legarsi solo al suo bersaglio, in pratica, questa specificitànon è sempre raggiunto, come sonde possono legarsi a regioni omologhe, e condizioni di ibridazione non sempre ideale per una certa regione di DNA o RNA specie. Lavaggi post-ibridazione sono quindi di particolare importanza, in quanto possono aumentare la severità della procedura FISH, e possono impedire il legame non specifico di sonde FISH, che porterebbe a un elevato livello di rumore di fondo. Come molecole di RNA sono a singolo filamento che possano essere facilmente ibridate ad una sonda FISH. Al contrario, la molecola di DNA a doppio filamento deve prima una fase di denaturazione, dopo che una sonda può ibridare. Ciò viene ottenuto mediante riscaldamento del campione, che provoca la denaturazione del DNA. Tuttavia, in queste condizioni difficili, fragili molecole di RNA a singolo filamento potrebbero essere persi. Pertanto, DNA-RNA combinato FISH richiede significativa ottimizzazione delle condizioni, ed è tecnicamente più difficile rispetto alla rilevazione separata di soli RNA o DNA.

Qui Presenta protocollo dettagliato della produzione combinata e simultanea FISH DNA-RNA che ci ha permesso di studiare inattivazione del cromosoma X (XCI) nella differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo femmina 22-24. XCI è un meccanismo epigenetico cruciale per lo sviluppo embrionale femmina 25, e si traduce in heterochromatinization e quindi silenziamento di uno dei due cromosomi X in individui femmina 26-27. Essenziale per questo processo è l'RNA non codificante Xist 28-30, che è regolata dalle RNF12 22-23 e Rex1 24 proteine. Espressione Xist diventa sovraregolati sul futuro cromosoma X inattivo (Xi) durante lo sviluppo embrionale o sulla differenziazione delle cellule ES in vitro , e può diffondersi lungo il cromosoma X e, quindi, ottenere il rimodellamento della cromatina enzimi che provocano l'arresto della trascrizione del cromosoma X 31. Questa diffusione di Xist RNA possono essere visualizzati da RNA FISH come rivestimento di X cromoalcuni, che è indicato anche come una nube Xist. Dal momento che le cellule staminali femminili possono perdere uno dei loro cromosomi X a causa di instabilità genomica, noi ed altri abbiamo impiegato combinato DNA-RNA FISH a studiare XCI, fare in modo che le cellule solo karyotypically stabili sono valutati nell'analisi di questo importante processo 22,32 -34. Come per ogni tecnica di biologia molecolare, diversi protocolli diversi eccellenti sono stati pubblicati 35-38. Presentiamo qui il nostro metodo, partendo dalla induzione del differenziamento in cellule ES di topo, fissazione delle cellule, etichettatura di sonde FISH di Nick-traduzione, pretrattamento di cellule fissate per consentire permeabilizzazione e conseguente assorbimento sonda, l'ibridazione della sonda al bersaglio, e infine il rilevamento della sonda fluorescente anticorpi. Il protocollo qui presentato permette la rilevazione fedeli di Xist RNA e il cromosoma X entro due giorni, e le basi di questa tecnica può probabilmente essere adattata per oti suoi sistemi e settori di ricerca.

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Protocol

1. Induzione del differenziamento in cellule staminali embrionali femminile per indurre inattivazione del cromosoma X

NOTA: le cellule staminali embrionali di topo femmina (disponibili su richiesta) sono cresciuti in condizioni di celle standard ES su piastre di coltura gelatinizzati rivestiti con fibroblasti embrionali di topo (MEF). Siamo qui per scontato che il lettore abbia familiarità con le tecniche standard di coltura cellulare 39-41. Per indurre il differenziamento, le cellule staminali coltivate in piatti T25 saranno separati dal MEF, e saranno piastrate in medium di differenziazione.

