Von Voxel zu Wissen: ein praktischer Leitfaden für die Segmentierung der Elektronenmikroskopie Komplexe 3D-Daten

Summary

Der Engpass für Mobil 3D-Elektronenmikroskopie ist die Merkmalsextraktion (Segmentierung) in hochkomplexen 3D-Dichtekarten. Wir haben eine Reihe von Kriterien, die den Orientierungsrahmen in Bezug auf die Segmentierungsansatz (manuell, halbautomatisch oder automatisch) ist am besten geeignet für verschiedene Datentypen entwickelt, so dass ein Ausgangspunkt für eine effektive Segmentierung.

Abstract

Moderner 3D-Elektronenmikroskopie Ansätze seit kurzem die beispiellosen Einblick in die 3D ultra Organisation von Zellen und Geweben, wodurch die Visualisierung großer makromolekularer Maschinen, wie Haftkomplexe, sowie Strukturen höherer Ordnung, wie das Zytoskelett und Zellorganellen in ihrer jeweiligen Zell-und Gewebe Kontext. Angesichts der inhärenten Komplexität der zellulären Volumen, ist es wichtig, zuerst extrahieren Sie die Merkmale von Interesse, um die Visualisierung, Quantifizierung und damit Verständnis für ihre 3D-Organisation ermöglichen. Jeder Datensatz wird durch verschiedene Merkmale, beispielsweise Signal-zu-Rausch-Verhältnis, Frische (Schärfe) der Daten definiert, die Heterogenität der seine Funktionen, Gedränge von Funktionen, Vorhandensein oder Fehlen von charakteristischen Formen, die für eine einfache Identifizierung zu ermöglichen, und der Prozentsatz des gesamten Volumens, das eine spezifische Region von Interesse befindet. Alle diese Eigenschaften zu berücksichtigenbei der Entscheidung über die zu nähern, um für die Segmentierung zu nehmen.

Die sechs verschiedenen 3D ultra Datensätze vorgestellt wurden von drei verschiedenen Bildgebungs erhalten nähert: Harz eingebettet Buntelektronentomographie, fokussierten Ionen Strahl-und Serienblock Face-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM, SBF-SEM) leicht fleckig und stark gefärbte Proben sind. Aus diesen Datensätzen wurden vier verschiedene Segmentierungsansätze angewendet: (1) vollständig manuellen Modellbau folgte allein durch Visualisierung des Modells, (2) Handverfolgung Segmentierung der Daten, gefolgt von Oberflächendarstellung, (3) halbautomatische Ansätze verfolgt durch Surface-Rendering, oder (4) automatisiert maßgeschneiderten Segmentierungsalgorithmen, gefolgt von Oberflächendarstellung und quantitative Analyse. Je nach Kombination der Datensatz Eigenschaften wurde festgestellt, dass typischerweise eine dieser vier kategorische Ansätze übertrifft die anderen, aber abhängig von der exakten Sequenz von Kriterien, More als ein Ansatz erfolgreich sein kann. Basierend auf diesen Daten schlagen wir eine Triage System, das sowohl objektive Daten-Set Merkmale und subjektive persönliche Kriterien für die Analyse der verschiedenen Datensätze kategorisiert.

Introduction

Traditionell ist die Elektronenmikroskopie (EM) Feld ist in 1) der Strukturbiologie Zweig mit hohen und super-hochauflösende TEM-geteilt worden, in der Regel mit impliziten oder expliziten Datenmittelung, um die dreidimensionale (3D) Struktur der makromolekularen Komplexen mit Untersuchung kombiniert ein definierter Zusammensetzung und in der Regel eine relativ kleine Größe ^1-4, und 2) die zelluläre Bildgebung Branche, in der gesamten zellulären Szenerien werden visualisiert ^1,5,6. Während die Strukturbiologie Zweig hat eine spektakuläre Entwicklung in den letzten vier Jahrzehnten durchgemacht, die Zellbiologie Filiale wurde vor allem auf zwei Dimensionen oft auf weniger-als-optimal konservierten Proben beschränkt. Erst mit dem Aufkommen der Elektronentomographie in den letzten zehn Jahren hat zellbiologische Bildgebung ultra in die dritte Dimension ^5,7, wo in der Regel durchschnittlich nicht als die zellulären Landschaften, und damit die Merkmale von Interesse durchgeführt werden, erweitert, sind in der Regel eindeutig.

Obwohl visualisiert zellulären Szenen sind oft atemberaubend für das Auge, effiziente Extraktion der Merkmale von Interesse und die anschließende quantitative Analyse solcher hoch komplexen zellulären Mengen zurückbleiben, zum Teil, weil die genaue Proteinzusammensetzung ist in der Regel unbekannt, daher macht es schwierig zu interpretieren, diese zellulären 3D-Volumen. Zu diesem Zeitpunkt wird umfangreiches Know-how biologischen oft um komplexe Schichtbilder zu interpretieren, oder auch, um die wichtigen Regionen und wesentliche Komponenten in der 3D-Volumen zu identifizieren benötigt. Als weitere Komplikation ist die Visualisierung von 3D-Volumen bemerkenswert nicht trivial. 3D-Volumen kann gedacht werden und somit als Stapel von 2D-Bildern visualisiert. Scheibe-für-Scheibe Inspektion von aufeinanderfolgenden 2D-Bildern reduziert die Komplexität, sondern begrenzt auch die Merkmalsextraktion und somit eine quantitative Analyse auf die zwei Dimensionen. Für die meisten 3D-Objekte, die Darstellung von 3D-Volumen lediglich als ein Stapel von aufeinanderfolgenden Ebenen führt aber zu einer unvollständigen eind schiefe Perspektive in 3D Natur eines bestimmten Systems. Alternative Formen der Sichtprüfung erfordern entweder Volumen-Rendering oder Oberflächen-Rendering, die angesichts der oft-dichte Natur eines zellulären Volumen-kann leicht zu einer Sichtbehinderung von verschachtelten Objekten führen oder zu überwältigen einen Benutzer insgesamt, wodurch interaktive manuelle Segmentierung schwierig.

