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Methodenartikel

Automatisierte Messung der Mikrozirkulation Blutflußgeschwindigkeit in Lungenmetastasen von Ratten

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DOI:

10.3791/51630

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30. November 2014

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1Division of Plastic, Maxillofacial, and Oral Surgery, Duke University Medical Center, 2Department of Radiation Oncology, Duke University Medical Center, 3Department of Cardiology, University of Colorado Denver, 4Department of Physical Chemistry, University of Mainz

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird eine Methode vorgestellt, um die mikrozirkulatorische Blutflussgeschwindigkeit bei Lungenkrebsmetastasen der Pleuraoberfläche bei Ratten automatisiert unter Verwendung der geschlossenen Lungen-Intravitalmikroskopie zu messen. Dieses Modell hat das Potenzial, als weit verbreitetes Werkzeug für die physiologische Forschung an Lungenmetastasen bei Nagetieren eingesetzt zu werden.

Zusammenfassung

Da die Lunge ein wichtiges Zielorgan für metastasierende Erkrankungen ist, sind Tiermodelle zur Untersuchung der Physiologie von Lungenmetastasen von großer Bedeutung. Bisher gibt es jedoch nur sehr wenige Methoden, um Lungenmetastasen dynamisch auf der Ebene der Mikrozirkulation zu untersuchen, da der Zugang zur Lunge mit einem Mikroskop schwierig ist. Hier wird eine intravitale Mikroskopiemethode vorgestellt, um die Mikrozirkulation von oberflächlichen Lungenmetastasen bei Ratten unter Verwendung eines geschlossenen Lungenfensters und einer automatisierten Analyse der Geschwindigkeit und Richtung des Blutflusses funktionell abzubilden und zu quantifizieren. Es wird gezeigt, dass diese Methode nützlich ist, um die Erhöhung der Blutflussgeschwindigkeit als Reaktion auf pharmakologische Interventionen zu messen und das bekannte gewundene Gefäßsystem solider Tumoren abzubilden. Dies ist die erste Demonstration der intravitalen Mikroskopie an Lungenmetastasen in einem geschlossenen Thoraxmodell. Aufgrund ihrer minimierten Invasivität sowie aufgrund ihrer relativen Leichtigkeit und Praktikabilität hat diese Technologie das Potenzial, in Laboratorien, die sich auf die Erforschung von Lungentumoren spezialisiert haben, weit verbreitet zu werden.

Einleitung

Die Lunge ist eines der wichtigsten Zielorgane für metastasierende Erkrankungen, und da dieser Zustand mit Chemo- und Strahlentherapie nur schwer erfolgreich zu behandeln ist, ist eine Heilung immer noch selten1,2. Spezifische pathophysiologische und mikrozirkulatorische Merkmale solider primärer und metastasierender Tumoren, wie mikroregionale Hypoxie, Diffusionslimitierung und ineffiziente Tumorgefäße, tragen wesentlich zu ihrer Resistenz gegenüber der Behandlung von Krebs bei3,4. Aufgrund der mikroskopischen Skala und der dynamischen Natur von Parametern wie dem mikrovaskulären Blutfluss ist die Intravitalmikroskopie des Tumors im lebenden Tier zu einem sehr wichtigen Forschungsinstrument auf diesem Gebiet geworden5. Während Intravitalmikroskopie-Modelle auf Tumoren in verschiedenen Organlokalisationen, einschließlich der metastasierten Lunge in einem offenen Brustkorb, angewendet wurden, wurde bisher kein Protokoll für die Erforschung von Lungenmetastasen in einer physiologisch erhaltenden, geschlossenen Brustumgebung entwickelt6,7. Ein solches Unterfangen wird insbesondere durch die Notwendigkeit erschwert, chirurgisch auf den Brustkorb zuzugreifen, ohne die Gesamtfunktion der Lungezu beeinträchtigen 7-9. Kürzlich wurde eine Methode eingeführt, mit der der pulmonale mikrozirkulatorische Blutfluss in einer engen Brustumgebung bei lebenden Ratten mit Hilfe der Intravital-Fluoreszenzmikroskopie10 abgebildet werden kann. Dieses Protokoll ermöglicht die systematische Quantifizierung der Blutflussgeschwindigkeit von injizierten, fluoreszenzmarkierten roten Blutkörperchen mittels computergestützter Analyse, während das Tier physiologisch stabil bleibt und die Integrität der Lunge erhaltenbleibt 11. In der vorliegenden Studie wird gezeigt, wie diese Technologie modifiziert werden kann, um den mikrozirkulatorischen Blutfluss in Schwanzvenen-inokulierten Lungenmetastasen auf der Pleuraoberfläche bei der immungeschwächten Ratte abzubilden und zu quantifizieren. Dieses Modell ist auch das erste, das metastasierende Lungentumoren in einer geschlossenen intravitalen Mikroskopie untersucht.

