Ein Ex-vivo- Kultur-System, um Schilddrüsenentwicklungsstudie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Sezieren von embryonalen Schilddrüsenanlagen der Maus und die Kultur von Explantaten auf halbporösen Filtern oder auf Mikroskopie-Kunststoffobjektträgern. Dieses System ist ideal für die Untersuchung morphogenetischer oder Differenzierungsereignisse, die während der Schilddrüsenentwicklung von Wildtyp- oder Knockout-Embryonen auftreten, und eignet sich für Funktionsgewinn- und -verlustexperimente.

Zusammenfassung

Die Schilddrüse ist eine endokrine Drüse bilobated an der Basis des Halses lokalisiert ist, die Herstellung der Schilddrüsenhormone T3, T4 und Calcitonin. T3 und T4 werden durch differenzierte Thyreozyten, in geschlossenen Bereichen genannt Follikel organisiert produziert, während Calcitonin wird von C-Zellen, zwischen den Follikel und ein dichtes Netz von Blutkapillaren durchsetzt synthetisiert. Obwohl erwachsenen Schilddrüsen Architektur und Funktionen sind ausführlich beschrieben und untersucht, ist die Bildung der "Angio-follikuläre"-Einheiten, die Verteilung der C-Zellen im Parenchym und den parakrinen Kommunikationen zwischen Epithel-und Endothelzellen bei weitem noch nicht verstanden.

Diese Methode beschreibt die aufeinanderfolgenden Schritte embryonalen Maus-anlagen Schilddrüsen Dissektion und seine Kultur auf semiporöse Filter oder Mikroskopie Kunststoff-Objektträger. Innerhalb einer Frist von vier Tagen treu rekapituliert diese Kultursystem in vivo Schilddrüsenentwicklung. In der Tat, (i) Mrd.obation der Orgel auftritt (E12.5 Explantate), (ii) Thyrozyten Vorstufen in Follikel zu organisieren und zu polarisieren, (iii) Thyrozyten und C-Zellen differenzieren, und (iv) in der mikrodissezierten Gewebe vermehren vorhanden Endothelzellen, wandern in die Schilddrüsenlappen, und eine enge Verbindung mit den Epithelzellen, wie sie in vivo zu tun.

Schilddrüsengewebe von Wildtyp-Knockout-oder Fluoreszenz transgenen Embryonen gewonnen werden. Außerdem Explantate Kultur durch Zugabe von Inhibitoren manipuliert werden blockierende Antikörper, Wachstumsfaktoren oder Zellen oder konditioniertes Medium. Ex-vivo-Entwicklung in Echtzeit analysiert werden, oder zu jeder Zeit des Kultur durch Immunfärbung und RT-qPCR.

Abschließend Schilddrüsen Explantatkultur kombiniert mit nachgeschalteter Vollmontage oder auf Abschnitte Imaging-und Genexpressionsprofilen bietet ein leistungsfähiges System für die Manipulation und das Studium morphogenetischen Ereignisse und Differenzierung von Schilddrüsen organogenesis.

Einleitung

Die Schilddrüse ist eine Sammlung von unabhängigen epithelialen Kugeln, genannt Follikel, von einem dichten Netz von endothelialen Kapillaren umgeben. Diese Organisation ermöglicht die Funktion der Schilddrüse: endothelialen Kapillaren bieten Thyrozyten mit Jod, für T3-und T4-Hormon-Synthese benötigt und verteilen die letzteren auf den gesamten Körper. Zwischen den Follikeln und Kapillaren verstreut, C-Zellen produzieren das Hormon Calcitonin hypocalcämische ^ein. Obwohl Erwachsenen Schilddrüsen Architektur und Funktionen bekannt sind, sind die zellulären und molekularen Mechanismen der Schilddrüsen embryonalen Entwicklung (Follikel Bildung und Differenzierung) beteiligt lange nicht verstanden.