  1. Rimuovere ES terreno dalla coltura di cellule ES, e lavare due volte con PBS coltura cellulare.
  2. Aggiungere 1,5 ml di tripsina-EDTA (preriscaldata a 37 ° C), e incubare le cellule a 37 ° C per 7 minuti. Dopo 3,5 minuti, agitare delicatamente il piatto per rompere le colonie.
  3. Inattivare la tripsina-EDTA aggiungendo 3,5 ml di terreno di differenziamento delle cellule. Cellule pipette su e giù per ottenere una soluzione singola cella, e raccoglierein una provetta da 15 ml. Spin per 5 minuti a 200 xg, e raccogliere le cellule in 10 ml di terreno di differenziamento.
  4. Aggiungere sospensione cellulare in un piatto di coltura non-gelatinizzato, e incubare per 1 ora in un incubatore di coltura cellulare. NOTA: MEF saranno in grado di aderire al piatto di coltura non-gelatinizzato, mentre le cellule ES rimarranno in sospensione.
  5. Nel frattempo, aggiungere vetrini sterilizzati (24 x 24 mm) a 6 pozzetti, aggiungere 0,2% di gelatina, e incubare per minimo 5 min a temperatura ambiente.
  6. Dopo 1 ora, raccogliere il surnatante della coltura di cellule ES pre-plated, che sarà principalmente costituito da non-aderenti cellule ES. Piatto cellule ES a 6-pozzetti contenenti lamelle. NOTA: L'uso ⅙ th di un piatto confluenti T25 per 6 pozzetti di una piastra da 6 pozzetti. Ciò consentirà una differenziazione confluenti e dopo 3 giorni di differenziamento. Modificare medio su base giornaliera. Per lunghi corsi a tempo differenziazione, piatto pre-plated cellule staminali embrionali in terreno di differenziamento in piatti batteriche, e incubmangiato su un agitatore cella integrata nella incubatore di coltura cellulare. Questo permetterà le cellule formano corpi embrionali, che può essere placcato al coprioggetto 1-2 giorni prima del fissaggio.

2. Fissazione delle cellule differenziate ES per la successiva DNA-RNA FISH Analysis

  1. Rimuovere il terreno di differenziamento da colture di differenziazione, e lavare due volte con coltura cellulare PBS. NOTA: Aggiungi attenzione PBS per impedire alle cellule di essere spazzati via.
  2. Rimuovere coltura cellulare PBS e fissare cellule aggiungendo 4% paraformaldeide (PFA) / PBS e incubare per 10 min a temperatura ambiente. ATTENZIONE: PFA è tossico e può causare notevoli rischi per la salute quando viene inalato o quando è in contatto con la pelle o gli occhi. Inoltre, PFA è cancerogeno.
  3. Rimuovere 4% PFA / PBS, e lavare coprioggetto 3x con il 70% di etanolo. NOTA: il lavaggio corretto è importante, come ogni traccia di PFA interferisce con le successive fasi di pesce. Coprioggetto possono essere memorizzati in 70% di etanolo a -20 ° C per diversi mesi prima FAnalisi ISH.

3. Etichettatura di sonde di DNA per gli esperimenti PESCE

NOTA: Ottenere un frammento di DNA del gene di interesse (lunghezza minima> 2 kb per RNA FISH, o> 20 kb per FISH DNA), o un tasso alcolemico che copre il gene di interesse. Per il rilevamento di RNA, una sonda più piccola può essere sufficiente rispetto alla rilevazione del DNA, poiché molto probabilmente trascrizione darà luogo a più trascritti, che possono essere rilevati simultaneamente. Per un segnale forte sul filamento singolo di DNA copia, è necessaria una sonda più lunga, per essere in grado di rilevare un numero sufficiente di apteni incorporati. Preferibilmente, una regione genomica non trascritto è scelto per progettare la sonda di DNA. Inoltre, quando si utilizza una sonda più piccola per rilevare l'RNA, si impedirà che l'loci genomici da cui l'RNA viene trascritto viene rilevato nell'approccio FISH DNA-RNA combinato, anche se questo non può essere completamente escluso. Per rilevare topo Xist, è stata utilizzata una sonda di cDNA di 5,5 kb. Per detezione del cromosoma X, possono essere utilizzate diverse sonde BAC. Buoni risultati sono stati ottenuti con una miscela di BAC RP23-100E1 e BAC CT7-474E4, che si trovano in prossimità del locus Xist. A seconda del gene o cromosoma di interesse, più sonde differenti potrebbero essere necessari per ottenere risultati ottimali. Ogni volta che si lavora con materiali che saranno utilizzati per l'RNA-FISH, utilizzare punte sterili filtri, RNasi libero H 2 O, e lavorare in un ambiente pulito.