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Protokoll

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll beschriebenen tierbezogenen Verfahren sind zuvor von der Duke University Institutional Animal Care und Verwenden Committee (DUIACUC) genehmigt worden.

1. Cancer Cell, Kultur und Einspritzung

  1. Pflegen fluoreszenzmarkierten metastasiertem Krebszellen (zB menschliche MDAMB231-GFP-Brustkrebszellen, Geschenk von Dr. Patricia Steeg, NCI und YFP-markierten Maus-Sarkom-Zellen, Geschenk von Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, Abteilung für Radioonkologie) in geeigneten Kulturmedium (zB Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptavidin) bei 37 ° C, bis ca. 90% konfluent.
  2. Trypsinieren Zellen, waschen Sie sie 2-mal mit PBS, zählen, und dann spritzen sie in die Schwanzvenen von Isofluran betäubt 10 Wochen alte weibliche Nacktratten bei 5.000.000 Zellen pro Tier, mit einer Spritze mit einer 27 G-Nadel. Chirurgische Ebene anesthesIA wird durch das Fehlen einer Reaktion auf Zehenklemm verifiziert.

2. Überwachung von Metastasen Mit MicroCT

  1. Untersuchen Ratten einmal wöchentlich mit einem Mikro-CT / Mikro Irradiator, um das Vorhandensein von Metastasen über etwa 2 mm im Durchmesser im Durchmesser zu erfassen. Die Mikro-CT wird in Betrieb genommen, wie zuvor beschrieben 12.
    1. Betreff Ratten zu 3% Isofluran-Narkose vor der Bildgebung. Bestätigen tiefer Narkose durch toe Prise.
    2. Nach Beginn der Anästhesie, schnell Ratten übertragen, um die Abbildungsaufnahmevorrichtung in der Abbildungskammer und schließen über ein Nasenkegel auf eine Isofluran-Luft-Gemisch bei 2,5 bis 3%. Stellen Sie die Position der Ratte in der Wiege in einer Weise, die ihre Brustkorb wird in der Photonenstrahl der MicroCT Scanner positioniert, mit den externen Positionskontrollen und Lasertrennzeichen auf dem Imaging-Docking-Station. Stellen Sie sicher, die Tür zum Imaging-Kammer geschlossen ist, um die Ermittler von den Gammastrahlen abzuschirmen.
    3. Kontrollieren Sie die Position des Tieres wieder mitDie Farbvideokamera. Führen Sie eine niedrig auflösende CT-Bildgebung Testlauf, und verwenden Sie das resultierende Bild, um das Sichtfeld auf die xyz Abmessungen der Brusthöhle ein.
    4. Bild der Ratte Thorax mit einer 2 mm Al-Filter bei 40 kVp, 2,5 mA und 0,008 Voxel bei 7 FPS und senden Sie das Tier in seinen Käfig. Imaging von einem Tier sollte nicht mehr als 15 oder 20 Minuten dauern. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er wieder zu sich kam, um ausreichende Brustlage zu halten.
    5. Bestätigen Metastasen durch das Auftreten von relativ strahlenundurchlässige Objekte, die nicht durch intrathorakale Blutgefäße erklärt werden kann (1A)

