Method Article

Umfassende Analyse der Transkription von Gehirnproben Dynamics folgenden Verhaltens Experience

DOI:

10.3791/51642

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August 26th, 2014

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1The Alexander Silberman Institute of Life Sciences & Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences, The Hebrew University of Jerusalem

In This Article

Summary

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Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll, das ein umfassendes Profiling zur Analyse von Transkriptionsprogrammen anwendet, die in spezifischen Gehirnkernen von Nagetieren induziert werden, die Verhaltensparadigmen folgen. Hier wird dieser Ansatz im Zusammenhang mit der Profilierung von Genen, die im Nucleus accumbens (NAc) von Mäusen nach akuter Kokainexposition induziert werden, unter Verwendung von mikrofluidischen qPCR-Arrays veranschaulicht.

Abstract

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Die Codierung von Erfahrungen im Gehirn und der Konsolidierung von Langzeiterinnerungen hängen von Gen-Transkription. Identifikation der Funktion bestimmter Gene bei der Codierung Erfahrung ist eines der Hauptziele der molekularen Neurowissenschaften. Darüber hinaus ist die funktionale Vereinigung von definierten Genen, die mit spezifischen Verhaltensweisen hat Folgen für das Verständnis der Grundlage der neuropsychiatrischen Störungen. Induktion der Transkription robust Programmen im Gehirn von Mäusen nach verschiedenen Verhaltens Manipulationen beobachtet. Während einige genetische Elemente sind immer wieder nach verschiedenen Verhaltens Manipulationen und in verschiedenen Hirnkerne verwendet werden, sind Transkriptionsprogramme Gesamt einzigartig für die induzierende Stimuli und der Struktur, in der sie untersucht 1,2.

In dieser Veröffentlichung wird ein Protokoll für die robuste und umfassende Transkriptionsprofilierung aus Hirnkerne von Mäusen in Reaktion auf die Verhaltensmanipulation beschrieben. DieProtokoll im Rahmen der Analyse der Genexpression Dynamik im Nucleus accumbens nach akuter Kokain Erfahrung gezeigt. Im Anschluss an eine In-vivo-Erfahrung definiert, die Ziel neuronalen Gewebe seziert; gefolgt von RNA-Reinigung, reverse Transkription und Nutzung von mikrofluidischen Arrays für umfassende qPCR Analyse von mehreren Zielgenen. Dieses Protokoll wird zur umfassenden Analyse (Adressierung 50-500 Gene) zu begrenzen Mengen des Ausgangsmaterials, wie kleine Gehirnproben oder sogar einzelne Zellen ausgerichtet.

Das Protokoll ist für die parallele Analyse von mehreren Proben (zB Einzelzellen, dynamische Analyse folgenden pharmazeutischen, virale oder Verhaltensstörungen) am vorteilhaftesten. Doch das Protokoll könnte auch für die Charakterisierung und Qualitätssicherung der Proben vor der gesamten Genoms Studien dienen durch Microarrays oder RNAseq, sowie die Validierung von Daten aus Gesamtgenom-Studien.

Introduction

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Dynamische Organisation des Gehirns ermöglicht kognitive und Verhaltensflexibilität. Erfahrungen werden durch Modifikationen der Struktur und Festigkeit der Verbindungen zwischen Neuronen im Gehirn 3 kodiert. Diese "Erfahrung abhängige Plastizität" ist das Ergebnis der Induktion von spezifischen Mustern der Genexpression, die die notwendigen Proteine ​​enthält zur Modifikation der synaptischen Struktur und Festigkeit 4. Die Identifikation von Gen-regulatorischen Netzwerke der Vermittlung der Bildung von Langzeiterinnerungen ist ein zentraler Grundsatz der molekularen Neurowissenschaften, mit der Erwartung, dass die Identifizierung der dominierenden Elemente der Transkriptionsprogramme Einblick in die Grundprinzipien der Regulierung der Gedächtnisbildung sowie Ziele für bieten Behandlung von neurodegenerativen und neuropsychiatrischen Störungen. Transkriptionsprogramme entfalten in zeitlich definierten Wellen, die jeweils Gene kodieren unterschiedlichen Charakters, die für different Stufen der Umsetzung der Ergebnisse des Signalisierungsereignis 1,2. Es ist daher wichtig, Transkriptions Dynamik auf einer detaillierten Zeitskala anzugehen, um so das volle Komplement von Genen induziert identifizieren, und einen Einblick in die Potentialfunktion entsprechend der Dynamik der Induktion.