  1. Prendere 1 mg di DNA e diluire in H 2 O in un volume totale di 16 microlitri. Aggiungere 4 ml di digoxigenin o soluzione di etichettatura biotina (vedi reagenti), mescolare nel vortex e incubare a 16 ° C per 90 min. NOTA: La biotina o nucleotidi digossigenina saranno ora inseriti da nick-translation.
  2. Nel frattempo, preparare le colonne G50 per rimuovere i nucleotidi non-integrati. Prendete una siringa da 2 ml, togliere la matrice, e aggiungere il cotone sterilizzato nella siringa. Aggiungere palle G50 in soluzione to riempire la siringa, posizionare siringa in una provetta da 15 ml e centrifugare a 642 xg per 1 min. NOTA: Circa l'80% della siringa dovrebbe ora essere riempito con G50. Ripetere quando meno G50 è presente.
  3. Dopo 90 minuti, aggiungere 40 ml di H 2 O alla miscela di reazione nick-translation, e aggiungere la reazione alla colonna G50. Aggiungere un tubo vuoto nella colonna, e centrifugare a 642 xg per 2 minuti. Raccogliere il flusso attraverso un tubo di reazione.
  4. Misurare il volume del flusso attraverso con una pipetta e aggiungere H 2 O per raggiungere un volume totale di 200 microlitri. Precipitare il flusso attraverso l'aggiunta di 13,3 ml di DNA di sperma di salmone (10 mg / ml), 13,3 microlitri tRNA di lievito (10 mg / ml), 26,7 microlitri topo Cot-1 DNA (1 mg / ml) e 28 microlitri 2 M NaAc, pH 5.6. Mescolare nel vortex, e aggiungere 533 ml di ghiaccio freddo al 100% di etanolo. Agitare la provetta e centrifugare a 16.200 xg per 30 min a 4 ° C.
  5. Rimuovere il surnatante, e lavare pellet due volte con etanolo al 70%. Centrifugare a 16.200 xg per 5 min a4 ° C, e asciugare il pellet. Aggiungere 50 ml di soluzione al 50 + ibridazione, e incubare a 37 ° C per 30 min per facilitare dissoluzione. NOTA: etichetta sonda può essere conservato per diversi anni a -20 ° C. ATTENZIONE: 50 + soluzione di ibridazione contenente formammide, che è tossico, può irritare la pelle, gli occhi e l'apparato respiratorio, ed è anche un teratogeno.