3. Fenster Kammerchirurgie

  1. Anästhesie, Vitalzeichen und Schwanzvenenkatheter
    1. Wählen Tiere mit Vorhandensein von Metastasen. Injizieren Tieres mit einer intraperitonealen dose von 50 mg / kg Pentobarbital. Bestätigen Operationsebene Anästhesie durch toe Prise bevor Sie fortfahren.
      Hinweis: Anästhesie-Protokolle sollten auf den jeweiligen Versuchsaufbau angepasst werden. Pentobarbital wurde hier als ein lang wirkendes Narkosemittel gewählt, um die tiefe Narkose für langwierige Verfahren zu induzieren, und bietet die Möglichkeit, einfache Wieder Dosierung. , Ist der Verlust der Tiere eine Überdosierung ist jedoch ein allgemeines Problem mit Pentobarbital Narkose. Eine weitere Option, die autonomen Reflexe in einem größeren Ausmaß als Pentobarbital bewahrt wird Ketamin in Kombination mit Sedativa wie Xylazin oder Medetomidin, die jedoch erlaubt nur bei einem einzigen Wiederdosierungszyklus.
    2. Rasur Tiere auf der Seite des Körpers, die den metastatischen Krankheit hat, und im Halsbereich, mit einer Schermaschine. Wischen Sie alle verbleibenden losen Haare aus der Haut. Nach lose Haare entfernt wird, gelten Tier Salbe für die Augen, um sie vor dem Austrocknen zu schützen.
      HINWEIS: athymischen Nacktratten können Rest Haar, das requi habenres Entfernung vor mit chirurgischen Verfahren fortfahren. Es ist sehr wichtig, um alle Haare gründlich zu entfernen, wie es mit chirurgischen Verfahren und Bildgebung stören.
    3. Befestigen Sie das Tier in Rückenlage auf einer Metallplatte, die auf einem 37 ° C Wasserbad zirkuliert Heizkissen platziert wird. Die vorderen und hinteren Enden an der Platte mit Klebeband befestigt.
      HINWEIS: Es ist sinnvoll zu steuern und aufzeichnen Vitalfunktionen, wie Herzfrequenz und arterieller Sauerstoffsättigung des Blutes mit Hilfe eines Pulsoximeter, im gesamten chirurgischen und experimentellen Verfahren.
  2. Intubation
    1. Um einen Katheter zur Belüftung des behandelten Tieres, zuerst eine transversale zervikalen Hautinzision, gefolgt von der mittleren Trennung der Längsmuskulatur ventral der Trachea.
    2. Verwenden Sie ein wiederholtes Öffnen-to-Schließvorgang mit einem scharfen Zange, einen Durchgang für das Nahtmaterial durch die dorsale Seite der Luftröhre zu schaffen.
    3. Machen Sie einen kleinen Schnitt in die Luftröhre auf T-er ventralen Seite, nicht mehr als halbkreisförmige, etwa zwischen dem zweiten und dritten Trachealring. Lassen Sie eine ausreichend lange Teil der Luftröhre auf der dorsalen Oberfläche freigelegt, um die Fixierung des Luftröhrenkatheter zu ermöglichen.
    4. Legen Sie eine 2,5 bis 3,0 mm "Y" Trachealkanüle in die Luftröhre, und ziehen Sie sie mit einem 4-0 Monofilamentnaht. Sicherstellen, dass die Kanüle an eine druckgeregelte Ventilator mit einer Flasche zum Ablaufkanal, der mit 6 cm Wasser gefüllt ist verbunden, um positive Lungendruck aufrechtzuerhalten. Einströmende Gas sollte 100% Sauerstoff, es sei denn experimentell anders gewünscht.
    5. Legen eines Katheters mit einem 25-27 G Nadel und mit heparinisierter Kochsalzlösung gefüllt in eine der Schwanzvenen von Ratten, und befestigen mit Klebeband.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, Durchgängigkeit der Schwanzvenenkatheter während des gesamten Verfahrens durch mehrmaliges Einspritzen einer kleinen Menge heparinisierter Kochsalzlösung in die Schwanzvene. Auch oro-Intubation, dh die Führung eines LuftröhrenRohr über der Mündung des betäubten Tieres und an der Kehlkopf in die Luftröhre, ist eine mögliche Alternative zur Tracheotomie Verfahren, die hier beschrieben wird. Jedoch erfordert dieses Verfahren eine spezielle Ausbildung und Erfahrung, um eine Beschädigung der Luftröhre zu verhindern, und auch um die versehentliche Kanülierung der Speiseröhre zu verhindern.
  3. Die Anwendung der Lungenfenster
    1. Entfernen Sie die Haut von der Seite der Brust, wo der metastasierten Erkrankung befindet, indem Sie einen Schnitt, und dann Abtrennen der Haut mit stumpfer Präparation.
      Hinweis: Die Haut kann ausgeschnitten und entfernt im Anschluss an Ablösung werden
