Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

Summary

Statischen Adhäsionsassay ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und andere Zelltypen zu modellieren. Interaktionen werden durch Injizieren markierten T-Zellen in Vertiefungen, die mit Adhäsionsmolekülen beschichtet ist, während ein Plattenlesegerät verwendet wird, um die Anzahl der anhaftenden Zellen zu quantifizieren folgenden seriellen Waschungen erzeugt.

Abstract

T-Lymphozyten-Adhäsion wird für mehrere T-Zell-Funktionen, einschließlich der Migration zu Entzündungsstellen und die Bildung von immunologischen Synapsen mit Antigen präsentierenden Zellen erforderlich. T-Zellen zu erreichen geregelte Haftung durch Steuerung der Klebeeigenschaften von Integrinen, einer Klasse von Zelladhäsionsmolekülen aus heterodimeren Paare von Transmembranproteinen, die mit den Zielmolekülen wechselwirken auf Partnerzellen oder extrazelluläre Matrix. Der prominenteste T-Zell-Integrin Lymphozytenfunktion assoziiertes Antigen (LFA) -1, von Untereinheiten &agr; L und β2, deren Ziel die intrazelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM) -1 besteht. Die Fähigkeit eines T-Zell-Adhäsion zu steuern leitet sich aus der Möglichkeit, die Affinitätszustände einzelner Integrine regulieren. Inside-Out-Signalisierung beschreibt die Verfahren, bei dem Signale in einer Zelle bewirken, dass die externe Domänen der Integrine in einen aktivierten Zustand übernehmen. Vieles von unserem Wissen über diese komplexen Phänomene auf mechanistische BasisStudien in vitro vereinfachten Modellsystemen durchgeführt. Die hier beschriebene T-Lymphozyten-Adhäsion Assay ist ein hervorragendes Werkzeug, die T-Zellen zu halten, um Moleküle unter statischen Bedingungen zielen, ermöglicht, und nutzt eine Fluoreszenzplattenlesegerät zu Haft dann quantifizieren. Dieser Assay wurde bei der Definition Haft stimulierende oder hemmende Substanzen, die auf Lymphozyten wirken, sowie die Charakterisierung der Signalwege beteiligt nützlich. Obwohl hier für LFA-1 beschrieben - ICAM-1 vermittelte Adhäsion; Dieser Assay kann leicht angepasst werden, um für die Untersuchung von anderen adhäsiven Wechselwirkungen (zB VLA-4 - Fibronektin) zu ermöglichen.

Introduction

T-Lymphozyten-Adhäsion ist ein fundamentaler Prozess der Immunantwort ^1. Es ist für die T-Zell-Interaktion mit Endothelzellen, die Dekoration der Gefäßwände erforderlich ist, zum Abtasten Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in die Lymphknoten und die für die Bildung von immunologischen Synapsen (IS) mit Zielzellen ^2. Diese Anforderungen sind funktionell und kinetisch deutlich. Der Prozess der Lymphozyten-Extravasation besteht aus Chemoattraktion, Rollen, feste Adhäsion und Transmigration. Der Übergang von der rollenden Adhäsion festigen erfordert T-Zellen zu einer G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Signal schnell zu reagieren. Diese Antwort ergibt einen Integrin-Ligand-Wechselwirkung, die Verhaftungen und verlangsamt den Rollzelle ^3. Eine sofortige Änderung in der Integrin-Avidität vermittelt diesen Prozess. Migration erfordert dynamischen Wechselwirkungen betweenTcells und Endothelzellen mit der Bildung von Verwachsungen an der "Front-End" und Bruch von Adhäsionen in der "hinteren Ende"mit einem Intervall von etwa einer Minute zwischen Form-und Bruch ^4. Der IS bildet inminutes, muss aber für ⁶ Stunden intakt bleiben.