4. Permeabilization, pre-trattamento e ibridazione di cellule fissate per Combined DNA-RNA FISH

  1. Reidratare cellule fissate su vetrini, rimuovendo il 70% di etanolo e l'aggiunta della coltura cellulare PBS alle piastre a 6 pozzetti. Incubare per 5 min. Ripetere in totale tre volte.
  2. Rimuovere coltura cellulare PBS e aggiungere 0,2% pepsina alle piastre da 6 pozzetti, per permeabilize le cellule. Incubare le piastre a 6 pozzetti in un bagno d'acqua a 37 ° C per 4 min. Rimuovere pepsina e inattivare con RNAsi libera H 2 O.
  3. Cellule post-fix di incubazione con il 4% PFA / PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo fixatisu, lavare due volte con PBS coltura cellulare per 5 min.
  4. Disidratare incubando le cellule con etanolo al 70% per 3 min, 90% di etanolo per 3 min e 100% etanolo per 3 min. Trasferimento coprioggetto su piastre da 6 pozzetti e coprioggetto secco aria per diversi minuti.
  5. Età cellule di incubazione vetrini a 65 ° C per 1 ora su un piatto caldo.
  6. Pre-ibridare sonda FISH con il mouse Cot-1 DNA sommando per ogni vetrino da analizzare, 25 ml di soluzione di 50 + ibridazione, 0,5 microlitri del mouse Cot-1 DNA, 1 ml di sonda Xist biotina marcata e 1 ml di digossigenina sonda BAC marcata rilevare il cromosoma X. Mescolare nel vortex e denaturare a 99 ° C per 5 min. Incubare immediatamente a 37 ° C per 45 minuti, per consentire Cot-1 DNA per ibridare ripetere sequenze presenti nelle sonde.
  7. Dopo l'invecchiamento, individuare 50 microlitri di tampone di denaturazione (comprensivi di 70% formamide/2x tampone fosfato SSC/10 mM) su un vetrino e coprioggetto mettere in cima con cellule rivolto towards buffer denaturazione. Incubare a 65 ° C per 2 min.
  8. Aggiungi coprioggetto torna alla 6 pozzetti e cellule post-fix incubando in ghiaccio freddo etanolo al 70% per 5 min.
  9. Disidratare cellule da successiva incubazione in etanolo al 70% per 3 min, 90% di etanolo per 3 min e 100% etanolo per 3 min. Rimuovere il coprioggetto da 6 pozzetti e lasciare asciugare per alcuni minuti.
  10. Spot sonda pre-ibridato su un vetrino, e incubare coprioggetto sulla parte superiore. Posizionare i vetrini in una camera umidificata riempita con 50 ml 50% formamide/2x SSC, e incubare una notte a 37 ° C.