    2. Gehen Sie durch Sezieren der zwei Schichten überlagern Muskulatur (pectoralis, serratus und Latissimus), jedoch den Zwischenrippenmuskeln intakt. Erstellen einer Perforation in den Brustraum von ungefähr 1,5 cm im Durchmesser, durch Entfernen von Abschnitten der in der Regel zwei benachbarten Rippen. Idealerweise suchen Sie die Perforation in der Region des sechsten und siebten ribs.
    3. Osteotomie:
      1. Um Blutungen und Schäden an der Lungenoberfläche zu minimieren, fest halten die Rippe während des Schneidens mit einer Zahn chirurgische Zange geschnitten werden. Verwendung von chirurgischen Scheren, schneiden die mediale Seite des ersten Rippe unter einem Winkel von etwa 45 °, so dass die spitze Seite der verbleibenden Rippenknochen draußen zeigt.
      2. Anschließend schneiden die lateralen Seite der Rippenknochen in einer ähnlichen Weise wieder Verlassen der spitzen Seite der Rippenknochen nach außen zeigen, um Schäden an der Lungenoberfläche zu verhindern.
      3. Wiederholen Sie den Vorgang für die benachbarten Rippe, dann schneiden Sie die Zwischenrippenmuskeln und entfernen Sie das Stück herausgeschnitten. Während dieses Vorgangs halten Lungendruck in einer Weise, daß die mechanische Wechselwirkung zwischen der Lungenoberfläche und dem Brustkorb, minimiert. Tun Sie dies durch entsprechende Regelung Inspiration Druck auf den Ventilator.
    4. Einsetzen des Fensters:
      1. Legen Sie eine maßgeschneiderte Lungenfenster, bestehend aus einem Deckglas, das istauf einer Plexiglas Buchse (1B) befestigt ist. Befestigen des Fensters an der Buchse durch Kleben, oder durch Aufbringen einer sehr kleinen Menge an Vakuumfett. Legen Sie die Fenster so, dass Oberflächenmetastasen sind in der Nähe der Mitte des Fensters. Passen Sie bei Bedarf die eingelegte Loch, um die Mikrometastasen in die Mitte des Fensters durch eine Vergrößerung der Bohrung leicht auf der jeweiligen Seite zu bringen.
        HINWEIS: Metastasen auf der Pleuraoberfläche als deutlich erkennbare weiße Punkte oder Bereiche innerhalb der ansonsten rosa-lachsfarben gesunden Teile der Lungenoberfläche, die vorwiegend entlang der Risse erscheinen identifiziert werden. Während Mikro sich an anderen Bereichen der pleuralen außen auftreten, die untersuchten Zelllinien fast immer angezeigt Oberflächenmikrometastasen im perforierten Bereich, einmal Metastasen röntgenologisch festgestellt werden kann.
      2. Nach dem Einlegen der Buchse in die Perforation und das Erstellen direktem Kontakt mit der Pleura des lung, Naht die Kanten des Fensterrahmens an das umgebende Interkostalmuskel, unter Verwendung von 4,0 Monofilamentnahtmaterial (Abbildung 1C). Verwenden Sie einen leichten Anstieg der Inspiration Druck auf das Beatmungsgerät an Restluft zu helfen, zu entkommen und um eine Dichtung zu schaffen.
        Anmerkung: Die Atmungsrate von Ratten kann stark variieren, abhängig von dem Zustand der Anästhesie, Status der Erregung oder Angst, die Sauerstoffkonzentration des eingeatmeten Luft (FiO 2), usw. Es ist empfehlenswert, die Atmungsrate zwischen 70 und 90 bpm einzustellen. Die Inspiration Druck sollte mit Vorsicht eingestellt werden und nicht mehr als ca. eingestellt werden. 8 cm H 2 O (0,6 mmHg), um Schäden an der Lungenoberfläche zu vermeiden.
    5. Die Position des Tieres in einer speziell entworfenen Rückhalter dafür ausgelegt ist, Z-Richtungsbewegung (1D) auf einer Stahlplatte, die auf einem thermo (elektrische) Heizdecke positioniert zu beseitigen, unter einem Fluoreszenzmikroskop. Steuern Sie den Körper des TieresTemperatur unter Verwendung eines rektalen Thermistor. Passen die Schrauben des Tieres Rückhalter und der Inspirationsdruck an dem Beatmungsgerät eine optimale Steuerung der Querbewegung zu erzielen.
      Hinweis: Natürliche Atmung in Säugetieren umfasst alle drei Richtungen der Lungenbewegung und Brust-Erweiterung: bilaterale, dorsoventralen und kraniokaudale. Um den natürlichen Atembewegung so weit wie möglich zu erhalten, ist es wichtig, in Z-Richtung Kompression auf das notwendige Maß zu minimieren. Weil die Z-Dimensionszwang hat das Potential, um Artefakte, die den Blutfluss und andere Parameter beeinträchtigt, ist es ratsam, die Bedingungen während der Serie von wiederholten Messungen im gleichen Tier konstant zu halten.