Um diese Barrieren, eine große Vielzahl von automatisierten Merkmalsextraktion zu beheben (Segmentierung) Ansätze entwickelt worden, die in der Regel entweder dichte oder Gradienten-basierten ^8-10 sind. Diese Verfahren sind in der Regel Segment das gesamte Volumen unabhängig davon, welche Bereiche oder Funktionen sind von Interesse für die Experten, auch wenn einige neuere Methoden können eine bestimmte Funktion von Interesse gezielt wie Aktinfilamente ^11. Darüber hinaus können die Programme ausführt automatisierte Segmentierung manchmal bei der Herstellung einer großen Anzahl von Untervolumina zur Folge (beispielsweise bei der Anwendung Wende immersion Segmentierung), die oft müssen manuell wieder in, die das ganze Merkmal von Interesse oder weitere Segmentierung unterzogen werden zusammengeführt werden. Dies gilt insbesondere für komplexe und füllten Datensätze wahr, wodurch die meisten Rendering-Computer-Algorithmen können nicht nur die Eigenschaften von Interesse mit Treue und erhebliche Anstrengungen curation von einem Experten zu extrahieren sind oft erforderlich, um eine gewünschte segmentierten Volumen herzustellen.

Darüber hinaus kundenspezifische Lösungen für eine hochspezifische Problem werden oft als eine wissenschaftliche Tagung Papier ohne Wert darauf gelegt, sie breiten veröffentlicht, mit wenig und umfassende Werkzeuge für die Forschung zugänglich, die nicht über intime Kenntnisse der Mathematik, der Informatik und / oder Computergrafik. Eine kundengerechte Programmierung Software-Umgebung, die eine Reihe von Bildanalyse-Bibliotheken, kann ein leistungsfähiges Werkzeug-Set ermöglicht es Benutzern, ihre eigenen Module effizient zu schreiben für eine genaue Segmentierung sein. Allerdings erfordert dieser Ansatz extensive Ausbildung und einen Hintergrund in der Informatik, um die Vorteile seiner vielen Funktionen oder Fähigkeiten für die Bildanalyse zu nehmen. Man kann in so einem vielseitigen Software-Umgebung für bestimmte Datensätze, wo die Funktionen sind mehr spärlich, zB arbeiten, durch den Einsatz leistungsfähiger Form-basierte Ansätze, die auf die einzigartige Geometrie der "Vorlagen", um Objekte von Interesse aus ihrer Umgebung zu trennen ^12,13 vertrauen .

Eine faire Vielzahl von Computer-Grafiken Visualisierungspakete existieren für interaktive manuelle Segmentierung und Modellbau. Einige Pakete sind im Handel erhältlich, während andere akademische Herkunft und kostenlos verteilt, wie zum Beispiel: University of California San Francisco Chimera ^14, University of Colorado IMOD ^15, und der University of Texas in Austin ¹⁶ VolumeRover. Doch die Vielzahl und Komplexität der Funktionen und Möglichkeiten diese Programme besitzen steiler die Lernkurve für each. Bestimmte Visualisierungsprogramme bieten eine einfache geometrische Modelle, wie Bälle und Stöcke in verschiedenen Größen, die um ein vereinfachtes Modell der komplexen 3D-Volumen zu erstellen in die Dichtekarten platziert werden können. Diese Modelle erlauben dann einfache geometrische und Volumenmessungen und damit mehr als nur der "schönes Bild" zu gehen. Solche manuellen Verfolgung von Objekten funktioniert gut für Volumen, wo nur eine kleine Anzahl von Objekten, die verfolgt und extrahiert werden müssen. Die jüngste Entwicklung von großen Volumen 3D ultra Imaging jeweils mit fokussiertem Ionenstrahl Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) ^17-20 oder serielle Blockfläche Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) ²¹ stellt jedoch die zusätzliche Komplikation, die die Größe der 3D-Daten Gruppen können von Gigabyte auf Dutzende und Hunderte von Gigabytes, Terabytes und sogar die reichen. Daher sind solche großen 3D-Volumen praktisch unzugänglich Handmerkmalsextraktion und damit effiziente benutzergeführte halbautomatischen Leistungure-Extraktion wird einer der Engpässe für die effiziente Analyse von 3D-Volumen in absehbarer Zukunft sein.

Präsentiert hier sind vier verschiedene Segmentierungsansätze, die routinemäßig auf einer großen Palette von biologischen Bildtypen verwendet werden. Diese Verfahren werden dann auf ihre Wirksamkeit bei verschiedenen Arten von Datensätzen verglichen werden, so dass eine Zusammenstellung in einer Führung um Biologen entscheiden, was die beste Segmentierung Ansatz zur wirksamen Merkmalsextraktion ihrer eigenen Daten sein. So detailliert Benutzerhandbücher sind für die meisten der beschriebenen Programme zur Verfügung, ist das Ziel nicht zu potenziellen Nutzern vertraut mit einer dieser besonderen Pakete zu machen. Stattdessen ist das Ziel, die jeweiligen Stärken und Schwächen dieser verschiedenen Segmentierungsstrategien indem sie beispielsweise auf sechs Datensätze mit unterschiedlichen Eigenschaften aufweisen. Durch diesen Vergleich wird eine Reihe von Kriterien entwickelt worden, die entweder auf den Zielbildeigenschaften der Basis von3D-Datensätzen, wie beispielsweise Daten dagegen Knusprigkeit Gedrängt und Komplexität oder entstammen subjektive Erwägungen, wie der gewünschten Ziels für die Segmentierung, Morphologien der Merkmale segmentiert werden, Populationsdichte der Merkmale von Interesse, das heißt die Fraktion das Volumen durch das Merkmal von Interesse ist, und wie geht man optimal mit endlichen Ressourcen wie Zeit und Verfügbarkeit von Personal besetzt. Diese verschiedenen Datensätzen Beispiel veranschaulichen, wie diese objektiven und subjektiven Kriterien können sequentiell in einer Vielzahl von Kombinationen eingesetzt werden, um eine Kopplung von bestimmten Merkmalsextraktion Ansätze mit bestimmten Typen von Datensätzen zu erhalten. Die angegebenen wird hoffentlich helfen Anfängern Empfehlungen mit einer großen Vielzahl von Segmentierungsoptionen konfrontiert das wirksamste Segmentierungsansatz für ihre eigenen 3D-Volumen.