Während der Embryogenese Thyrozyten Vorläufer stammt als Verdickungs (die Mittellinie anlage) der ventralen Wand des Vorderdarmes Entoderm an embryonalen Tag (e) 8,5 im Maus-Embryo, während die C-Zellen Vorläuferzellen entstehen an E11.5 als tropfenförmigen Vorsprünge ( die ultimobranchialen bostirbt) der vierten Schlundtasche ^2-6. Die Mittellinie Knospe steht dann aus dem Endoderm, dehnt bilateral an E13.5 den ultimobranchialen Körper auf jeder Seite der Luftröhre zu verschmelzen. Schließlich Thyrozyten in Follikel organisieren und C-Zellen zu differenzieren.

Aktuelle Erkenntnisse über die Bildung der Schilddrüse kommt hauptsächlich aus histologische Analyse von festen Geweben, aber die morphogenetischen Ereignisse in der Schilddrüse Bildung beteiligt sind sehr dynamisch und beinhalten Kommunikation und Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen und mit der extrazellulären Matrix. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass thyrocyte Vorläuferzellen produzieren hohe VEGF an Endothelzellen auf die Entwicklung der Schilddrüse zu rekrutieren, und wiederum rekrutiert Endothelzellen zu fördern Follikel Bildung und C-Zellen Differenzierung ^7.

Die meisten Ex-vivo-Studien an der Schilddrüse haben auf isolierte Erwachsenen Schilddrüsen-abgeleiteten Zellen entweder auf 2D-Gewebekultur-Plastik d durchgeführt wurde, gewachsenPfarreien oder in 3D-Matrizen. Mit dieser Art von Kulturen, differenzierten follikulären Zellen entweder bleiben polarisiert und als Follikel organisiert oder Wiedererlangung einer 3D-Organisation ^8-10. Allerdings sind diese reinen Epithelzellen, aus ihrer physiologischen Umgebung explantiert und in 2D kultiviert, ignorieren Interaktionen mit der extrazellulären Matrix, Zytokine, Wachstumsfaktoren und anderen Zelltypen, wie die Endothel-oder Nerven-Zellen, die sie normalerweise in vivo auftreten. Eine sehr schöne Studie kürzlich eine Differenzierungsprotokoll von ES-Zellen in der Schilddrüse Follikel mit einem abschließenden Kulturschritt in 3D Matrigel ^11. Allerdings sind diese 3D-Kulturen fehlen Kontakt mit anderen Zelltypen.

Basierend auf früheren Fachwissen auf Pankreas-und Speicheldrüsen-Organkultur ^12-14, ein Verfahren zum Präparieren von embryonalen Maus Schilddrüsen anlagen und Kultivierung der Explantate auf semiporösen Filtern oder Kunststoff-Objektträger für die Mikroskopie entwickelt.

WannArbeiten mit E12.5 Embryonen, die doppelte Herkunft der Schilddrüse anlagen (die Mittellinie anlage und die beiden seitlichen ultimobranchialen Körper) verhängten die Mikrodissektion eines großen Fragments von Gewebe. Dieser enthielt die Luftröhre, aber nicht die Speiseröhre und der Pharyngealbogen Arterien bis zum arytenoid Schwellung verlängert. Wenn auf Filtern kultiviert, erstreckt sich die Mittellinie Anlage seitlich an jeder Seite der Luftröhre, wo sie verschmelzen mit den ultimobranchialen Einrichtungen, um die beiden Schilddrüsenlappen, noch durch einen schmalen Isthmus verbunden sind, bilden.

In der Kultur-, Epithel-Zellen vermehren, organisieren in Follikel und differenzieren sich in Thyrozyten und C-Zellen, je nach Herkunft. Endothelzellen in der mikrodissezierten Gewebe enthielt auch vermehren und dringen in die Schilddrüsenlappen, um schließlich in eine enge Verbindung mit der epithelialen follikulären Struktur, unabhängig von den Blutfluss oder zirkulierende Faktoren. Da die Entwicklung der Explantate treu rekapituliert in vivo entwickelnment, ist dieses Kultursystem optimal und Differenzierung morphogenetischen Ereignisse während der Entwicklung der Schilddrüse auftreten studieren.