4. Bildgebung und Messung von Mikrozirkulationsblutfluss

  1. Sammeln roter Blutkörperchen durch Herzpunktion und beschriften mit Dil (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 =, 3 = Tetramethyl-Indocarbocyanin Perchlorat), wie zuvor beschrieben 10.
  2. Injizieren 300 ul markierte rote Blutzellen in die Schwanzvene der Ratte vor der Fensterkammer Operation durchgeführt wird, um erste Durchgang Adhäsionseffekte das Glasfenster zu vermeiden. Beseitigen Sie alle Luftblasen in der Spritze oder eines Katheters, wie Einführung von Luft in die Vene werden weitere Injektionen zu hemmen.
  3. Bildblutung mit einem Mikroskop-CCD-Kamera bei -40ºC Chip Kühltemperatur und ungefähr 100facher Gesamtauflösung (dh mit einem 10x Mikroskopobjektiv und 10X vorgeKameraAugen). Verwenden Sie Standard-Rhodamin / TRITC Filtersätze (Anregung 450 bis 490 nm, Emission> 515 nm). Notieren Sie sich die tatsächliche Bildrate und Pixelauflösung der resultierenden Bildsequenzen. Nehmen Sie mindestens 200 (im Idealfall rund 300) Bilder pro Stapel, erfolgreiche Analyse der Strömungsgeschwindigkeit zu gewährleisten.
  4. Aufzufüllen Fluidverlust in dem Tier durch Injektion von etwa 1 ml Salzlösung ip jeden hr.
    HINWEIS: Experimentelle Einstellungen, eine Intervention beinhalten, wie zBein Medikament, das die Blutströmungsgeschwindigkeit in einem Lungen Krebsmetastase ändert, erfordert die wiederholte Messungen der Blutströmungsgeschwindigkeit in der Lungenmetastasenkrebs. Für diesen erweiterten Experimenten, ist es wichtig, um das Tier mit ausreichend Flüssigkeit aufzufüllen.
  5. Euthanize die Tiere durch Infusion von 3 ml 3N KCl in die Schwanzvene
  6. Werten Sie die Bildstapeln mit Hilfe eines veröffentlichten öffentlich zugängliche Matlab-basierten Computer-Algorithmus, schaffen Strömungsgeschwindigkeit Graustufen- und Farb codierte Karten für alle Blutfluss Spuren 10,11. Anschließend werten die resultierenden Graustufenbilder unter Verwendung gewerblicher oder öffentlich zugängliche Bildanalyse-Software, wie zum Beispiel Bild J nach Schwellen off-Werte, die keine Bewegung der Blutzellen anzugeben, dh keine aktiven Gefäßsystem.