Interessanterweise, ein Adhäsionsmolekül das Integrin Familienmitglied Lymphozytenfunktion assoziiertes Antigen (LFA) - 1 ist, wichtig für all diese Prozesse ^5. LFA-1 vermittelt Adhäsion durch Interaktionen mit mehreren Mitgliedern der Immunglobulin-Superfamilie. Die am besten untersuchten Liganden mit der höchsten Affinität an LFA-1 ist das interzelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM) -1. Nicht-aktivierte zirkulierenden Lymphozyten exprimieren geringe Affinität LFA-1 auf der Zelloberfläche und sind daher nicht an ICAM-1-beschichteten Oberflächen anhaften. LFA-1-Affinität ist variabel und von mehreren Signalereignisse wie G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Aktivierung, Zytokin-Stimulation, und Signale, die von T-Zell-Rezeptoren (TCR) vermittelt geregelt. Die daraus resultierende hohe Affinität Form von LFA-1 fördert die intrazelluläre Aktivierung auf den extrazellulären Raum turch Wechselwirkung mit ICAM-1. Dieser Weg wird von innen nach außen bezeichnet Signal ^7. Ebenso Signalgebung durch LFA-1 aus dem extrazellulären Raum außerhalb-der Signalisierung genannt.

Die intrazelluläre Signalkaskaden in Inside-out-und Outside-In-Signalübertragung beteiligt sind ein Schwerpunkt der aktuellen Forschung. Die kleine GTPase Rap1 hat vor kurzem als die Schlüsselkomponente der inside-out signalisiert, dass es üblich, sowohl TCR-Ligation und Zytokin-Signal ^8. Die kritische Rolle in Rap1 Integrin-Aktivierung wird von der Entdeckung, dass eine Überexpression von Rap1 stimuliert Integrin-abhängige Adhäsion von T-Zellen markiert, während T-Zell-Adhäsion wird durch Expression von dominant-negativen Rap1 ⁹ blockiert. Diese Fortschritte in unserem Verständnis der Integrin-Regulation durch Rap1 wurden mit in vitro-Tools durchgeführt. Unter ihnen ist der hier beschriebene statische Adhäsionsassay.

Das Ziel dieser Methode ist es, T studierenZellhaftfähigkeit an ICAM-1-beschichteten Oberflächen. Genauer gesagt, wird es verwendet, um objektiv zu messen und zu quantifizieren, LFA-1-Affinität zu seinem Gegenliganden in lebenden Zellen in Echtzeit, unter verschiedenen Bedingungen. Diese Technik verwendet Polystyrol Vertiefungen mit ICAM-1 beschichtet, um die Zelloberflächen, die die T-Zellen interagieren mit imitieren. Viele zuvor beschriebenen statischen T-Zell-Adhäsions-Assays wurden experimentell komplex. Diese Assays oft für T-Zellen erforderlich ist, um radioaktiv markiert werden kann, verwendet kultivierten Rinder-Hornhaut-Zellen eine extrazelluläre Matrix, als Substrat für die T-Zell-Adhäsion zu erzeugen, oder für nicht-physiologischen T-Zell-Stimulation über eine längere Dauer, um T-Zell-Adhäsion zu fördern ¹⁰ bezeichnet. Die Verwendung von fluorometrischen Messung an T-Zellen zu quantifizieren folgenden Haft Inkubation ist eine empfindliche und genaue Verfahren zur Quantifizierung verglichen mit Durchflusszytometrie und Mikroskopie fließen, wie sie in vielen Assaysystemen ¹¹ verwendet. Zusätzlich einzelnen Zelle mikroskopischIC-Analyse von Integrin Lokalisation nicht für die breite Bevölkerung basierten Analyse in der gleichen Weise wie die fluorometrische Messung zu ermöglichen. Während Aktivierungszustand spezifische LFA-1-Antikörper sind kommerziell erhältlich, bieten diese Antikörper geringe Empfindlichkeit in Bezug auf die Methode, die hier skizziert. Der wesentliche Vorteil gegenüber alternativen Techniken ist die Einfachheit und die Fähigkeit, mehrere Versuchsbedingungen gleichzeitig zu untersuchen. Bei der Betrachtung dieser Verfahren für eine bestimmte Anwendung, sollte man berücksichtigen, dass T-Zellen sollten negativ gewählt werden, frisch isoliert und mit einem fluoreszierenden Marker markiert.