Schilddrüsengewebe von Wildtyp-Knockout-oder Fluoreszenz transgenen Embryonen gewonnen werden, und die Kultursystem zugänglich ist Verlust-und Gain-of-function-Experimente. Schließlich könnte Zeitraffer-Imaging von fluoreszenzmarkierten Schilddrüsen Explantate auf Mikroskopie Plastikschalen genutzt werden, um besser zu untersuchen, die Kinetik und die Kontinuität der morphogenetischen Bewegungen, die in vivo auftreten. Zeitraffer-Bildgebung hat bereits zur Verzweigung Morphogenese der Bauchspeicheldrüse oder ^15,16 Ureterknospe ¹⁷ studieren.

Protokoll

Mäuse wurden gemäß den Prinzipien der Labortierpflege von der University Animal Welfare Committee angehoben und behandelt. Alle Verfahren und Protokolle wurden von diesem Ausschuss genehmigt.

1. Beschichtung von Kunststoff-Mikroskopie Kultur Chambers

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube. Die zwei Arten von Beschichtungs funktionell äquivalent sind.

1. Coat Kunststoff Kulturkammern mit Fibronektin einen Tag vor der Isolierung von Schilddrüsengewebe:
   1. Verdünnte sterile Fibronektin zu einer 50 ug / ml Endkonzentration in M199-Medium mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 0,25 ug / ml Fungizon und 2 mM Glutamin, ¹² ergänzt.
   2. Die Vertiefungen mit 200 ul verdünnt Fibronektin und Inkubation über Nacht in einem 4 ° C Kühlschrank.
   3. Am Tag der Präparation absaugen Fibronektin, spülen Sie die Vertiefungen einmal mit M199 und fügen ein minimales Volumen von 200 ul M199 mit Antibiotika, Glutamin und 10% fötalem Kälberserum ergänzt.
   4. Lassen Sie die beschichtete Kammern in den Inkubator, bis bereit, die Explantate plattieren.
2. Coat Kunststoff Kulturkammern mit Typ-I-Kollagen 2 h vor der Isolierung von Schilddrüsengewebe:
   1. Verdünnte sterile Kollagen Typ I zu 50 ug / ml Endkonzentration in 10 mM HCl. HINWEIS: Halten Kollagen-Stammlösung auf Eis.
   2. Die Vertiefungen mit 200 ul verdünnt Kollagen Typ I und Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur (RT).
   3. Saugen Sie den Typ-I-Kollagen-Lösung, spülen Sie die Vertiefungen einmal mit M199 und fügen Sie ein Mindestvolumen von 200 ul M199 mit Antibiotika, Glutamin und 10% fetales Kälberserum.
   4. Lassen Sie die beschichtete Kammern in den Inkubator, bis bereit, die Explantate plattieren.

2. Präparation der Schilddrüse Anlagen haltigen Gewebe (E12.5) oder Schilddrüsenlappen (E13.5-e14.5)

HINWEIS: Verwenden Sie saubere Präparationswerkzeuge und Petri / Kulturplatten. Die allgemeinen Schritte und Einschnitte unten beschrieben sind bei E12.5 und E14.5 Embryonen.