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Ergebnisse

Das Gefäßsystem in soliden Tumoren ist bekannt, dass von den normalen Blutversorgung signifikant und zeigt höhere Grade der Tortuosität und höhere intervaskulären Distanzen 13. Dementsprechend Blutfließspuren in der experimentellen Lungen Brustkrebs und Metastasen Sarkom unregelmäßige Formen und große intervaskulären Lücken (2A, unteren zwei Platten) im Vergleich zu der normalen pulmonalen Mikrozirkulation (2A, oberes Feld). In einer vorherigen Studie wurde die Fähigkeit des ...

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Diskussion

Es wird ein Modell vorgestellt, das möglich ist, Bild Veränderungen in der Mikrozirkulation Blutfluss und andere dynamische Prozesse in Lungenmetastasen von Ratten, mit Intravitalmikroskopie und Computerblutfluss-Analyse ist. Während andere Methoden gibt, um die Mikroskopie an exponierten Lunge in offenen Brustkorb von Nagetieren durchzuführen, ist auch dieses Modell die erste Bildlungenmetastasen durch eine Brustwand Perforation in einem geschlossenen Brust-Einstellung. Mit dieser Methode wird die Machbarkeit gezeigt, ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Der wissenschaftliche Rat von Dr. Timothy McMahon und Dr. Siqing Shan wird geschätzt. Die Referenten danken Dr. David Kirsch und Dr. Patricia Steeg für das großzügige Geschenk der fluoreszenzmarkierten Maussarkom- bzw. metastasierten MDAMB-231-Zellen. Diese Arbeit wurde teilweise von der U.S. Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Prime Award Nummer N66001-10-C-2134 und teilweise von der Abteilung für Radioonkologie des Duke University Medical Center finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Athyme NacktrattenCharles RiverStamm Code 316Weibliche 10 Wochen alte athyme Nacktratten
Mikro-CT/Mikro-Irradiator Precision X-ray Inc.Xrad 225CxVerwenden Sie MicroCT zum Nachweis von Metastasen
DiI (1,1=-Dioctadecyl-3,3,3=,3=-Tetramethyl-indocarbocyanin-perchlorat)Sigma Aldrich468495-100MGMischen Sie 100 μl gepackte rote Blutkörperchen mit 100 μl von 0,5 mg/ml DiI in 200 proof Ethanol, 2 ml 5%ige Dextroselösung in Wasser und füllen Sie bis zu einem Endvolumen von 10 ml mit Kochsalzlösung Nagetierbeatmungsgerät
Kent ScientificTOPO Beatmungsgerätfür KleintiereDas Gerät ist wichtig, um den positiven Lungendruck nach der Anwendung des Pneumothorax aufrechtzuerhalten
Zeiss Axioskop Fluoreszenzmikroskop aufrechtZeissAxioskopMikroskop für die intravitale Bildgebung
Andor CCD-Kamera AndoriXonEM 885CCD-Kamera für die Live-Bildgebung des Blutflusses
PulsoximeterStarrLifeMouseOxPulsoximeter
FluoreszenzmikroskopZeissAxioskopFluoreszenzmikroskop

Referenzen

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