Protocol

1. Beschichtung der Mikrotiterplatte Wells

Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist die Beschichtung Polystyroloberflächen mit ICAM-1 als Liganden für die T-Zell-LFA-1 zu dienen.

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen:
   1. Vorbereitung der Beschichtungslösung durch Resuspendieren rekombinantem ICAM-1 mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4) mit Calcium (1 mM angereichert CaCl ₂₎ und Magnesium (2 nM MgCl _2). Achten Sie darauf, dass die endgültige Konzentration von ICAM-1 ist 10 ug / ml, von einer 0,7 mg / ml Stammlösung hergestellt und in einem -80 ° C Gefrierschrank aufbewahrt.
   2. Vorbereitung der Haftlösung durch Anreicherung PBS mit 0,5% menschlichem (oder Rinder-), Serumalbumin (HSA / BSA), 2 mM MgCl _{2 und} 1 mM CaCl _2.
   3. Bereiten Sie die Waschlösung durch Zugabe von 2 mM MgCl ₂ und 1 mM CaCl ₂ bis PBS. Warm alle Lösungen auf 37° C vor dem Gebrauch.
2. Wasch 24 Vertiefungen mit 50 &mgr; l Waschlösung. Dazu gehören ungewaschenen Brunnen, positive (PMA behandelten Zellen) und negativ (unbeschichteten Wells) Kontrollen. Für jede Bedingung gesetzt mindestens drei Brunnen (dreifach).
3. Dann werden 50 ul Beschichtungslösung in jede Vertiefung. Auf die unbeschichteten Kontrollvertiefungen nicht hinzufügen. Inkubieren für eine Stunde innerhalb 37 ° C Inkubator.
4. Saugen Sie den Beschichtungslösung sanft, ohne dass die Spitze auf den Boden der Wells berühren. Einmal mit 50 &mgr; l der Waschlösung waschen.
5. In 50 ul Haftlösung und inkubieren Sie die Platte für eine Stunde innerhalb 37 ° C Inkubator.
6. Saugen Sie sanft und einmal waschen mit 50 ul Waschlösung. Verwenden Sie die Platte am selben Tag, jedoch ist es möglich, sie bei 4 ° C über Nacht zu halten und ihn am folgenden Tag.

2. T-Zell-Isolierung aus Blut

1. In humanen T-Zell-Anreicherung Cocktail in 50 ul / ml of Vollblut (zB für 3 ml Antikoagulans (Heparin, EDTA oder Citrat) Vollblut, fügen Sie 150 ul Cocktail). Gut mischen.
2. Inkubieren 20 min bei Raumtemperatur.
3. In ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen 3 ml behandeltem Blut und ein gleiches Volumen von PBS (ohne Calcium und Magnesium) mit 1% D-Glucose bei Raumtemperatur angereichert. Mischen Sie vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette.
4. 15 ml Ficoll-Paque PLUS in das Zentrifugenröhrchen.
5. Vorsichtig schichten 6 ml Blutprobe auf der Lymphozytenisolationsmedium verdünnt.
6. Zentrifuge bei 400 g für 20 min bei 20 ° C mit Break aus.
7. Zeichnen Sie die obere Schicht mit einem sauberen Pasteur-Pipette, so dass die Lymphozyten-Schicht ungestört an der Schnittstelle. Die obere Schicht des Plasma kann für eine spätere Verwendung gespeichert werden. Mit einem sauberen Pasteur-Pipette übertragen Sie die Lymphozytenschicht auf ein sauberes Zentrifugenrohr.
8. Add 3 Volumina (9 ml) PBS zu den Lymphozyten. Suspend die Zellen durch leichtes draFlügel sie in eine und aus einer Pasteur-Pipette.
9. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei 20 ° C.
10. Entfernen Sie den Überstand. Die Lymphozyten sollte nun in der geeigneten Medium zur Anwendung ausgesetzt. Übertragung der Zellen auf ein T-75 Kulturflasche in 20 ml RPMI 1640-Medium, enthaltend 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin.