Während der Schwerpunkt der Arbeit ist die Merkmalsextraktion, die Aufmerksamkeit auf die Datenerfassung und Vorverarbeitung Daten ist entscheidend für die effiziente segmentation. Oft Färbung der Proben können ungleichmäßig sein, und daher sollten potenzielle Färbung Artefakte in der Segmentierung Verfahren berücksichtigt werden. Jedoch gibt Fleck gewöhnlich höher Signal-Rauschen und erfordert daher weniger Filterung und andere mathematische Behandlung der Zellvolumina, die eventuell auch in Artefakten führen kann. Die jeweiligen RAW-Bilddatensätze müssen an den richtigen Kontrast und Kamerapixel Einstellungen erworben werden, ausgerichtet und in eine rekonstruierte 3D-Volumen. Für Tomogramme werden typischerweise ausgerichteten Bilder rekonstruiert gewichtete Rückprojektion, und der Datensatz wird normalerweise Rauschunterdrückungsalgorithmen wie nichtlineare anisotrope Diffusion ^22, bilaterale Filter ²³ oder rekursiven Medianfilterung ²⁴ unterzogen. FIB-SEM und SBF-SEM Bilddaten werden von Kreuzkorrelation aufeinander folgenden Scheiben in XY nutzen Programme wie ImageJ ²⁵ ausgerichtet ist. Kontrastverstärkung und Filterung angewendet werden, um die Eigenschaften zu steigernZinsen und damit zu de-Rauschen des Bildstapels. Filterung kann entweder auf das gesamte Volumen vor der Selektion oder der ausgewählten Untervolumina Untervolumen durchgeführt werden, als Filter Ansätze rechenintensiv sein. Downsampling der Daten (Binning), die manchmal zur Lärmminderung und / oder Reduzierung der Dateigröße verwendet wird, ist nur zu empfehlen, wenn die Daten wurde erheblich im Vergleich zu der erwarteten Auflösung überabgetastetes.

Nach Lärmminderung, können die bearbeiteten Bilder dann durch verschiedene Methoden segmentiert werden, und der Fokus in dieser Studie ist auf der folgenden vier: (1) Hand abstrahierten Modellgeneration durch die Erstellung einer Kugel-Stab-Modell, (2) Handverfolgung von interessierenden Merkmalen, (3) automatisierte Schwelle basierte Dichte, und (4) maßgeschneiderte automatisierte Segmentierung über ein Skript für projektspezifische Segmentierung. Grenze Segmentierung ⁸ und immersive Wasserscheide Segmentierung ¹⁰ gibt bessere Alternativen zu einfachen Schwellen, aber the der gleichen Kategorie gehören und die nicht explizit in dieser Diskussion einbezogen.

Manuelle Rückverfolgung von Dichten erfordert skizziert die Eigenschaften von Interesse, in Scheiben schneiden-by-Scheibe, die die Beibehaltung der ursprünglichen Dichte des jeweiligen Teilbereichen Zell kann. Dieser Ansatz ermöglicht eine maximale Kontrolle über das Segmentierungsverfahren, aber ist ein langwieriger und arbeitsintensiver Prozess.

Automatisierte Schwellenbasis (und verwandte) Dichte Segmentierungsansätze sind halbautomatisch, wobei ein Algorithmus wählt Pixel, basierend auf einem Satz von benutzerdefinierten Parametern. Mehrere akademische (kostenlos) Visualisierungspakete wie UCSF Chimera, IMOD, Fidschi ²⁶ und VolumeRover zur Verfügung stehen, als auch kommerzielle (bezahlte Lizenzen erforderlich) Pakete und beide Arten enthalten in der Regel eine oder mehrere dieser Segmentierungsansätze. Die in dieser Arbeit werden die verschiedenen Methoden zu veranschaulichen Software-Pakete beinhalten sowohl kommerzielle Programme und akademischen Open source Programme zur manuellen Erzeugung eines abstrakten Modells, sowie die manuelle und automatische Dichte Segmentierung. Allerdings kann Open-Source-Software manchmal bieten erweiterte Optionen durch die Möglichkeit der Anpassung.

Ein Vergleich dieser Techniken mit verschiedenen Arten von Datensätzen führte zu der folgenden Darstellung von Regeln und Hinweise, wie die Segmentierung der verschiedenen biologischen Daten 3D-Volumen, die unseres Wissens bisher noch nicht veröffentlicht worden zu nähern. Somit ist das erste systematischen Vergleich der verschiedenen Ansätze und ihre Nützlichkeit auf Datensätze mit unterschiedlichen Eigenschaften für Benutzer mit unterschiedlichen Zielen.

Protocol

1. Manuelle Abstracted Model Generation

Hinweis: Die Einzelheiten der Methode unten beschriebenen spezifischen Chimera, aber auch andere Software-Pakete können stattdessen verwendet werden. Verwenden Sie diesen Ansatz, wenn das einzige Ziel ist es, ein geometrisches Modell (zB ein Ball und Stick-Modell), um geometrische Messungen zu machen, anstatt die Anzeige der Lautstärke Form der Objekte zu erstellen.