5. Lavaggi post-ibridazione e anticorpi Mediated Rilevamento di sonda

  1. Fill 6 pozzetti con 2x SSC, e pre-riscaldare fino a 42 ° C. Aggiungere coprioggetto dopo incubazione notturna, e incubare a 42 ° C per 5 min.
  2. Rimuovere 2x SSC, e incubare coprioggetto con il 50% formamide/2x SSC per 10 minuti a 42 ° C. Ripetere in totale 3 volte (30 min di lavaggio del tutto). Rimuovere 50% formamide/2x SSC, e lavare i vetrini con Tris-salino-Tween (TST) da 2 x 5 min a temperatura ambiente.
  3. Spot 50 ml Tris-salino-BSA (TSBSA) per vetrino sui nuovi vetrini e incubare vetrini a testa in giù per bloccare durante 30 minuti a temperatura ambiente in una camera oscura TST-umidificata.
  4. Trasferimento coprioggetto torna a 6 pozzetti e lavare per 2 x 5 minuti con TST.
  5. Spot 50 ml di anticorpi di pecora anti-dig (1:500 in TSBSA) per vetrino sui nuovi vetrini e incubare coprioggetto upside-down per la prima fase di incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera oscura TST-umidificata.
  6. Trasferimento coprioggetto torna a 6 pozzetti e lavare per 2 x 5 minuti con TST.
  7. Spot 50 ml di coniglio anti-pecora anticorpo coniugato con FITC (1:250 in TSBSA) per vetrino sui nuovi vetrini e incubare vetrini a testa in giù per la seconda fase di incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera oscura TST-umidificata .
  8. Transfer coprioggetto torna a 6 pozzetti e lavare per 2 x 5 minuti con TST.
  9. Spot 50 ml di anticorpi di capra anti-coniglio coniugato con FITC (1:250 in TSBSA) per vetrino sui nuovi vetrini e incubare vetrini a testa in giù per la terza fase di incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera oscura TST-umidificata .
  10. Trasferimento coprioggetto torna a 6 pozzetti e lavare per 2 x 5 minuti con TST.
  11. Spot 50 ml di topo anti-biotina anticorpi (1:200 in TSBSA) per vetrino sui nuovi vetrini e incubare lamelle a testa in giù per la quarta fase di incubazione durante 30 minuti a temperatura ambiente in una camera oscura TST-umidificata.
  12. Trasferimento coprioggetto torna a 6 pozzetti e lavare per 2 x 5 minuti con TST.
  13. Spot 50 ml di anticorpi asino-anti-topo coniugati con rodamina (1:250 in TSBSA) per vetrino sui nuovi vetrini e incubare lamelle a testa in giù per la quinta fase di incubazione durante 30 minuti a temperatura ambiente in un chamb scuro TST-umidificataER.
  14. Trasferimento coprioggetto torna a 6 pozzetti e lavare per 2 x 5 minuti con TST.
  15. Spot 50 ml di anticorpi di capra anti-cavallo coniugata con Rhodamine (1:250 in TSBSA) per vetrino sui nuovi vetrini e incubare vetrini a testa in giù per la sesta fase di incubazione durante 30 minuti a temperatura ambiente in una camera oscura TST-umidificata . NOTA: l'anticorpo di capra anti-cavallo riconoscerà l'anticorpo asino-anti-topo; quando a disposizione del ricercatore, un anticorpo di capra anti-donkey funzionerà pure.
  16. Trasferimento coprioggetto torna a 6 pozzetti e lavare per 2 x 5 minuti con TST. Lavare ulteriore 5 min con Tris-salino (TS).
  17. Disidratare cellule da successiva incubazione in etanolo al 70% per 3 min, 90% di etanolo per 3 min e 100% etanolo per 3 min. Rimuovere il coprioggetto da 6 pozzetti e lasciare asciugare per alcuni minuti.
  18. Identifica una goccia di mezzo di montaggio con DAPI (vedi reagenti) su un vetrino e aggiungere coprioggetto a testa in giù in cima. Sigillare i vetrini con smalto evalutare i risultati FISH mediante microscopia a fluorescenza (Figura 1).

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Representative Results

Utilizzando il protocollo di cui sopra per il combinato DNA-RNA FISH, siamo stati in grado di visualizzare inattivazione del cromosoma X nella differenziazione delle cellule staminali embrionali femminili. Figura 1 mostra un esempio rappresentativo di un esperimento FISH DNA-RNA, dove abbiamo rilevato sia Xist (che è visibile come un cosiddetto Xist RNA nube sul cromosoma X inattivo e un puntino trascrizione basale sul cromosoma X attivo), e una regione del cromosoma X, che è visibile come un segnale millimetrica. Si noti che uno dei segnali puntiformi si trova all'interno della Xist nuvola, mostrando così che il Xist nube è infatti la localizzazione lungo, e rivestimento cromosoma X. In più del 99% delle cellule, rileviamo usando il nostro protocollo un segnale DNA corretta (dati non mostrati). Rispetto a RNA-FISH, Xist nuvole visualizzate usando il DNA-RNA procedimento FISH combinata cerca volte più grande, come il DNA denaturato sembra occupare una superficie maggiore. Abbiamo obmantenute risultati simili usando cellule umane ES, linfociti umani e varie linee cellulari di fibroblasti di varie specie, e lo stesso protocollo è stato applicato per studiare l'espressione genica di vari loci X-linked, compresi Rnf12. Inoltre, quando questo protocollo è stato applicato a cellule ES femminili indifferenziata, espressione Xist basale da entrambi i cromosomi X trovato, il che dimostra che usano questo protocollo anche geni espressi a livelli bassi possono essere visualizzate (dati non mostrati).