3. Präparation der Zellen

Hinweis: Voraussetzung ist, dass die Zellen mit einem fluoreszierenden Reagens markiert werden. In diesem Protokoll Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE), aber das grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren, Zellen sind eine akzeptable Alternative.

1. Zählen 2,4 x 10 ⁶ T-Zellen (1 × 10 ⁵ pro Vertiefung) mit einer Zählkammer.
2. Resuspendieren der Zellen in Kulturmedium kein Serum (Serumentzug). Die Zellen für 2 Stunden inkubieren bei 37 ° C im Brutschrank.
3. Zentrifugieren der Zellen für 5 min (400 × g). Saugen Sie die Medien undResuspendieren in 1 ml PBS.
4. In CFSE bei 1:1000 Verdünnung (Lager bis 5 mm). Cover von Licht und Inkubation für 8 min bei Raumtemperatur.
5. Die Reaktion durch Zugabe von 10 ml 37 ° C PBS und Spin bei 400 g für 5 min.
6. Resuspendieren Zellpellet mit 1,2 ml vorgewärmter Haftlösung (1 × 10 ⁵ Zellen pro 50 ul).

4. Stimulation der Zellen

Hinweis: Um die Adhäsion zu initiieren, müssen Zellen stimuliert werden. Im folgenden Experiment werden die Zellen über die TCR-Verwendung von Anti-CD3-Antikörper stimuliert Vernetzungs jedoch löslich SDF-1 könnte als Alternative dienen. Je nach Ziel der Experimente könnten verschiedene pharmakologische Reagenzien vor oder während der Stimulation zugegeben werden, um die Auswirkungen auf zelluläre Adhäsion zu untersuchen. Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) ist ein Phorbolester, die strukturell ähnlich zu der zweiten Messenger Diacylglycerol (DAG) ist und somit aktiviert mehreren Kinases Downstream der TCR (hauptsächlich Protein Kinase C); Hier ist es als eine positive Kontrolle verwendet wird.

1. Wärmen Sie die Mikrotiterplatte bis 37 ° C
2. Teilen Sie die Zellen in 1,5 ml 8 leere Rohre (150 ul in jeder Röhre), ein Rohr für jede Bedingung.
3. Behandeln Sie die Zellen entsprechend:
   1. Stimulieren Sie ein Rohr mit PMA bei 10 ng / ml als Positivkontrolle dienen. Halten Sie drei Rohre unbehandelt, als Steuer zur Stimulation ("keine Stimulation"), ungewaschen Ladekontrolle ("no wash") und Steuerung für ICAM-1-Beschichtung ("unbeschichtet") dienen.
   2. Stimulieren vier Röhren mit verschiedenen Konzentrationen von Anti-CD3-Antikörper (0,1, 1, 5 und 10 ug / ml). Fahren Sie mit dem nächsten Schritt ohne Verzögerungen.
4. Aliquot 50 ul stimulierten Zellgemisch in jedem leeren Brunnen. Die endgültige Anzahl der Zellen pro 1 x 10 ^5.
5. Setzen Sie den Mikroplatten im 37 ° C Inkubator für 15 min.
   Hinweis: Einige T-Zelllinien erfordern kürzere Stimulation tion der Zeit. Während dieser Zeit werden die Zellen an den Boden der Wells niederzulassen und sich an die Zielliganden.

5. Abwaschen nicht adhärenten Zellen

Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist es, Zellen, die nicht in der Lage, enge Kontakte mit dem Liganden-beschichteten Oberflächen zu bilden waren zu entfernen. Verwenden einer Mehrkanalpipette zu diesem Schritt, um zu gewährleisten, dass die gleiche physikalische Kräfte in jede Vertiefung aufgetragen. Es ist wichtig, die angegebenen Kontrollvertiefungen ungewaschen, in die Berechnung des Prozentsatzes der adhärenten Zellen behilflich zu halten.

