Riechrezeptoraktivierungsmuster kodieren Geruch Identität, sondern der Mangel an veröffentlichten Daten zur Identifizierung Geruchsliganden für Säugetiergeruchsrezeptoren behindert die Entwicklung eines umfassenden Modells der Duftkodierung. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Hochdurchsatz-Identifizierung Geruchsrezeptorliganden und Quantifizierung der Rezeptoraktivierung zu erleichtern.
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Methodenartikel
Hochdurchsatz-Analyse von Säugetiergeruchsrezeptoren: Die Messung der Rezeptoraktivierung über Luciferaseaktivität
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Geruchsstoffe schaffen einzigartige und überlappenden Mustern von olfaktorischen Rezeptoraktivierung, so dass eine Familie von rund 1.000 Mäuse-und 400 menschliche Rezeptoren, um Tausende von Geruchsstoffen zu erkennen. Riechstoffliganden für weniger als 6% der menschlichen Rezeptoren 1-11 erschienen. Dieser Mangel an Daten zum Teil auf Schwierigkeiten funktionell exprimieren diese Rezeptoren in heterologen Systemen. Hier beschreiben wir eine Methode für die Mehrheit der olfaktorischen Rezeptorfamilie in Hana3A Zellen, gefolgt von Hochdurchsatz-Beurteilung der olfaktorischen Rezeptoraktivierung mit Hilfe eines Luciferase-Reporter-Assay zum Ausdruck. Dieser Test kann (1) Bildschirm-Panels von Geruchsstoffen gegen Platten von olfaktorischen Rezeptoren verwendet werden; (2) bestätigen Geruchs / Rezeptor-Interaktion über Dosis-Wirkungs-Kurven; und (3) Vergleich der Rezeptoraktivierung Niveaus unter Rezeptorvarianten. In unserem Beispieldaten wurden 328 Geruchsrezeptoren gegen 26 Geruchsstoffe untersucht. Riechstoff / Rezeptor-Paare mit unterschiedlichen Antwort-Werte waren AuswahlTed und in Dosis-Wirkungs-getestet. Diese Daten zeigen, dass ein Bildschirm ist eine wirksame Methode, um Geruchs / Rezeptor-Paare, die eine Dosis-Wirkungs-Experiment passieren wird, dh Rezeptoren, die einen echten Reaktion auf einen Duftstoff haben zu bereichern. Daher ist dieses Hochdurch Luciferase-Assay eine effektive Methode zur Geruchsrezeptoren, einen wesentlichen Schritt in Richtung eines Modells der Duftkodierung im Säugetierriechsystem charakterisieren.
Einleitung
Die Säugetierriechsystem hat die Fähigkeit, auf eine Vielzahl von Geruchsreize zu reagieren, so dass für den Nachweis und die Unterscheidung von Tausenden von Geruchsstoffen. Olfaktorischen Rezeptoren (OR) sind die molekularen Sensoren von den Riechzellen im Riechepithel 12 ausgedrückt. Säugetiergeruchserkennung erfolgt durch unterschiedliche Aktivierung von OR durch Geruchsstoffe, und die ODER-Gen-Familie ist umfangreich, mit rund 1.000 murinen und menschlichen Rezeptoren 400 12-16. Zurück funktionelle Analysen von OR in olfaktorischen Neuronen und in heterologen Zellen haben gezeigt, dass unterschiedliche Geruchsstoffe werden durch eindeutige ....
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Protokoll
1. Hana3A Kultur der Zellen
- Vorbereitung M10 Medium durch Hinzu Minimum Essential Medium (MEM) mit 10% (v / v) FBS.
- Kultur Wartung
- Pflegen Zellen in M10-Medien. HINWEIS: Die Expressionsvektoren für RTP1L, RTP2, REEP1 und G αolf verleihen Puromycinresistenz zu Hana3A Zellen, aber die Aufrechterhaltung der Zellen mit diesem Antibiotikum nicht wesentlich beeinflusst Testergebnisse.
- Subkultur in einem Verhältnis von 1:8 in 10 cm Schalen alle 2-3 Tage.
- Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2.
2. Plating Zellen für Transfektion
- Saugen Sie Medien aus ein....
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Ergebnisse
Eine primäre Bildschirm getestet OR 328 gegen 26 Gerüche in einer Konzentration von 100 uM. Diese Geruchskonzentration wurde gezeigt, dass ein großer Teil der ORs mit bekannten Liganden 10 effektiv aktivieren. Zunächst wurde normalisierte Luciferase-Aktivität durch Division der Glühwürmchen-Luciferase Lesung des Renilla-Luciferase Lesen berechnet. Als nächstes wurden als Baseline-Werte durch Subtrahieren der normalisierten Messwerte für die Luciferase keine Geruchskontrolle aus den normalisierten Luc.......
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Diskussion
Riechstoffidentität wird von Geruchsrezeptoraktivierungsmuster codiert, sondern Rezeptoraktivierungsmuster, einschließlich der Rezeptoren aktiviert werden und zu welchem Grad, für weniger als 6% der menschlichen Geruchsrezeptoren 1-11 bekannt. Anstrengungen zur Geruchsrezeptoren charakterisiert durch ihre arbeitsintensive Verfahren und Anwendbarkeit auf nur eine Teilmenge des olfaktorischen Rezeptorfamilie 17,23,24,33,34 beschränkt. Die Hana3A heterologe Expressionssystem unterstützt die robuste .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von DC013339 R01, R03 DC011373 und Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014 unterstützt. Ein Teil der Arbeit wurde mit dem Monell Chemosensorische Receptor Signaling Core unterstützt wird, die zum Teil durch Mittel aus dem NIH-NIDCD Kern Zuschuss P30 DC011735. Die Autoren danken C. Sezille für die Hilfe bei der Datenerhebung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Hana3A-Zellen | Matsunami-Labor erhältlich | ||
| RTP1S-pCI | Anfrage | ||
| erhältlich M3-R-pCI | Anfrage | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231< | a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (ohne Ca2+ und Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS |
| Trypsin (0,05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96-Well-PDL weiße/klare Platte | BD BioCoat | 356693 | Platten |
| Reagenz zur Lipidtransfektion: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly Luciferase Substrat, Firefly Luciferase Quencher/Renilla Luciferase Substrat: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2 |
| Mikroplatten-Reader-Software: Gen5 Datenanalyse-Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300 μ l GripTips | Integra | 4433< | a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips |
| 12.5 μ l GripTips | Integra | 4414< | a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips |
| >300 μ l GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433< | a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ Spitzen |
| 12.5 μ l GripTips 384 XYZ | Integra | 6403< | a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ Spitzen |
| >384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE | Puffer Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en& region=US">DMSO |
| Forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010< | a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FÜR |
Referenzen
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (199....
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Nachdrucke und Genehmigungen