1. Importieren Sie die Datenmenge in ein geeignetes Programm zur manuellen abstrahierten Modell-Generation.
   1. Wählen Sie Datei> Öffnen Karte zu ziehen Sie die Datei öffnen-Dialog. Navigieren Sie zum Speicherort der Datei der gewünschten Karte.
   2. Ziehen Sie den Volume Viewer (Extras> Volume-Daten> Volume Viewer), und wählen Sie Eigenschaften> Anzeigestil, Daten mit verschiedenen Wiedergabearten anzuzeigen.
   3. Stellen Sie die Schwelle für die Anzeige, indem Sie die vertikale Leiste auf dem Histogramm in der Volume ViewerFenster.
2. Navigieren Sie durch das 3D-Volumen (zB Scheibe für Scheibe), um einen Bereich von Interesse für die Segmentierung wählen Beschneiden, eine kleinere Teilvolumen, wenn nötig.
   1. Im Dialog Volume Viewer, klicken Sie auf Achse, und wählen Sie X, Y, oder Z.
   2. Im Dialog Volume Viewer, wählen Sie Eigenschaften> Flugzeuge. Klicken Sie auf eine Tiefe zu setzen, um die entsprechend der Anzahl im linken Feld Ebene anzuzeigen, und klicken Sie auf Alle, um alle Ebenen anzuzeigen.
   3. Im Dialog Volume Viewer, wählen Sie Eigenschaften> Unterregion Auswahl.
      1. Klicken und ziehen Sie, um einen rechteckigen Rahmen um den Bereich von Interesse zu schaffen.
3. Platzmarkierungen entlang der Merkmal von Interesse und verbinden sie mit Linkern gegebenenfalls (oft automatisch vom Programm erledigt), bis das Modell fertig ist.
   1. Von der Volume Viewer-Menüleiste Extras>Tracer-Dialog, um die Lautstärke Tracer Dialog zu öffnen. In der Volume Tracer Dialog wählen Sie Datei> Neu Marker Set.
   2. In der Volume Tracer Dialog, überprüfen Maus> Platzmarkierungen auf hohe Qualität, Platz Markierungen auf Datenebenen, verschieben und Größe ändern Marker, Link-Marker, um neue Marker ausgewählt, und Link-Marker nacheinander ausgewählt.
   3. Klicken Sie auf das Farbfeld Markierung, und wählen Sie eine Farbe. Wiederholen Sie diesen Schritt für Link Farbe.
   4. Geben Sie Radien für die Markierung und Link-Modell-Bauelemente.
   5. In der Volume Tracer-Fenster, wählen Sie Platz Marker mit [right] Maustaste, und legen Radien für Marker und Links.
   6. Klicken Sie rechts auf den Volumendaten zur Festlegung Marker zu beginnen. Marker werden automatisch verbunden werden.
   7. In der Volume Tracer Dialog, wählen Sie Datei> Speichern aktuellen Marker-Set, dann Datei> Schließen Marker Set.
4. Öffnen Sie eine neue Markierung gesetzt (Schritt 1.3.1) ein Modell in eine zweite gewünschte Merkmal von Interesse zu beginnen. Nutzen Kontrastfarben zwischen Markersets auf Unterschiede in den Eigenschaften zu betonen.

2. Manuelle Tracing von interessierenden Merkmalen

Hinweis: Die Einzelheiten der Methode unten beschriebenen spezifischen Amira, aber auch andere Software-Pakete können stattdessen verwendet werden. Verwenden Sie diesen Ansatz, wenn die Bevölkerungsdichte relativ gering ist und wenn die Genauigkeit der Merkmalsextraktion ist von größter Bedeutung, da manuelle Rückverfolgung ist eine zeitraubende Ansatz.

1. Importvolumen von Daten in ein Programm mit manueller Rückverfolgung Optionen. Software mit dieser Fähigkeit bieten in der Regel zumindest ein grund Pinsel-Werkzeug.
   1. Für große Volumina oder Schichtaufnahmen (zB 16-Bit 2.048 x 2.048 oder größer .rec oder Schichtaufnahmen in .mrc IMOD generiert): Wählen Sie Open Data> Rechtsklick auf filename.rec> Format ...> Wählen Sie Raw als LargeDiskData > Ok> Laden. Wählen Sie den entsprechenden Rohdaten Parameter von Header-Informationen> Ok. Wechseln und Speichern unter einem neuen filename.am Datei für die Verwendung in den folgenden Schritten.
   2. Für kleinere 3D-Bildstapel-Dateien (zB, 3D-oder TIF-oder .mrc .rec): Open Data> Wählen filename.tif oder filename.mrc. Knebel und Rechtsklick> Speichern unter filename.am . Wenn ein Fehler generiert oder das Programm nicht mehr reagiert, kann die Datei zu groß sein und kann durch folgenden Schritt 2.1.1 geöffnet werden.
2. Navigieren Sie durch die Scheiben, um eine 3D-Untervolumen für die Segmentierung zu wählen, und dann auf diesen Bereich von Interesse zu beschneiden.
   1. Im 3D-Viewer-Fenster, wählen Sie Orthoslice Image-Datei zu öffnen. Verwenden Sie Schieberegler unten, um durch Scheiben zu navigieren.
   2. Um größere Daten als LargeDiskData geöffnet beschneiden, Kniedateinamen in Pool Fenster> Rechtsklick> LatticeAccess. Enter gewünschten Kastengröße> Übernehmen. Sparen Sie neue Datei.
3. Erstellen Segmentierung Datei.
   1. Schalten Sie die Datei in der Pool-Fenster> Rechtsklick> Beschriftung> Labelfield. Eine neue Datei wird erstellt und automatisch in der Registerkarte Segmentierung Editor geladen.
4. Verfolgen Sie die Grenze des ersten Merkmal von Interesse, dann füllen Sie den Spuren von Hand oder mit einem Befehl spezifisch für die verwendete Software. Folgen Sie dem Merkmal von Interesse durch alle Scheiben und wiederholen Sie den Handverfolgung Segmentierung. Verwenden Sie die folgenden Befehle bei der Verwendung von Amira:
   1. Um das Pinsel-Werkzeug verwenden, Pinselgröße ändern, wie gewünscht, dann verwenden Sie den Mauszeiger auf den Rand des Merkmal von Interesse zu verfolgen.
   2. Füllen Sie den Bereich mit verfolgt Abkürzung "f". Fügen Sie die Auswahl, indem Sie auf die Schaltfläche mit dem Plussymbol oder die Verknüpfung "a". Wenn nötig, drücken Sie "u" rückgängig zu machen, und "s" zu subtrahieren oder zu löschen.
5. Erzeugen eine Oberflächendarstellung zur Visualisierung und Grund qualitative oder quantitative Analyse pro Software-Benutzerhandbuch Unterricht.
   1. In der Objektpool Registerkarte, drücken Sie die Dateinamen-labels.am im Pool-Fenster> Rechtsklick> SurfaceGen.
   2. Wählen Sie die gewünschten Oberflächeneigenschaften> Übernehmen. Eine neue Datei wird filename.surf im Pool erstellt werden.
   3. Um die segmentierte Volumen visualisieren, Kippschalter filename.surf in Pool Fenster> Rechtsklick> Surface.
   4. Verwenden Sie die Werkzeuge in der 3DViewer Fenster verschieben, drehen, vergrößern und in der 3D-Volumen.
6. Entpacken Sie die genaue Dichte und bestimmen Messungen wie Volumen oder Fläche. Export in andere Programme für fortgeschrittene Anzeige, Analyse und Simulation.
   1. Auf 3DViewer Fenster auf Messen Werkzeug> Wählen Sie die entsprechende Option (2D-und 2D-Länge Winkel für Messungen an einem einzigen 2D-Ebene, 3D-Länge und 3D-Winkelfür Messungen an einem 3D-Volumen).
   2. Klicken Sie auf Netzoberfläche, um die gewünschte Länge, Abstand und Winkel zu messen. Die Werte werden im Fenster Eigenschaften aufgelistet werden.