1. Sacrifice timed-schwangeren weiblichen Mäusen in der gewünschten embryonalen (e) Tag (von E12.5 bis E14.5) lösen und die Gebärmutter mit Präparierinstrumenten.
2. Legen Sie die seziert Gebärmutter in einer 10 cm-Platte mit HBSS.
3. Halten Sie ein Ende der Gebärmutter mit einer Pinzette und öffnen die Gebärmutter mit einer kleinen Schere schrittweise befreien alle Embryonen.
4. Trennen Sie die Embryonen aus der Plazenta mit der Schere und die Übertragung der Embryonen mit ihren extra Membranen in eine neue 10 cm-Platte mit HBSS.
5. Entfernen Sie den Dottersack und Amnion. HINWEIS: Ab diesem Punkt arbeiten unter einem Stereomikroskop mit Durchleuchtung von unten; zunehmender Vergrößerung mit Dissektion Schritte. Verwenden Wolfram Nadeln in Glaskapillaren als Sezieren Werkzeuge.
6. Mit den Nadeln wieein Messer und Gabel, entfernen Sie den oberen Teil des Kopfes, einschließlich der Oberkiefer und den Ohren (Abbildung 1A, entlang einer Schnitt).
7. Halten Sie den Embryo auf den Rücken und entfernen Sie zunächst eine zusätzliche Stück des Neuralrohr (1A, zusammen geschnitten b), dann wird der untere Teil des Embryos, nur unter den vorderen Gliedmaßen und über dem Herzen (Abbildung 1B).
8. Übertragen Sie die Scheibe, die den Embryo Zunge (um das Gewebe zu orientieren)-Hals-Bereich in eine neue 10 cm-Platte mit HBSS.
9. Entfernen Sie das Neuralrohr und Gewebe hinter der Speiseröhre / Luftröhre (1C, entlang einer Schnitt).
10. Sanft Abschnitt der Gewebeschnitt entlang beider Seiten der Zunge (1C, entlang b und b 'schneiden).
11. Suchen Sie die Speiseröhre und Luftröhre, in der Verlängerung der Zunge, und sezieren entfernt die Zunge, so dass die Ary-Schwellung (1D, zusammen ein Schnitt), und das Gewebe auf Both Seiten der Speiseröhre / Luftröhre (1D, entlang b und b 'schneiden).
12. Entfernen Sie die Speiseröhre, die Luftröhre und legen mit ihrer Bauchseite nach oben ein.
13. Sezieren die unerwünschten Geweben wie der Thymus (Fig. 1E) und alle seitlich zu den Schlundbogenarterien Gewebe. Für E13.5 E14.5 Embryonen oder, visualisieren die Schilddrüsenlappen auf jeder Seite der Luftröhre (1F, rot gestrichelte Linien) und weiter sezieren die Lappen aus der Luftröhre.
14. Übertragen Sie die Luftröhre getrennt E12.5 Region oder die E13.5-E14.5 Schilddrüsenlappen in eine 35 mm Kulturplatte, die vorgewärmten M199-Medium mit Antibiotika, Glutamin und 10% fetales Kälberserum. Übertragen Explantate mit einem feuchtFilterSpitze auf einem P-200-Mikropipette. Für E12.5 Explantate, schneiden Sie das Ende der Spitze, um die Öffnung zu erweitern. HINWEIS: Routinemäßig und wenn Embryonen haben den gleichen Genotyp, führen Sie die Schritte 6 und 7 auf alle Embryonen, dien 9-11, und schließlich 12 und 13.

3. Überzug und Kultur der Schilddrüse Explantate

1. Waschen der Explantate durch aufeinanderfolgende Übertragung in drei Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen, die 1 ml vorgewärmtes Kulturmedium (M199 = mit Antibiotika, Glutamin und 10% fötalem Kälberserum).
2. Überzug von Schilddrüsenlappen auf beschichteten Kunststoffmikroskopie Kulturkammern:
   1. Saugen M199 Kulturmedium aus den beschichteten Kammern.
   2. Vorsichtig, übertragen Sie die Schilddrüse Explantate in die Kulturkammern mit einer Mikropipette und Filterspitzen. Legen Sie eine Explantation in der Mitte der jeweiligen Kammer.
   3. Entfernen überschüssigen Medium und legen die Kulturkammer in einem Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO ₂₎ 2 Stunden lang die Explantate heften sich an die Matrix zu lassen.
   4. Vorsichtig, um jede weitere 200 bis 300 ul vorgewärmtes Kulturmedium auch.
   5. Inkubieren einer Langzeitkultur in der Gewebekultur-Inkubator.
3. Plating of Luftröhre Region oder Schilddrüsenlappen auf semiporöse Filter:
   1. Bitte geben Sie die Anzahl der Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 330 ul vorgewärmtes Kulturmedium erforderlich.
   2. Platz Filter (zB 0,4 um Millipore-Filter) auf dem Medium, kümmert sich um das Einfangen von Luftblasen unter der Kultur-Filter zu vermeiden.
   3. Vorsichtig mit einer Mikropipette und Filterspitzen, übertragen Sie die Schilddrüse Explantate mit einem minimalen Volumen des Mediums auf die Mitte der Filter (maximal 4/filter).
   4. Entfernen Sie das überschüssige Medium und Raum aus den Explantaten mit einer Wolfram-Nadel.
   5. Inkubieren einer Langzeitkultur in der Gewebekultur-Inkubator. HINWEIS: Ändern Kulturmedium jeden zweiten Tag unter der Sterilbank. Kultur die Explantate bis zu 7 Tage.

4. Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Färbung Protokoll für Schilddrüsen-Explantate

Verdrängen Explantate auf Filter gewachsen (nach Schritt 2 unten) unter Verwendung von Wolfram Nadeln oderfeinen Pinzette und Transfer in einer 24-Well-Platte für alle Schritte mit Ausnahme des primären (Schritt 5) und sekundäre (Schritt 7) Antikörperinkubationen (96-Well-Platte). Für haft Explantate auf Kunststoffmikroskopie Kammern kultiviert, führen Sie alle Schritte in den Kulturräumen.

1. Saugen M199 Kulturmedium und fixieren Sie die Explantation mit eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min (500 ul in 24-Well-Schale und 300 ul in der Mikroskopie Dias).
2. Waschen 2x 10 min in Tris-gepufferter Salzlösung mit Triton (TBST, 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100) bei RT.
3. Verarbeiten Sie die Explantate sofort oder bei -20 ° C HINWEIS: Für die langfristige Lagerung bei -20 ° C, trocknen die Explantate in Methanol mit allmählich zunehmender Methanolkonzentration in TBST bis 100% Methanol zu erreichen. Wenn Sie bereit sind, mit der Immunfärbung (Schritt 4) weiter, Rehydrierung der Explantate indem allmählich TBST zu Methanol.
4. TBST Ersetzen mit der Blockierungslösung (10% normalem Ziegenserum in TBST) Und Inkubation auf einem Meer-Säge Wippe für 30-60 min bei RT.
5. Primäre Antikörper verdünnt in Blocking-Lösung (100-200 ul pro Bedingung). Übertragen Sie die "Filter"-Explantate von einer 24-Well-Platte auf eine 96-Well-Platte. Explantate Inkubation mit den primären Antikörpern auf einem Meer-Säge Wippe über Nacht bei 4 ° C
6. Am nächsten Tag, verwerfen Sie den primären Antikörperlösung, übertragen Sie die "Filter" Explantate zurück in eine 24-Well-Platte, und waschen Sie mindestens fünf Mal mit TBST auf einem Meer-Säge Rocker für jeden bei RT 45-60 min.
7. Verdünnen sekundären Antikörper (zB Ziege anti-X-Alexa Fluor bei 1:2000 Verdünnung) in TBST mit 1% normalem Ziegenserum und Inkubation der Explantate mit dieser Verdünnung über Nacht auf einem Meer-Säge Wippe bei 4 ° C und in der Dunkelheit. Für die Kerngegenfärbung umfassen 1 ug / ml Bisbenzimid (Hoechst) zusammen mit dem sekundären Antikörper-Lösung.
8. Am nächsten Tag, entsorgen Sie die Sekundärantikörperlösung und waschen 5x mit TBST auf einem Meer-SägeWippe für jeden bei RT 45-60 min. In den Waschanlagen, halten die Explantate in der Dunkelheit.
9. Führen Sie eine zusätzliche Wasch in TBST vorsichtiges Schwenken über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln.
10. Postfix die immun Explantate in 4% PFA bei 4 ° C für 10 min.
11. Waschen Sie 2x 10 min mit TBST.
12. Transfer der Explantate allmählich entweder in 100% Methanol für die langfristige Lagerung bei -20 ° C oder unmittelbar zu analysieren. Für Explantate auf Filtern kultiviert und in einer 24-Well-Platte immun, Transfer in einer Kammer Mikroskopie (zB LabTek oder ibidi) mit TBST oder besser Leuchtstoffmontagemedium vor der Analyse mit einem Multiphotonen-oder konfokalen Mikroskop.