Drogenabhängigkeit ist eine robuste Form der Erfahrung abhängige Plastizität durch die lang anhaltende Wirkung von Drogen auf neuronale Schaltkreise im Gehirn verursacht 5,6. Initial, akute Exposition gegenüber Drogen, kann zur Entwicklung von Sucht und den Übergang zur chronischen Anwendung führen. Kontextinformationen ist ein wesentliches Element in der Entwicklung von Sucht. Drug-assoziierte Umweltreize sind von großer Bedeutung in den Köpfen der Drogenabhängigen zugeordnet. Kontextinformationen erinnert einen Drogenmissbrauch in der Vergangenheit Drogenerfahrung kann Rückfall in Drogenverlangen auslösen, auch nach längerer Abstinenz von Arzneimittelexposition 7,8.Daher die große Herausforderung in der klinischen Sucht - die Neigung zu Rückfällen von Süchtigen auch lange nach Entzugserscheinungen haben 9 nachgelassen.

Verhaltenssensibilisierung Kokain ist ein einfaches Modell von Kokain Erfahrung bei der Untersuchung von Mechanismen der Drogenabhängigkeit. In dieser weit untersuchten Modell für die langfristige Sensibilisierung durch chronische Exposition gegenüber Drogen induziert werden Nagetiere erste Kochsalzinjektionen (intraperitoneale; IP) gewöhnt in einer neuen Umgebung (einem offenen Feld Kammer, in der ihre Bewegungsaktivität wird überwacht) ; dann, tägliche Injektionen von Kokain erhalten sie in den offenen Bereich Kammern während ihrer Tätigkeit überwacht 10 (Abbildung 1). Diese Verhaltens Paradigma führt typischerweise zu einem robusten Sensibilisierung der Bewegungsverhalten (8-12 fach über Grundaktivität) 11, die für einen Zeitraum von Monaten nach Beendigung der Kokain-Injektionen erhalten bleibt, was die Bildung einer PERVasive Speicher Spur von Drogenerfahrung.

Die neuronalen Schaltkreise der Belohnung, natürlich bei der Verstärkung Verhalten wesentlich für den Erfolg einer Spezies (zB Fütterung, Geschlecht) beteiligt sind, wird von Drogenmissbrauch Drogen-assoziierten Verhaltensweisen verstärken 12,13 ausgebeutet. Die molekularen und zellulären Mechanismen, durch die Erfahrung von Drogen verbessert scheinen ähnlich zu den Mechanismen der Bildung von deklarativen oder semantische Speicher in anderen Gehirnstrukturen 14 zugrunde, sein. Daher ist die Robustheit des Verhaltenssensibilisierung Modell macht es zu einem attraktiven Modellsystem, um Mechanismen der erfahrungsabhängigen Plastizität zu studieren.

Die Nucleus accumbens (NAC) ist eine zentrale Integrator des Gehirns Lohn-Schaltung, und wurde ausgiebig mit der Entwicklung von Sucht 5,6 verbunden. Die Bildung von Sucht hängt Transkription neuer Proteine ​​in dem Nucleus accumbens und robustProduktion von klar strukturierten Transkription Programme ist in der folgenden NAc Kokain Erfahrung 15-19 beobachtet. Die akute Reaktion auf Kokain Transkriptions Gefahr besteht, dass auf mehreren Ebenen, um der starken Induktionsreiz anzupassen und die Produktion neuer Proteine ​​lenken Funktion, die sind für die strukturelle und elektrophysiologische Veränderungen durch die Einwirkung der Droge 6,19-22 induzierte verantwortlich.

Um die Untersuchung der molekularen Mechanismen der erfahrungsabhängige Plastizität im Gehirn zu fördern, ist ein Protokoll für die umfassende Analyse der Transkription Dynamik der Hirngewebeproben folgenden Verhaltensmanipulation beschrieben. Das Protokoll wird im Rahmen des Verhaltens Erfahrung studierte in den Citri Labor veranschaulicht - Verhaltens Sensibilisierung auf Kokain, Verwendung mikrofluidischen dynamische Arrays für die Transkriptionsanalyse. Das beschriebene Protokoll ist selbstverständlich nicht auf das Studium t begrenzter Nucleus accumbens im Rahmen von Verhaltenssensibilisierung, könnte aber zu einer Vielzahl von Verhaltensparadigmen und Hirnregionen aufgebracht werden. Tatsächlich könnte dieses Protokoll, um Körpergewebe außerhalb des Gehirns angewendet werden, und eine Vielzahl von Erfahrungen oder Manipulationen des Organismus untersucht.