3. Automatisierte dichtebasierte Segmentierung

Hinweis: Die Einzelheiten der Methode unten beschriebenen spezifischen Amira, aber auch andere Software-Pakete können stattdessen verwendet werden.

1. Verwenden Sie diesen Ansatz auf Datensätze mit jeder Sorte von Kontrast, Schärfe oder Gedränge, um die Dichten von Interesse zurücktreten.
2. Importvolumen von Daten in ein Programm mit Schwellen, Zauberstab oder anderen Werkzeugen Dichte-basierte automatische Segmentierung ausgestattet. Folgen Sie den Schritten in 2.1-2.1.2 in die Richtungen für die manuelle Rückverfolgung skizziert.
3. Navigieren Sie durch Scheiben und wählen Sie Bereich für die Segmentierung. Wenn nötig, schneiden Sie einen kleineren 3D-Teilvolumen für die Segmentierung. Folgen Sie den Schritten in 2.2-2.2.2 in die Richtungen für die manuelle Rückverfolgung skizziert.
4. Wählen Sie die Dichte vonein Merkmal von Interesse, in der Regel durch Anklicken oder Anbringen einer Markierung oder Ankerpunkt auf der Funktion. Wenn in der Software erlaubt, geben Sie eine Zahl Bereich umfasst Pixelintensität des Features und passen diese Toleranz, wie gewünscht. Dichten zu dem Merkmal gehört, wird in Übereinstimmung mit der Intensität des Pixels oder Toleranzwert des Ankers aufgenommen wird. Verwenden Sie die folgenden Befehle bei der Verwendung von Amira.
   1. Verwenden Sie den Zauberstab für Features mit unterscheidbaren Margen.
      1. Klicken Sie auf den Bereich von Interesse, dann Schieberegler im Display und Masking einstellen, um die korrekte Wertebereich zu erfassen, so dass die Funktion vollständig markiert ist. Auswahl hinzuzufügen Verknüpfung mit "a".
   2. Verwenden Sie den Threshold-Tool für Funktionen, ohne sich deutlich Margen.
   3. Wählen Sie den Threshold-Symbol. Stellen Sie Schieberegler, um Dichte innerhalb wünschenswerten Bereich so einstellen, dass nur die Merkmale von Interesse sind maskiert. Klicken Sie auf Select-Taste und dann Auswahl hinzuzufügen Verknüpfung mit220; a ".
   4. Zu Segment gesamte Volumen, wählen Sie Alle Scheiben vor der Zugabe Auswahl.
   5. So entfernen Sie Rauschen, wählen Segmentation> Entfernen Inseln und / oder Segmentierung> Glatte Etiketten.
5. Erzeugen eine Oberfläche für die Visualisierung und qualitative Analyse, wie im Handbuch beschrieben Verfolgung Abschnitt 2.6-2.6.2. Wenn gewünscht, den Export in andere Programme für ausreichend 3D-Display, quantitative Analyse und Simulationen.

4. Maßgeschneiderte Automatisierte Segmentierung

Hinweis: Verwenden Sie diesen Ansatz, um kundenspezifische Skripte für die automatische Segmentierung, die Erfahrungshintergrund in der Informatik die Möglichkeit, eine genaue Dichtemodell aus einem großen Volumen zu erstellen erfordert, sondern ermöglicht erstellen.