Figura 1
Figura 1. Combined DNA-RNA FISH differenziate in cellule ES femminili. Rappresentante dei risultati ottenuti dopo il protocollo descritto nel presente documento combinato DNA-RNA FISH. Il cromosoma X (X cr.) Viene rilevato utilizzando una sonda BAC marcata con digossigenina, che viene visualizzata utilizzando anticorpi coniugati con FITC (segno verdeal). In quasi ogni cellula, vengono rilevati due cromosomi X. Xist RNA viene rilevata con una sonda cDNA marcato biotina, che è visualizzato utilizzando anticorpi coniugati con rodamina (segnale rosso). Vengono rilevati sia le grandi accumuli XIST sul cromosoma X inattivo (XIST nuvole) e l'espressione Xist basale dal cromosoma X attivo (puntini XIST) (nota: su differenziazione questa espressione Xist basale è cessata sul futuro attivo cromosoma X, e quindi non rilevato in ogni nucleo). I nuclei sono di contrasto con DAPI (blu). Barra della scala rappresenta 10 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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Discussion

Combinato DNA-RNA pesce può essere tecnicamente impegnativo, in quanto le condizioni adatte per FISH DNA può essere troppo duro per le molecole di RNA meno stabili. Diversi approcci sono stati applicati per studiare sia DNA e RNA nella stessa cella, aggirando la necessità di incubazione simultanea con sonde rilevando sia il DNA e RNA. Ad esempio, in un approccio di sovrapposizione, viene eseguita prima FISH RNA, e le cellule vengono esposte, e le coordinate sono prese. Successivamente, gli stessi vetrini verranno usati per FISH DNA, durante il quale si perde il segnale di RNA FISH. Dopo FISH DNA, le cellule vengono nuovamente esposte, e le immagini ottenute sia dal RNA e DNA FISH si sovrappongono. Sebbene questo approccio funziona in quasi tutti i casi, come il DNA di cellule fissate è stabile, e non è influenzato dal trattamento necessario per l'RNA FISH iniziale, questo è un approccio molto laborioso che costa almeno quattro giorni. In un altro approccio, prima viene eseguita la FISH RNA, il segnale FISH RNA è fissato mediante aggiunta ofissativi f, dopo di che si applica FISH DNA. Sebbene anche questo approccio può funzionare, una parte del segnale fluorescente derivato dalla RNA FISH può essere perso su di fissazione. Questo potrebbe ostacolare particolare la rivelazione di trascritti che sono espressi solo a un livello basso. L'approccio qui presentato è ottimizzato per la rilevazione simultanea di entrambi un RNA bersaglio ed un DNA bersaglio in un singolo esperimento di FISH, e ha il vantaggio che entrambi i risultati possono essere ottenuti in un singolo esperimento entro due giorni, con risultati affidabili.

Diversi passaggi nel protocollo FISH sono fondamentali per ottenere risultati ottimali. In primo luogo, quando si tratta di molecole di RNA, bisogna stare attenti a non introdurre RNAsi in alcun tampone o soluzione utilizzata. Quindi, dovrebbe essere istituito un ambiente di lavoro pulito, e puntali con filtro dovrebbe essere utilizzata quando i reagenti dispensazione utilizzati per FISH. Si deve prestare attenzione ad utilizzare i composti liberi RNasi (per esempio RNasi acqua libera, coltura cellulare grado PBS, assolutily etanolo puro, ecc.) Quando queste semplici regole vengano rispettate, non è generalmente necessario utilizzare inibitori RNasi supplementari integrate ai reagenti utilizzati. In secondo luogo, la procedura di permeabilizzazione utilizzando pepsina è un equilibrio delicato tra troppo poco, o troppo permeabilizzazione. A seconda del tipo di cellula specifico utilizzato, potrebbe essere richiesta per ottimizzare il tempo concesso per permeabilizzazione, o le concentrazioni pepsina. Quest'ultima dipende anche dalla vostra particolare lotto di pepsina, come l'attività può variare. In alternativa, permeabilizzazione utilizzando 0,1% Triton-X100/PBS per 5 min a risultati buoni risultati, in determinate condizioni, e ha il vantaggio che FISH utilizzando questo metodo di permeabilizzazione può essere combinato con immunocolorazione per rilevare le proteine ​​nucleari o citoplasmatiche. Come terzo aspetto importante della FISH, le temperature di invecchiamento, denaturazione, ibridazione e lavaggio deve essere mantenuta costante. Anche le piccole deviazioni dalla temperatura target possono provocare meno efficient denaturazione, ibridazione, o lavaggi meno stringenti, che si tradurrà in più la colorazione di fondo. In alternativa alla fase di invecchiamento 1 ora a 65 ° C seguita da denaturazione a 65 ° C per 2 min, anche una denaturazione iniziale a 80 ° C per 5 min, senza invecchiamento, può dare buoni risultati. Noi preferiamo il processo di invecchiamento, in quanto in generale questa procedura dà segnali FISH DNA più affidabili. Infine, alcuni sonde di DNA saranno così specifico, che non richiedono tre strati di anticorpi per il rilevamento sufficiente. Questo dovrebbe essere empiricamente per ogni sonda appena generato.