Das Protokoll wird grob in vier Stufen unterteilt. Im ersten Schritt wird das Tier an den Verhaltensparadigma unterzogen; in der zweiten Stufe das Gewebe microdissected; im dritten Schritt - mRNA gereinigt, revers transkribiert und sondiert, und in einem letzten Schritt werden die Daten analysiert.

Im Rahmen der Untersuchung Transkriptionsdynamik, der genaue Zeitpunkt und die Definition der Erfahrung sind die wohl wichtigsten Versuchsparameter zu steuern. Aus diesem Grund ist, dass der Verhaltens Sensibilisierung auf Kokain, ein System, das hohe Niveau der Experimentator Steuerung ermöglicht über die Parameter der Erfah unsere Verhaltensmodell der Wahlce. Zusätzliche Verhaltensparadigmen, die präzises Timing aktivieren und sprechen verschiedene Modelle der erfahrungsabhängigen Plastizität oder Gedächtnisbildung zur Verfügung stehen. Diese Modelle sind mit Angst Anlage 23, akute Umweltanreicherung 24,25, Roman Objekt Exploration 26 und visuelles Erlebnis folgenden dunklen Aufzucht 27. Noch, Verhaltenssensibilisierung Kokain ist ein konsequent robuste Verhaltensmanipulation, die Schaffung eines hochdurchdringende Gedächtnisspur, die für Monate nach Kokain Erfahrung dauert 28.

Das Gehirn wird geschnitten, gefolgt von einer manuellen Mikrodissektion des Nucleus accumbens. Es ist unsere Erfahrung, dass die manuelle Mikrodissektion aus schnell zubereitet Hirnschnitten bietet die zuverlässige und schnelle Methode der Extraktion der relevanten Verhaltens Paradigma Gewebe und mit der Erfahrung, die Grenzen des Gewebes deutlich werden und ohne weiteres zu erkennen. Alternativ könnte feine Scheiben prepar seinED, gefolgt von Laser-Mikrodissektion. Obwohl dieses Verfahren ermöglicht hoch definierten Abgrenzung des Bereichs von Interesse, es ist langsam (also zu riskieren, die labilen mRNA), mühsam und erfordert teure Spezialausrüstung (ein Mikroskop mit einem Laser-Capture-Einrichtung vorhanden ist). Die hier definierten Protokoll könnte auch auf Einzelzelltranskriptionsanalyse durch manuelle Aspiration von Zytoplasma der Zellen visuell identifiziert mit Patch-Pipetten 29 angepasst werden. Es ist wichtig zu beachten, dass das beschriebene Protokoll sieht eine Bevölkerung Durchschnitt, ist es sehr wahrscheinlich, dass in den meisten Fällen nur eine Subpopulation von Zellen innerhalb des Gewebes tatsächlich in Reaktion auf die Erfahrung beteiligt. Es ist von Interesse, um die Transkription in selektiver Weise aus bestimmten Zellpopulationen als Reaktion auf die Erfahrungen Profil, aber Diskussion dieser Ansätze ist, über den aktuellen Bereich.

Für die mRNA-Reinigung, Reverse-Transkription und qPCR Abfrage, das Gewebewird, indem es durch feine Nadeln, gefolgt von der Nutzung von kommerziell erhältlichen Kits gestört (für weitere Informationen siehe Tabelle 8). Die Wahl wird von Erfahrungen mit diesen Methoden, die zuverlässige Extraktion von hochwertigen RNA und robuste Ergebnisse von Downstream-Anwendungen zu gewährleisten informiert.