1. Werkzeuge (spezielles Beispiel des Shape-Betreute Segmentierung in MATLAB ²⁷⁾
   1. Bildvorverarbeitung: Führen Entrauschen, Hintergrundentfernung und Bildverbesserungmit der folgenden Rohrleitung:
      1. Laden Sie das Bild mit dem Befehl imread.
         1. In der Befehlszeile eingeben: >> im = imread ($ image_path), wobei $ image_path ist die Lage des Bildes analysiert werden.
      2. Von der Bildverarbeitung Toolbox, rufen Wiener-Filter mit einem geschätzten oder bekannten Rausch-power-to-Signal-Verhältnis (NSR).
      3. Auf der zuvor bearbeiteten Bild, rufen Sie die Bildöffnungsfunktion IMOPEN auf die Hintergrundebene zu schätzen, dann zuteilen, das Ergebnis als eine andere Maske.
         1. In der Befehlszeile eingeben:. >> Hintergrund = IMOPEN (im, Strel ($ shape_string, $ size)), in diesem Verfahren, ist $ shape_string gleich 'Festplatte' der Variablen $ Größe wird durch den Analysator gegeben dh >> Hintergrund = IMOPEN (im, Strel ('disk', 15)).
      4. Subtrahieren des gefilterten Bildes mit dem Hintergrund.
         1. In der Befehlszeile eingeben: >> im2 = im -Hintergrund
      5. Abhängig von der Qualität der Ergebnisse, führen Bildnormierung mit oder ohne adaptive Otsu-Verfahren ^28, die mit der Funktion imadjust von der Bildverarbeitungs Toolbox aufgerufen werden können.
         1. In der Befehlszeile eingeben: >> im3 = imadjust (IM2)
      6. Bereiten Sie die Merkmale von Interesse für die Segmentierung, die Begrenzung der Bereiche von Interesse durch Zuschneiden des normalisierten Bildes.
         1. Mit dem Befehl imtool, erkunden Sie die Region von Interesse, die beschnitten werden soll, und geben Sie die Koordinaten für den Befehl: >> im3_crop = imcrop (im3, [x1 y1 x2 y2]), wo der Vektor [x1 y1 x2 y2] entspricht das Quadrat Region abgeschnitten.
   2. Formerkennung / Betreute Form Klassifizierung: Trainieren Sie den Algorithmus durch konkrete Beispiele für jede andere Kategorie von Objekten (lineare Spuren in einem 2D-Bild über die Merkmale von Interesse).
      1. Prüfen Sie, ob VLFEAT ²⁹ API erfolgreich installiert wurde und besuchen Sie die Website VLFEAT für tiefer gehende Dokumentation.
      2. In der Befehlszeile eingeben: >> [BAUM, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, $ K $ NLEAVES) wobei $ K ist die Anzahl der Cluster verwendet werden soll oder die Anzahl der Klassen der Beobachter will die Daten in zu arrangieren, und $ NLEAVES ist die gewünschte Anzahl von Blattgruppen, dh >> [BAUM, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4.100)
      3. Verwenden Sie manuell segmentiert Funktionen als Eingabe für VLFeat.
         HINWEIS: Dieses Open-Source-C-basierte Bibliothek wird in Abhängigkeit von der Art der gewählten Methode am besten für den Datensätzen arbeiten Pixel Patch, Patch-Cluster und Cluster-Zentrum Positionierung durchzuführen. Die verfügbaren Optionen reichen von k-Mittelwert-Clustering zu Texton Basierte Ansätze ³⁰ und der Ausgang ist eine Zahlenmatrix, die von den gewünschten Eigenschaften für den gegebenen Exemplare anhand beschreibt.
2. Segmentierung: Verwenden Sie diese fuLLY automatisierten zwar rechenintensiv, Ansatz Segment mehrere Klassen von Objekten gleichzeitig, die als getrennte Karten für die weitere Analyse und Visualisierung geschrieben wird.
   1. Laden Sie die zuvor erzeugte Zahl Array (Modell).
   2. Rufen Sie die Support-Vektor-Maschine (SVM)-Funktion in VLFeat, mit dem Modell und das Bild als Eingangs segmentiert werden.
      1. In der Befehlszeile eingeben: >> [w, b] = vl_svmtrain (x, y, 0,1), wobei x die ursprünglichen Bildausschnitt im2_crop und y ist das Ziel, dem Bild, das manuell segmentiert wurde. Verwenden Sie >> ISEG = VL_IMSEG (I, Etiketten), die Ergebnisse nach den von der Clusterbildung erzeugt Etiketten zu färben.
         HINWEIS: Auf der Grundlage der Merkmale des Modells, werden VLFeat das Bild auf der Anzahl der Klassen zu klassifizieren (Merkmale von Interesse) von Anfang an zugeordnet. Je nach dem Grad der gewünschten Genauigkeit, ist es möglich, dieses Verfahren mit anderen Ansätzen oder Schätzung CLUST kombinierener Parameter wie Rumpf und Clusterzentren. Der Ausgang der SVM-Algorithmus ist ein Wahrscheinlichkeitsmodell und mehrere binäre Masken der gewünschten Klassen in den neuen Datensätzen.
   3. Ergebnisse speichern, indem Sie den Befehl: >> imwrite (im, $ format, $ filename), wobei $ Format ist 'tiff' und $ filename ist der Pfad für die Ausgabedatei.
   4. Zur Visualisierung von Bildern, geben Sie den Befehl: >> imshow (im).

Results

Abbildung 1 zeigt einen typischen Workflow für 3D-Elektronenmikroskopie zelluläre Bildgebung, darunter Elektronentomographie, FIB-SEM und SBF-SEM. Der Workflow umfasst Roh-Datenerfassung, Datenabgleich und Rekonstruktion in einem 3D-Volumen, Rauschunterdrückung durch Filterung, und wenn notwendig, Zuschneiden in die Region von Interesse, um die Wirksamkeit der gewählten Segmentierung Software zu maximieren. Solche aufbereiteten Daten ist dann für die Merkmalsextraktion / Segmentierung bereit.

Figur 2 veranschaulicht den Arbeitsablauf in Figur 1 mit vier verschiedenen Datensätzen (die weiter unten eingeführt wird), von denen zwei in Harz eingebetteten Proben durch Elektronentomographie (2A, 2B) aufgezeichnet gelegt, wobei die beiden anderen die sich aus FIB -SEM und SBF-SEM, bzw. (2C, 2D). Bilder in Abbildung 2 Spalte 1 sind ProjektionsAnsichten (Bilder 2A1, 2B1) und Blockoberflächenbilder (Abbildungen 2C1, 2D1) sind, die auf die Ausrichtung und den Wiederaufbau in ein 3D-Volumen zusammengesetzt. Spalte 2 zeigt Schnitte durch eine solche 3D-Volumen, das beim Filtern (Spalte 3) zeigen eine signifikante Geräuschreduzierung und damit oft erscheinen knackig. Nach Auswahl und das Abschneiden der großen 3D-Volumen in die Region von Interesse (Spalte 4), können 3D-Renderings von segmentierten Merkmale von Interesse (Spalte 5) erhalten und weiter untersucht, farbcodierte und quantitativ analysiert.

Insgesamt sechs 3D-Datensätzen, die jeweils einen Stapel von Bildern entweder durch Elektronentomographie (3 Datensätze) erhalten, FIB-SEM (2 Datensätze) oder SBF-SEM (Datensatz 1) verwendet werden, wie jedes der Vergleichs Die vier Segmentierungsverfahren auszuführen (Figur 3). Die Datensätze stammen aus einer Vielzahl von verschiedenen Forschungsprojekte im Labor und somit areasonably vielfältige Reihe von typischen experimentellen Datensätzen. Alle Datensätze wurden von vier unabhängigen Forschern, von denen jeder am meisten vertraut mit einer bestimmten Ansatz untersucht werden, und sie wurden mit der Bereitstellung der bestmögliche Ergebnis für jeden der sechs Datensätzen berechnet.

