Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

Zusammenfassung

Statischen Adhäsionsassay ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und andere Zelltypen zu modellieren. Interaktionen werden durch Injizieren markierten T-Zellen in Vertiefungen, die mit Adhäsionsmolekülen beschichtet ist, während ein Plattenlesegerät verwendet wird, um die Anzahl der anhaftenden Zellen zu quantifizieren folgenden seriellen Waschungen erzeugt.

Zusammenfassung

T-Lymphozyten-Adhäsion wird für mehrere T-Zell-Funktionen, einschließlich der Migration zu Entzündungsstellen und die Bildung von immunologischen Synapsen mit Antigen präsentierenden Zellen erforderlich. T-Zellen zu erreichen geregelte Haftung durch Steuerung der Klebeeigenschaften von Integrinen, einer Klasse von Zelladhäsionsmolekülen aus heterodimeren Paare von Transmembranproteinen, die mit den Zielmolekülen wechselwirken auf Partnerzellen oder extrazelluläre Matrix. Der prominenteste T-Zell-Integrin Lymphozytenfunktion assoziiertes Antigen (LFA) -1, von Untereinheiten &agr; L und β2, deren Ziel die intrazelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM) -1 besteht. Die Fähigkeit eines T-Zell-Adhäsion zu steuern leitet sich aus der Möglichkeit, die Affinitätszustände einzelner Integrine regulieren. Inside-Out-Signalisierung beschreibt die Verfahren, bei dem Signale in einer Zelle bewirken, dass die externe Domänen der Integrine in einen aktivierten Zustand übernehmen. Vieles von unserem Wissen über diese komplexen Phänomene auf mechanistische BasisStudien in vitro vereinfachten Modellsystemen durchgeführt. Die hier beschriebene T-Lymphozyten-Adhäsion Assay ist ein hervorragendes Werkzeug, die T-Zellen zu halten, um Moleküle unter statischen Bedingungen zielen, ermöglicht, und nutzt eine Fluoreszenzplattenlesegerät zu Haft dann quantifizieren. Dieser Assay wurde bei der Definition Haft stimulierende oder hemmende Substanzen, die auf Lymphozyten wirken, sowie die Charakterisierung der Signalwege beteiligt nützlich. Obwohl hier für LFA-1 beschrieben - ICAM-1 vermittelte Adhäsion; Dieser Assay kann leicht angepasst werden, um für die Untersuchung von anderen adhäsiven Wechselwirkungen (zB VLA-4 - Fibronektin) zu ermöglichen.

Einleitung

T-Lymphozyten-Adhäsion ist ein fundamentaler Prozess der Immunantwort ^1. Es ist für die T-Zell-Interaktion mit Endothelzellen, die Dekoration der Gefäßwände erforderlich ist, zum Abtasten Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in die Lymphknoten und die für die Bildung von immunologischen Synapsen (IS) mit Zielzellen ^2. Diese Anforderungen sind funktionell und kinetisch deutlich. Der Prozess der Lymphozyten-Extravasation besteht aus Chemoattraktion, Rollen, feste Adhäsion und Transmigration. Der Übergang von der rollenden Adhäsion festigen erfordert T-Zellen zu einer G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Signal schnell zu reagieren. Diese Antwort ergibt ....

Protokoll

1. Beschichtung der Mikrotiterplatte Wells

Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist die Beschichtung Polystyroloberflächen mit ICAM-1 als Liganden für die T-Zell-LFA-1 zu dienen.

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen:
   1. Vorbereitung der Beschichtungslösung durch Resuspendieren rekombinantem ICAM-1 mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4) mit Calcium (1 mM angereichert CaCl ₂₎ und Magnesium (2 nM MgCl _2). Achten Sie darauf, dass die endgültige Konzentration von ICAM-1 ist 10 ug / ml, von einer ....

Ergebnisse

Unten ist ein Beispiel der Adhäsion Assay unter Verwendung von primären T-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Anti-CD3-Antikörper stimuliert. Es ist nützlich, um die Fluoreszenz des ungewaschenen Zellen (dh die Gesamtbelastung) kennen. Unstimulierte Zellen dienen als negative Kontrolle und PMA-behandelten Zellen die positive Kontrolle für die Anti-CD3-Antikörper. Zellen in unbeschichteten Vertiefungen plattiert dienen als Kontrolle für ICAM-1. In einem typischen Versuch wurde der Anteil der adhärenten .......

Diskussion

Es gibt verschiedene Tests, um Signale an LFA-1-Aktivierung und T-Zell-Adhäsion ¹² studieren. Durchflusszytometrie wird verwendet, um LFA-1-Affinität Zustände in lebenden Zellen messen mit monoklonalen Antikörpern, die selektiv entweder gebogen oder verlängert LFA-1 zu binden. Eine der Einschränkungen dieser Methode ist, dass es nicht auf das Konto der Integrine 'Gier zu nehmen. Migration-Assays sind nützliche Werkzeuge, aber sie mickrige Haftung an einem bestimmten Zeitpunkt zu messen Migration, und nich.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Plattenleser	BioTek	Synergy H1 Hybrid
Mehrkanalpipette	Fisher	21-377-829
96-Well-Mikroplatte mit optischem Boden	Corning Costar	3603
Rekombinant ICAM-1	R& D Systems	ADP4-050
Anti-CD3-Antikörper	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
CFSE	Molecular Probes	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS mit Calcium und Magnesium	Gibco
Periphere Lymphozyten	z. B. Maus oder Mensch
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M8266
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	499609
Open Gen 5 Software	BioTek	Version 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
15 und 50 ml Zentrifugenröhrchen	Fisher	352099, 352070
Einweg-Pasteurpipetten aus Kunststoff	Fisher	13-711-7M
T-75 Kulturflaschen	Fisher	50-754-1366
RosetteSep T-Zell-Stimulationskit	StemCell Technologies	15061

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