Während das Protokoll wird für die Hochdurchsatz-qPCR beschriebenen Verwendung dynamische Arrays können Proben für die Genexpression mittels Endpunkt-PCR, geringe Durch qPCR, Genexpression-Microarrays oder tiefe Sequenzierung untersucht werden. Die Präferenz für die Hochdurchsatz-qPCR unter Verwendung dynamischer Anordnungen ist aufgrund der Tatsache, dass die mRNA erhalten aus Hirnkernen folgenden Verhaltensparadigmen ist oft der begrenzende Mengen. Dynamische Arrays eine Plattform, die eine effiziente umfassende Analyse der Transkripte aus einer großen Anzahl von Proben parallel in einem einzigen Experiment ermöglicht. Nach der anfänglichen Erwerb des mikrofluidischen Systems (allgemein institutioneller purchase), sind Experimente relativ preiswert zu laufen. Nach dieser Analyse könnten weitere Abfrage der Proben durchgeführt unter Verwendung teurer Plattformen, um für neue Transkripte (von Microarrays oder RNAseq) mit den dynamischen Arrays eine umfassende Referenz für die Qualitätssicherung zu suchen. Schließlich ist für die Datenanalyse, Standardansätze genutzt. Konkrete Hinweise über Probleme, die auftreten können, werden in dem Text des Protokolls erörtert.

Dieses Protokoll ist für die Ermittler interessiert in einer gründlichen Untersuchung ihres Systems von Interesse, das Studium mehrere Bedingungen und Wiederholungen am besten geeignet. Das Protokoll ist auch am besten geeignet für die Ermittler, die bereits in (durch Microarray-Experimente oder RNAseq) auf einer Teilmenge von 50-500 Gene von Interesse, die sie interessiert sind Abfragen wiederholt geschliffen haben.

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Protocol

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HINWEIS: Das Protokoll folgt den Richtlinien der Tierpflege von der Hebräischen Universität in Jerusalem.

1. Herstellung von ACSF-Lösung

  1. Vorbereitung ACSF Lösung wie in Tabelle 1 beschrieben. Stellen L 1 in ddH 2 O (> 18 MOhm Reinheit), womit Osmolarität auf ~ 300 mOsm / l mit geeigneten Zusatz von Wasser oder NaCl.

2. Geräte und Zimmer Set Up

Die Ausrüstung für die Überwachung der Kokain-induzierten Bewegungsverhalten besteht in einem Verhalten Kammern (50 x 45 cm) mit einem inneren Lichtquelle, Ventilator und Kamera (oder Infrarot-Sensoren) verdrahtet und mit einer inneren Plexiglas-Box (30 x 30 cm), der in welche die Mäuse erlaubt, sich frei zu bewegen, während ihre Fortbewegung wird überwacht. Die Verhaltenstests sollte zwischen 1 h nach Lichter auf bis 1 Stunde vor dem Licht aus, auf einer regelmäßigen Licht / Dunkel-Zyklus durchgeführt werden. Die Tiere sollten konsequent zur gleichen Zeit jeden Tag trainiert werden.

  1. Verbinden Kamera oder Infrarotsystem, ein geeignetes System für die Überwachung und Aufzeichnung der Bewegungsverhalten der Mäuse.
  2. Reinigen Sie die Kammern nach jedem Versuch mit Desinfektionsmittel mit der Maus Anlage und / oder Geruch zu entfernen Reagenz, um Geruchs Cue Bias zu verhindern und um eine ordnungsgemäße Desinfektion zu gewährleisten.

WICHTIG: Beim Umgang mit den Mäusen ruhig, ruhig und vorsichtig sein.