Die Datensätze werden aus Proben wie folgt: 1. Die Zahlen 3A1-3A5: Hochdruck-gefroren, gefrier ersetzt und in Harz eingebetteten Küken inneren Haarzelle Stereozilien ^31, 2. Die Zahlen 3B1-3B5: Hochdruck-gefroren, gefrier substituierten und Harz eingebetteten Pflanzenzellwand (unveröffentlicht), 3. Die Zahlen 3C1-3C5: Hochdruck-gefroren, gefrier ersetzt und in Harz eingebetteten inneren Haarzelle Kinozilium (unveröffentlicht), 4. Die Zahlen 3D1-3D5: Hochdruck- eingefroren, gefrier ersetzt und in Harz eingebetteten Blöcken von Mitochondrien in der menschlichen Brustdrüse Epithelzellen HMT-3522 S1 Acini, die in Laminin reiche extra kultiviert wurden entferntdere Matrix ^32,33, 5. Figuren 3E1-3E5: unbefleckt Tisch-Entwicklung, in Harz eingebetteten Blöcke einer Sulfatreduzierer bakterielle Biofilme (Manuskript in Vorbereitung) und 6. Die Zahlen 3F1-3F5: Membran Grenze der benachbarten Zellen der HMT -3522 S1 Acini.

Wie aus Figur 3 ersichtlich ist, können verschiedene Ansätze zur Segmentierung meist ähnliche Ergebnisse für einige Datensatztypen, aber völlig unterschiedliche Ergebnisse für andere Datentypen führen. Zum Beispiel kann die Haarzelle Stereozilien Datensatz (3A) ergibt angemessenen Segmentierung Bände mit allen vier Ansätze, mit dem manuellen Modell abstrahiert von einem Experten Benutzer in der die klarste zu interpretieren und zu messen erzeugt. In diesem Fall kann ein solches Modell zur schnellen Messung der Fadenfadenabstände, Zählen der Anzahl der Verbindungen zwischen den länglichen Filamenten gefunden, sowie die Bestimmung von Fehlstellen der Dichtekarte entsprechendezu Orten, an denen die Probe bei der Probenvorbereitung ³⁴ beschädigt. Solche Informationen sind viel schwieriger mit den anderen drei Segmentierungsansätze erwerben, obwohl die maßgeschneiderte automatisierte Segmentierung liefert bessere Ergebnisse als die Schwellendichte rein Basis.

Für die Pflanzenzellwand (3B), erschienen Handbuch Modellgeneration zu sein zu den effizientesten vermitteln ein Gefühl der Ordnung in der Zellwand, die keine der anderen Ansätzen zu erzielen. Allerdings ist die abstrahierte Modell nicht das Gedränge der Objekte in der Datenmenge zu erfassen. Manuell Tracing Merkmale von Interesse scheint ein besseres Ergebnis als die Dichte-basierte oder Form-überwacht Ansätze geben. Andererseits ist die manuelle Verfolgung sehr arbeitsintensiv und Identifizieren Grenzen der Merkmale ist etwas subjektiv. Daher kann automatisiert Ansätze zur Segmentierung großen Mengen mit einem möglichen Kompromiss zwischen Genauigkeit und bevorzugtRessourcen aufgewendet manuelle Segmentierung.

Für die Kinozilium Datensatz (3C), ergibt manuelle abstrahierten Modellgeneration die sauberste Ergebnis und zeigt eine unerwartete Architektur der drei Mikrotubuli in der Mitte des Kinozilium, ein Detail, das in den abgeschnittenen Daten gut sichtbar ist, aber in allen anderen Ansätzen verloren , vermutlich aufgrund der Heterogenität zu färben. Jedoch sind auch andere potentiell wichtige Merkmale der Dichteverteilung in der manuellen Erzeugung eines abstrakten Modell verfehlt. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass die subjektive Natur des manuellen Modellbildung führt zu einer Idealisierung und Abstraktion der tatsächlich beobachteten Dichte und somit zu einer subjektiven Interpretation während der Modellbildung. Daher schön zeigt dieses Beispiel, wie Hand abstrahierten Modellgeneration ermöglicht es, auf einen spezifischen Aspekt des 3D-Volumens zu konzentrieren. Die selektive Wahrnehmung und Vereinfachung fehlt aber eine vollständige Berücksichtigung aller Protein Zusammenarbeit gebenmplexe im Datensatz vorhanden. Daher wird, wenn das Ziel ist, die Komplexität der Daten zeigen, dann ist man besser mit einem der anderen drei Ansätze bedient.

In dem Fall der 3D-Matrix kultiviert Brustdrüse Acini (3D), sind die hohen Kontrast Mitochondrien von allen vier Ansätze leicht segmentiert, wobei die manuelle Verfolgung von Merkmalen nicht allzu überraschend ergab die besten Ergebnisse mit der niedrigsten Menge an Verunreinigung ( Abbildung 3D3). Allerdings ist manuelle Rückverfolgung sehr arbeitsintensiv und ist daher nur bedingt für große Volumina. Beide Dichteschwelle-basierte und Form überwachte automatische Segmentierung extrahieren die Mitochondrien ganz gut, und würde in einer nahezu perfekten Segmentierung führen, wenn weitere Tricks für Aufräumarbeiten beschäftigt sind (zB die Beseitigung aller Objekte unter einer bestimmten Schwelle von Voxel-Dichte) als verfügbar in verschiedenen Paketen. In diesem Fall hat Hand abstrahierten Modell Gebäude nicht nachgebenvielversprechende Ergebnisse, zum Teil, weil die Mitochondrien können nicht einfach mit Ball und Stock-Modelle angenähert werden.

In Bezug auf die bakterielle Bodengemeinschaft / Biofilm (3E), drei der vier Ansätze ergeben vernünftige Ergebnisse, mit den manuellen Modellgeneration keine gute Leistung auf Grund der Herausforderung, die biologische Objekte, wie zum Beispiel Bakterien, durch geometrische Formen. Extrazelluläre Anhängsel aus den Bakterien stamm im automatisierten Segmentierungsansätze ermittelt werden, aber nicht so gut in der Handmerkmalsverfolgung. Shape-Aufsicht maßgeschneiderte automatisierte Segmentierung weiter trennen die extrazelluläre Funktionen aus den Bakterien trotz ähnlicher Dichten (Daten nicht gezeigt), was eine einfache Quantifizierung sogar von extrem großen Datenmengen. Denn das ist ursprünglich eine sehr große Datenmenge, die maßgeschneiderte automatisierte Segmentierung deutlich outcompeted alle anderen Ansätze, kann aber von der geringen Komplexität profitiert habenund die relativ spärliche Verteilung der Objekte von Interesse (niedrig Gedränge).