Anche se il protocollo attuale funziona robustamente nello studio di inattivazione del cromosoma X e rilevazione di Xist, rilevamento combinato di RNA e DNA potrebbe essere più complicato in altri contesti. Questo potrebbe essere il caso soprattutto quando la specie di RNA che si rivolge per essere rilevato è espresso solo a livelli molto bassi, è pieno di sequenze ripetute o è un relativamente brevetrascrizione. In queste situazioni, potrebbe essere piuttosto difficile progettare una sonda ottimale, che consentirà l'ibridazione efficiente per un limitato, non ottimale quantità disponibile di destinazione. In tali situazioni, forse vale la pena ottimizzare prime condizioni per l'RNA FISH. Diverse sonde alternative potrebbero essere processati, e la durata di etichettatura sonda di Nick-traduzione potrebbero essere titolati, per ottimizzare la quantità di apteni incorporati. Importante, è necessario verificare che l'RNA mirato è espresso nelle cellule da studiare, ad esempio, verificare l'espressione mediante RT-PCR. Anche quando si analizza un diverso tipo di cellule, è essenziale includere cellule in cui l'espressione precedentemente rilevati come controlli positivi, come questo potrebbe permettere la distinzione tra un, FISH correlato problema tecnico, o il semplice assenza di espressione nel nuovo tipo di cellule analizzate. Quando, nonostante espressione verificate, l'uso di varie sonde e ottimizzazione delle condizioni di etichettatura, RNA FISH fa nrisultato ot in un segnale chiaro, potrebbe essere opportuno modificare le condizioni di ibridazione, variando la quantità di formammide utilizzata, o la durata e la temperatura di ibridazione della sonda. In alternativa, le sonde oligonucleotidiche marcate direttamente potrebbero essere utilizzati 9-10. La stessa procedura di ottimizzazione possono essere successivamente applicati per migliorare FISH DNA, e il rilevamento simultaneo di DNA e RNA.

Utilizzando il protocollo FISH DNA-RNA combinato, siamo stati in grado di studiare inattivazione del cromosoma X nella differenziazione delle cellule staminali femminili. Risultati simili sono stati ottenuti nei nostri studi utilizzando diversi tipi di cellule ed embrioni, e stiamo attualmente ulteriormente ottimizzare le condizioni per applicare combinato FISH DNA-RNA su sezioni di tessuto. Come il ruolo importante di RNA non codificanti in molti processi biologici diventa sempre più apprezzata, si prevede che lo stesso protocollo può probabilmente essere usato per studiare altri RNA non codificanti nel contesto della loro cromatina specifico.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

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References

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DNA-RNA combinato fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) per studiare inattivazione del cromosoma X nelle cellule staminali embrionali di topo differenziata Femminile
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Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined … More

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

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