3. Vorbereitung der Tiere

  1. Haus 5 C57BL6 männliche Mäuse (6-12 Wochen alt, ~ 25-35 g Gewicht) pro Käfig, in einem Zimmer mit einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus und den freien Zugang zu Nahrung und Wasser, nach den Normen und Anforderungen der lokalen Tier Care Committee Führung und Protokolle. Vor Beginn des Experiments, wiegen die Mäuse und melden die Daten. Kokain wird später nach dem Gewicht der Mäuse verabreicht.
  2. Übertragen Sie alle Käfige mit Mäusen in den Verhaltens Zimmer 30 Minuten vor Beginn der ersten Studie.
  3. Gewöhnen alle derMäuse im Experiment verwendet Experimentator Handhabung, Injektionen und Überwachen des Verhaltens Setup. Dies wird durch 3 aufeinanderfolgenden täglichen intraperitonealen Injektionen von 250 ul Kochsalzlösung, wie unten beschrieben, erreicht.
  4. Verwalten eine intraperitoneale Injektion von 250 ul Kochsalzlösung. Unmittelbar nach der Injektion, die Maus in einer Kammer, um das Verhalten der Bewegungsaktivität für 15 min überwachen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für 3 aufeinander folgenden Tagen, zur gleichen Stunde jeden Tag.
  5. Am vierten Tag, teilen die Mäuse in zwei Gruppen. Bereiten Sie eine Stammlösung von Kokain bei 2 mg / ml in Kochsalzlösung. Verabreichung einer einzigen Injektion von Kokain-Lösung (final 20 mg / kg) an die Versuchsgruppe entsprechend dem Gewicht der Maus (zB für eine 25 g-Maus - 250 ul injiziert, während eine 30 g Maus 300 ul zu erhalten). Kochsalzlösung verabreichen der Kontrollgruppe. Unmittelbar nach der Injektion, die Maus für 20 min in einem Verhalten Kammer zur Überwachung der Bewegungsaktivität (typicVerbündeter, werden die ersten 15 min überwacht).
  6. Nach der Kokain-Injektion, zu opfern die Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 1, 2, 4, 8 und 24 h nach der Injektion). Wichtig ist, stellen Sie sicher, dass die Referenz Mäuse (Zeitpunkt 0) wird jegliche Injektion an diesem Tag nicht zu empfangen. Wegen seiner Bedeutung, ist es unerlässlich, Wiederholungen der Referenzgruppe gehören.

4. Präparation des Nucleus accumbens

  1. Betäuben die Mäuse mit Isofluran zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der Kokain / Kochsalzlösung-Injektion. Isofluran ist direkt aus dem Raum abgelassen werden. Daher sollte das Verfahren in einem Laborabzug durchgeführt werden.
  2. Überwachung der Narkosetiefe durch die Prüfung der hintere Fuß Reflex. Pinch die Pfote, um einen Rückzugsreaktion durch das Tier hervorzurufen. Ein Tier, das einen Reflex zeigt nicht an einer chirurgischen Narkosetiefe und nicht in einem Zustand zu einschläfern.
  3. Extraktion des Gehirns:
    1. Euthanize die Maus durch Enthauptung.
    2. Entfernen Sie die Haut über der Mitte des Schädels und schneiden den Schädel mit einer scharfen Schere.
    3. Setzen Sie die Schere an der Stelle, wo das Rückenmark ins Gehirn gelangt (Foramen magnum) und machen zwei seitliche Schnitte.
    4. An der gleichen Stelle, machen Sie einen langen sagittalen Schnitt entlang der Pfeilnaht. Bei Erreichen des Riechkolbens, Klammer nach links und nach rechts.
    5. Mit einer Pinzette, entfernen Sie den Schädel sorgfältig, Greifen jeweils die Hälfte der Schädel fest und zog an der Seite, kümmert sich nicht um auf drücken oder das Gehirn schädigen.
    6. Entfernen Sie das Gehirn während Abtrennen der Hirnnerven durch die Verwendung eines umgedrehten Löffel Mikro Spachtel.
  4. Legen Sie das Gehirn in einer eiskalten ACSF-Lösung für 1-2 min zum Chillen und aushärten.
  5. Entfernen Gehirn aus dem ACSF, Wick überschüssige Flüssigkeit mit einem Papiertuch, erstellen Sie einen koronalen Schnitt zwischen dem Kleinhirn und dem Rest des Gehirns und kleben das Gehirn, mit dem rostralen Teil nach oben, auf die Vibratom Bühne.
  6. Schneiden NAC:
    1. Pflegen ACSF-Lösungen bei eiskalten Temperaturen in der Schneidekammer des Vibratom. Schnitt bei 200 um bis Nucleus accumbens (NAC) ist klar nach dem Paxinos und Franklin Maus-Gehirn-Atlas (ca. 1,8 mm vor Bregma identifiziert; achten Sie auf die Form des Corpus callosum, die Lage und die Form der vorderen Kommissur und die Ventrikel als auch die Gesamtmorphologie des Gehirns Abschnitt). An dieser Stelle legen Sie zwei 400 um Abschnitte, von denen der NAC seziert werden.
    2. Unter einem Stereoskop, verwenden Sie eine feine Klinge, um den NAC-Bereich von den Scheiben sezieren. Die Definition des NAC nach den Paxinos und Franklin Maus-Gehirn-Atlas, und konnte bequem in den entsprechenden Abschnitten von vier Schnelldurchläufe der Klinge auf das Gewebe seziert werden. (Abbildung 2).
    3. Zeigen NAc Abschnitte werden sofort in 900 ul Trizol Lyse-Reagenz in ein Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C bis zur RNA-extrAktion.