5. Extraktion von RNA aus Schilddrüse

Arbeiten Sie in einem RNase-freien Umgebung. Verwenden Sie daher Nukleinsäure und nucleasefreiem Pipettenspitzen und reinigen sowohl Bank und Ausrüstung von Verunreinigungen und RNasen. Dieses Protokoll auf Phenol / Chloroform-Basis, führen Sie den ersten Schritts (1 bis 7) unter einer chemischen Haube.

1. Homogenisieren ein Schilddrüsen Explantat oder zwei Schilddrüsenlappen mit 300 ul RNA-Extraktionslösung mit einem Einweg-Stößel für 1,5-ml-Tube. Zwischen Proben, waschen Sie den Stößel in 2% SDS, dann Wasser, dann mit Ethanol.
2. In weiteren 100 ul RNA-Extraktionslösung, Vortex 10 Sek. und Inkubation bei RT für 10 min.
3. Vortex für 30 Sekunden und mit 20 ng tRNA zu jeder Probe.
4. Vortex für 1 min und fügen Sie 80 ul Chloroform.
5. Vortex kräftig für 30 Sekunden inkubiert und 15 min bei RT.
6. Spin für 15 min bei 19.000 × g in einer gekühlten (4 º C) zentrifugiert.
7. Übertragen Sie sorgfältig die farblose obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen mit 20 ug Glykogen als Mitfällungsmittel.
8. Vortex und mit 200 ul von 100% Isopropanol Alkohol.
9. Vortex kräftig für 15-30 sec und lassen RNA-Präzipitat bei -20 º C für 2-3 Stunden oder bei -80 ° C für 1 Stunde.
10. Spin für 30 min bei 19.000× g bei 4 ° C, und beseitigen Überstand.
11. Waschen des Pellets mit 450 ul kaltem 75% Ethanol und Wirbel um das Pellet zu lösen.
12. Spin für 10 min bei 19.000 × g bei 4 ° C, und beseitigen Überstand.
13. Trocknen des Pellets unter der Haube 5 min.
14. Das Pellet mit 10 ul RNase-freies Wasser und Inkubation 10 min bei RT.
15. Assay-RNA-Konzentration, bei -80 ° C oder Reverse Transkription für die Genexpressionsanalyse.

Ergebnisse

Schilddrüsen anlages (Mittellinie und UB zusammen mit umgebenden Geweben) und Schilddrüsenlappen von E12.5 Maus-Embryonen und e13.5/e14.5, bzw. (1) präpariert. Nach einem Tag in Kultur auf Filter ist die Mittellinie Anlage sichtbar ist (Fig. 2A) als Spann auf der Oberseite der Luftröhre längliche Gewebe. Es bildet progressiv zwei Nocken an jeder Seite der Luftröhre. Wenn isoliert Schilddrüsenlappen (E13.5 oder E14.5) kultiviert werden, werden sie zu erweitern, unterziehen Morphogenese u...

Diskussion

Dieses Papier beschreibt ein Verfahren zum Präparieren und Kultivieren der Schilddrüse Explantate (E12.5) oder Lappen (E14.5), um zu studieren und ein besseres Verständnis der komplexen Ereignisse, die zur Bildung der Schilddrüse. Aufgrund der dualen Ursprungs der Schilddrüse Anlagen (die Mittellinie Anlage und die beiden seitlichen Körper ultimobranchialen) und ihrer geringen Größe, ein Fragment von E12.5 Gewebe lokalisiert rostral Schlundbogenarterien und die das Luft-, aber nicht die Speiseröhre mikrodissektiert wird...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
µ-slide 8 well, ibiTreat, Gewebekultur behandelt, steriles	Proxylab	80826
Kollagen Typ I, Rattenschwanz	Millipore	08-115
Fibronektin aus humanem Plasma	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Wolframdraht	Goodfellow	LS237450
Kulturplatteneinsatz (12 mm Durchmesser)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-Cadherin	BD Biosciences	610182	1/1.000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261