1. In 150 ul warmen Haftung Lösung zu jedem Brunnen. Schütteln Sie die Platte vorsichtig für einige Sekunden, bevor Sie das Medium aus den Vertiefungen. Den Boden der Wells Berühren Sie nicht mit den Tipps.
2. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Ändern Sie die Richtung der Pipette beim Pipettieren der Puffer ein und aus.

6. Bestimmung der Prozentsatz der adhärenten Zellen

_content "> Hinweis: In diesem Schritt wird ein Fluoreszenzplattenlesegerät wird die Fluoreszenzintensität in jedem gut messen Die Intensität ist in direktem Zusammenhang mit der Anzahl der adhärenten Zellen..

1. Schalten Sie den Plattenlesegerät. Öffnen Sie die Platte-Reader-Software, indem Sie auf das Verknüpfungssymbol auf dem Desktop.
   1. Wählen Sie im Menü "Task" klicken Sie auf "Neu", um die Einrichtung eines neuen Protokolls.
   2. Wählen Sie im Menü "Aktionen" wählen Sie die Option "Lesen". Klicken Sie auf "Fluoreszenzintensität" und auf den "Ok"-Registerkarte.
   3. Wählen Sie im Dropdown-Menü wählen Sie "Anregungswellenlänge 485" und "Emissionswellenlänge 528". Drücken Sie die "OK"-Registerkarte.
   4. In "Optik" Optionsmenü wählen Sie "Bottom" und auf den "Ok"-Registerkarte. Gehen Sie zurück in das Menü "Aktionen" und die Temperatur auf 37 ° C und klicken Sie auf "Ok".
   5. Legen Sie die in den Mikroplattenleser undklicken Sie auf "Ausführen". Das Ergebnis wird in Excel-Tabelle exportiert werden.
2. Der prozentuale Anteil der adhärenten Zellen unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Anteil der anhaftenden Zellen = (durchschnittliche Fluoreszenzintensität in der gewaschenen Vertiefungen Lesen) / (durchschnittliche Fluoreszenzintensität in der gewaschenen Zellen gelesen) x 100%.

Results

Unten ist ein Beispiel der Adhäsion Assay unter Verwendung von primären T-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Anti-CD3-Antikörper stimuliert. Es ist nützlich, um die Fluoreszenz des ungewaschenen Zellen (dh die Gesamtbelastung) kennen. Unstimulierte Zellen dienen als negative Kontrolle und PMA-behandelten Zellen die positive Kontrolle für die Anti-CD3-Antikörper. Zellen in unbeschichteten Vertiefungen plattiert dienen als Kontrolle für ICAM-1. In einem typischen Versuch wurde der Anteil der adhärenten ...

Discussion

Es gibt verschiedene Tests, um Signale an LFA-1-Aktivierung und T-Zell-Adhäsion ¹² studieren. Durchflusszytometrie wird verwendet, um LFA-1-Affinität Zustände in lebenden Zellen messen mit monoklonalen Antikörpern, die selektiv entweder gebogen oder verlängert LFA-1 zu binden. Eine der Einschränkungen dieser Methode ist, dass es nicht auf das Konto der Integrine 'Gier zu nehmen. Migration-Assays sind nützliche Werkzeuge, aber sie mickrige Haftung an einem bestimmten Zeitpunkt zu messen Migration, und nich...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plattenleser	BioTek	Synergy H1 Hybrid
Mehrkanalpipette	Fisher	21-377-829
96-Well-Mikroplatte mit optischem Boden	Corning Costar	3603
Rekombinant ICAM-1	R& D Systems	ADP4-050
Anti-CD3-Antikörper	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
CFSE	Molecular Probes	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS mit Calcium und Magnesium	Gibco
Periphere Lymphozyten	z. B. Maus oder Mensch
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M8266
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	499609
Open Gen 5 Software	BioTek	Version 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
15 und 50 ml Zentrifugenröhrchen	Fisher	352099, 352070
Einweg-Pasteurpipetten aus Kunststoff	Fisher	13-711-7M
T-75 Kulturflaschen	Fisher	50-754-1366
RosetteSep T-Zell-Stimulationskit	StemCell Technologies	15061