5. RNA-Extraktion und cDNA Reverse Transkription

  1. Auftauen der Röhrchen accumbens Kern mit Abschnitten in Trizol-Lyse-Reagenz bei Raumtemperatur und Homogenisierung des Lysats mit einer 1 ml Spritze mit 25 G Nadel verbunden ist, bis das Gewebe vollständig homogenisiert (mindestens 15-20 mal). Die ersten paar Runden sind schwierig und erfordern Schieben des Gewebes gegen die Wand des Rohrs, um es in kleine Stücke, die die Spitze der Nadel eintreten könnte brechen.
  2. Homogenisierung zu gewährleisten, pipettieren das Lysat in ein QIAshredder Mini-Spin-Säule und Zentrifuge bei 12.000 g für 1 min.
  3. Pipette das Lysat in neue Mikrozentrifugenröhrchen und Extrahieren der RNA nach den Angaben des Herstellers. Bewahren Sie die RNA bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  4. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Bioanalyzers oder gleichwertige Geräte analysieren Integrität und Qualität. Verwenden 100-500 ng RNA für jede Runde von cDNA-Vorbereitung mit rAndom Hexamer Primer.

6. Primer-Design und Primer Testing

  1. Auswahl guter Primer: Für ein optimales Primerpaar für die qPCR der mRNA-Transkripte, folgen diese Anforderungen (Abbildung 3):
    1. Design-Primer enthalten, nicht mehr als 17-28 Basen. Vermeiden-Wiederholungen, wie sie Mispriming fördern.
    2. Design von Primern mit Schmelztemperatur (T m) zwischen 56-68 ° C (optimal 60-64 ° C). Die T m innerhalb der Primerpaar sollte innerhalb von 1 ° C voneinander abweichen.
    3. Seien Sie sich bewusst, dass das Produkt Größe sollte idealerweise zwischen 80 und 150 bp sein.
    4. Sicherzustellen, dass zumindest einer der Primer umfasst eine Exon-Exon-Verbindungsstelle oder das Amplifikat enthält eine große Intron (Intron überspannende), um die Amplifikation von genomischen DNA-Verunreinigungen zu vermeiden.
    5. Verwenden Sie eine zuverlässige Software, basierend auf Primer3 (Beispiele siehe Tabelle 2), um Primer-Design zu verbessern.
  2. Testen des prIMers: Um die Spezifität und Effizienz der Primer zu gewährleisten, sollte eine Steuer qPCR Reaktion durchgeführt werden:
    1. Verwenden einer positiven Probe (enthaltend cDNA-Matrize für alle relevanten Primerpaare) und titriert die cDNA (zB acht dreifache Verdünnungen von einer Anfangskonzentration von ~ 10 ng) in zweifacher Parallelreaktionen. Gehören ein No-Template-Steuerung, die auf Verunreinigungen in den für die Reaktion verwendet Lösungen steuert.
    2. Berechnen Primereffizienz unter Verwendung der Formel: (10 (- 1 / Steigung) -1) x 100, so daß die Kurve der optimalen Neigung - 3.333 (= 10 (- 1 / 3.333) = 2) (Figur 4).
    3. Bestimmen die Spezifität der Amplifikation. Spezifische Amplifikation wird durch einen einzigen prominenten Peak gemeinsam für alle Schmelzkurven der Amplifikate nachgewiesen, während Off-Target-Amplifikation würde als eine offensichtliche Abweichung fr erscheintom die einzigen großen Höhepunkt.

7. qPCR-Analyse

  1. Vorverstärkung:
    1. Umfassende qPCR-Analyse auf parallelen Abfrage Begrenzungs Mengen von RNA mit einer Vielzahl von Primerpaaren basieren. Daher ist ein Schritt der Vorverstärkung wesentlich. In diesem Schritt wird die cDNA erfährt 14-18 Zyklen der Vorverstärkung mit einem Gemisch aller Primer, die für die Abfrage der Probe in der Zukunft (bis zu 800 Primerpaare) verwendet wird.
    2. Verdünnen alle Primer in TE (niedrige EDTA) bis 50 um für bestimmte Ziel Amplification (STA).
    3. Pool zusammen 1 ul Aliquots alle 50 uM Primer-Sets in der STA-Reaktion eingeschlossen werden, bis zu 800 Tests.
    4. Vorbereitung Vormischung und Proben für STA, wie in Tabelle 3 beschrieben. Ermöglichen Fehler durch Herstellen Mischung für 110% der Anzahl der Proben, die verstärkt werden müssen.
    5. Aliquoten 3,75 ul STA Pre-Mix für jede Probe. Fügen 1,25 ulcDNA zu jedem.
    6. Wirbel um die Reaktionen und Zentrifuge für 10 sec mischen.
    7. Legen Sie die STA Reaktionen in einem Thermocycler und Zyklus wie bei Tabelle 4 angegeben.
  2. Exonuklease I (ExoI) Behandlung:
    1. Verdünne die Exo I, wie in Tabelle 5 angegeben.
    2. Add 2 ul verdünnte ExoI (4 U / ul) zu je 5 ul STA Reaktion, Wirbel, Spin-Down (> 6.000 xg) und in einen Thermocycler bei 37 ° C für 30 min und dann bei 80 ° C für 15 min.
    3. Verdünne die Endprodukte auf eine geeignete Konzentration für den Test. Verwendung TE-Puffer (43 ul hinzufügen TE-Puffer auf die 7 ul TSA Probe).
    4. Die verdünnte STA Produkte bei -20 ° C oder sofort nutzen.
  3. Primer und Probe-Setup für qPCR:
    1. Vorbereitung der Proben, wie in Tabelle 6 gezeigt. Planen Mischung nach der für das Experiment ausgewählt Chip und Proben hinzufügen, wie angemessen.
    2. AgiTate Probenmix Lösungen für mindestens 20 Sekunden, und zentrifugieren (> 6000 × g) für wenigstens 30 Sekunden. Bereit Reaktionen können für kurze Zeit bei 4 ° C gelagert werden, bis der Chip zum Laden bereit.
    3. Vorbereitung der Assays, wie in Tabelle 7 beschrieben.
    4. Agitieren Testansatz für mindestens 20 Sekunden und Zentrifuge (> 6.000 xg) für mindestens 30 Sekunden zu drehen Sie alle Komponenten.
      WICHTIG: Vortex gründlich und Zentrifuge den Proben und Testlösungen vor dem Pipettieren in die Chip-Buchten. Andernfalls kann es zu einer Verringerung der Datenqualität führen.
      HINWEIS: Die Endkonzentration jedes Primers beträgt 5 um in den Einlaß und 500 nm in der endgültigen Reaktions.
  4. Grundieren und Laden der Dynamic Array IFC (Integrated Fluidic Circuit)-Chip. Die IFC-Chip verfügt über Einlässe für Proben und Assays, sowie bestimmte Einlässe (Akkumulatoren) für Steuerleitung Flüssigkeit (Mineralöl) verwendet, um die Mikrofluid-Kammern unter Druck (FiguWieder 4A).
    1. Injizieren Steuerleitung Flüssigkeit in jedem Akkumulator auf dem Chip.
    2. Entfernen Sie den blauen Schutzfolie von der Unterseite des Chips.
    3. Platzieren Sie den Chip in der entsprechenden IFC Controller (Controller MX für den 48.48 Dynamic Array IFC IFC Controller oder der HX für den 96.96 Dynamic Array IFC), dann führen Sie den Prime (113x) Skript für den 48.48 Dynamic Array IFC oder dem Prime (136x) Skript für die 96.96 Dynamic Array IFC, um prime dem Chip.
    4. Wenn das Skript fertig ist, entfernen Sie die grundierte Chip von der IFC Controller.
    5. Pipette 5 ul jeder Assay-Mischung und 5 ul jeder Probe Mix in ihren Einlässen.
    6. Bringen Sie den Chip an den IFC-Controller.
    7. Mit Hilfe der IFC-Controller-Software, führen Sie den Last Mix (113x) Skript für den 48.48 Dynamic Array IFC) oder laden Mix (136x) Skript für die 96.96 Dynamic Array IFC, die Proben und Assays in den Chip laden. Wenn die Last Mix Skript fertig ist, entfernen Sie die Lasted-Chip von der IFC Controller.
    8. Laden Sie den Chip auf dem Thermocycler, erstellen Sie eine neue Chip-Lauf (nach Herstellerrichtlinien), einschließlich Schmelzkurvenanalyse. Verwendung des Thermocycler-Software, dass die Reaktionskammern richtig erkannt, und die die Reaktion vollständig ablaufen.

8. Datenanalyse

  1. Qualitätssicherung: Um die Datenqualität zu sichern, prüfen die Qualität der Primer durch die Auseinandersetzung mit Verdünnungskurven (wie oben beschrieben). Überwachung der Spezifität der Amplifikation durch Betrachten der Schmelzkurven von Amplikons, sollten die Spitzen der optimal eng ausgerichtet werden 29.
  2. Visualisierung: Zur Visualisierung von großen Mengen von Daten, die von Hochdurchsatz-qPCR erhalten, erzeugt bedienende Software Heatmaps, in denen die Expression ist farblich gekennzeichnet durch Intensität. Darüber hinaus zeigen die Transkriptionsdynamik einzelner Gene als gesäumt Streudiagramme.
  3. Veröffentlichung: In Verlagsdie Genexpressionsergebnisse, ist es ratsam, die Richtlinien für die Veröffentlichung MIQE der quantitativen Echtzeit-PCR-Experimente folgen, detailliert die Mindestangaben, die für eine qPCR-Experiment berichtet, muss um seine Relevanz, Genauigkeit, korrekte Interpretation und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

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Results

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Die Qualität der durch die Anwendung dieses Protokolls erhaltenen Ergebnisse entscheidend, hängt von einer Anzahl von Parametern. Ordnungsgemäße Versuchsplanung in minimaler Störung der Versuchsmäuse, führen, so dass die Erfahrung getestet (in diesem Beispiel, daß der Kontakt mit Kokain) wird die dominierende Erfahrung in der jüngsten Vergangenheit ist, und daher wird in einem robusten und spezifische Transkriptions führen Programm. Abbildung 1 beschreibt den Versuchsplan für die Verhaltens Sensibilisie...

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Discussion

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Erfolgreiche Charakterisierung der Genexpression von Hirngewebe folgenden Verhaltensparadigmen ist abhängig von: 1) Sorgfältige Behandlung von Mäusen während der Verhaltens Paradigma; 2) Schnelle und präzise Präparation von Gewebe von Interesse; 3) RNA-Safe-Maßnahmen, um die Integrität der RNA zu gewährleisten; und 4) Sorgfältige Planung von Primern und experimentelle Layout sowie Präzision und Liebe zum Detail in der Vorbereitung für die qPCR-Analyse.

Das Ziel der beschriebenen Vorgehenswei...

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Disclosures

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Wir haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde durch den Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), den Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), den German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) und den Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201) finanziert. Erste Schritte im Projekt wurden durch ein AXA-Postdoktorandenstipendium für AC finanziert. Wir danken den großzügigen Startkapitalern, die vom Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences zur Verfügung gestellt werden.

Kritische Lektüre durch Mitglieder des Citri-Labors wird sehr geschätzt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
VirusolOriek MedicalJ29D
Isofluran, USP 100%MINRAD INCNDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini KitQIAGEN73404
QIAshredderQIAGEN79654
cDNA Reverse Transkriptionskit mit hoher KapazitätInvitrogenAB-4368814
TE PufferInvitrogen1355656
Verhaltenskammer (MDF; 50 x 45 cm)Selbstmontierte
innere Plexiglasbox (30 x 30 cm)Selbstmontierte
Kamera und VideorecorderCampden Inst.CMD-80051
Media Recorder SoftwareNoldusNDS-NMR3-00M
IrisschereFSTFST-14062-09
VibratomeCampden Inst.7000SMZ-2
BioanalysatorAgilent TechnologiesDer Agilent 2100 Bioanalysator
ThermocyclerBio-Rad1852048
Invertierter MikrolöffelspatelBochem Instrument GmbH3213
Biomark HD ReaderFluidigmBMHD-BMKHD
Dynamisches Array Chip für 96,96 GenexpressionFluidigmBMK-M-96.96

References

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