Bei der Prüfung der Schnittstelle zwischen zwei eukaryotischen Zellen in einer gewebeähnlichen Rahmen (3F), nur das manuelle Verfolgung der Merkmale von Interesse erzeugt gute Ergebnisse. Automatisierte Dichte-basierte Segmentierungsansätze versagen, um die Membran Grenze zwischen benachbarten Zellen überhaupt zu erkennen, und auch die maßgeschneiderte Ansätze scheitert, zum Teil, weil die Form einer Zelle wird nicht leicht angenähert oder mit Formen gleichgesetzt, trotz ihrer klaren Erfolg für die Bakterien im Biofilm (Abbildung 3E5).

Die Beobachtung von Abbildung 3, dass die Segmentierungsansätze tun gut auf einigen Datensätzen, aber nicht auf andere führte zu der Frage, was kennzeichnet jede dieser Datensätzen, und ob es möglich sei, die Arten von Dateneigenschaften oder persönliche Ziele, die zu kategorisieren erschienen gut überein mit ihren JEWEILIGENe-Ansatz. Systematische Studie zu diesem Thema wurde bisher nicht durchgeführt worden ist, und damit in einem ersten Schritt eine Einrichtung einer empirischen Liste der Bildeigenschaften und persönlichen Ziele kann ein Anfänger in ihrem Versuch, den besten Ansatz zur Merkmalsextraktion der jeweiligen Datensatzes zu finden führen.

Acht Kriterien identifiziert wurden als signifikant sind in Abbildung 4 dargestellt ist, und sie können in zwei Hauptkategorien unterteilt werden: (1) die Merkmale, die die sich aus der Datenmenge sind, und (2) persönliche Ziele der Forscher und andere Überlegungen, die etwas mehr sind subjektive, wenn auch gleichermaßen wichtig. Die gezeigten überwiegend aus den sechs Datensätzen in Abbildung 3 gezogen, mit drei zusätzlichen Datensätzen eingeführt Beispiele: ein (Abbildung 4A1) ist ein Kryo-Tomogramm eines Kryo-Abschnitt von Arabidopsis thaliana Pflanzenzellwand, die zweite (Abbildungen 4A2 , 4B1, 4D1 den Abbildungen dargestellt 3F1-3F5 passen könnte, ist aber noch wesentlich komplexer ist, und die dritte (Abbildungen 4B2 , 4D2) ist ein Harz-Abschnitt Tomogramm von Innenohr-Haarzellen Stereozilien in Querschnittsansicht, ähnlich der in Längsansicht in Figuress 2A1-2A5 und 3A1-3A5 gezeigt Sample-Content.

Für die Kategorie der objektiven Kriterien wie die Bildeigenschaften, vier Züge inhärent in den Datensätzen werden vorgeschlagen, um von Bedeutung zu sein:

1. Die Daten Kontrast (1) gering (Abbildung 4A1) sein, wie es typisch für Kryo-EM-Schnittbilder, (2) Zwischenstufe (Abbildung 4A2), wie in der Zell-Szenerien ohne klare Organelle oder andere prominente Funktion stehend, oder (3) Hoch (Abbildung 4A3), wie es der Fall für die kinociLiary Tomogramm oder Stereozilien im Querschnitt aufgrund der Ausrichtung deutlich getrennt Fadenelemente in z-Richtung.
2. Die Daten können Fuzzy (Abbildung 4B1), ohne sichtbare klare Grenzen zwischen zwei eng positionierte Objekte sein, wie Zellen in einem Gewebe oder knackig (Abbildung 4B2), mit scharf definierten Grenzen. Dies ist zum Teil eine Funktion des Datensatzes Auflösung, die um einen Faktor von etwa 2-4 für die Elektronen Tomogramme Vergleich zu FIB-SEM inhärent höher ist. Natürlich sind schärfere Grenzen wünschenswert für die manuelle als auch automatisierte Segmentierungsansätze, aber entscheidend für die letztgenannte Ansatz.
3. Die Dichtekarten können entweder überfüllt (Abbildung 4C1), wie von den eng aufeinanderPflanzenZellWandBestandTeilen reflektiert wird, oder dünn besiedelten (Abbildung 4C2) sein, ebenso wie die Bakterien in einer Kolonie, die die Trennung, die automatisiert Putze Bildsegmentierung wesentlich leichter veranschaulicht.
4. Dichtekarten kann sehr komplex mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften oft mit unregelmäßigen Formen, wie der Stria vascularis Gewebe um ein Blutgefäß (Figur 4D1) oder gut definierte Organell artigen Gegenständen mit einer ähnlichen Organisation wie der Stereozilien im Querschnitt sein ( Abbildung 4D2).

Beachten Sie auch die sehr unterschiedlichen Skalen in den verschiedenen Beispielen, so dass der Vergleich etwas schwierig.

Neben den mehr objektive Kriterien wie die Bildeigenschaften, vier sehr subjektiven Kriterien, die die Auswahl des geeigneten Weg führen wird ebenfalls vorgeschlagen:

1. Wunschziel: Das Ziel kann sein, die Haarbündel Stereoziliums in seiner Komplexität zu visualisieren und zu bestimmen und zu untersuchen, die die Form des Objekts (Abbildung 4E1) oder eine vereinfachte und abstrahierte Ball und Stick-Modell, das in die Dichtekarte erstellen und gebaut wird ermöglicht ein schnelles Zählen einnd Messung der geometrischen Objekte (Fadenlänge, Entfernung und Anzahl der Verbindungen) (Abbildung 4E2).
2. Das Merkmal kann stark unregelmäßige Morphologie und komplexen wie Zellen, wie Zell-Zell-Wechselwirkungszonen (Abbildung 4F1), etwas ähnlich mit einigen Variationen geformt, wie Mitochondrien (Abbildung 4F2) oder überwiegend identisch geformt wie Aktinfilamente und Flanke Links in einem Haarbündel in Längsausrichtung (Abbildung 4F3).
3. Der Anteil der Funktion von Interesse (Bevölkerungsdichte) ist wichtig, da man Segment alle Funktionen in einem 3D-Datensatz möchten Sie vielleicht, wie es der Fall für die Pflanzenzellwände (Abbildung 4G1) oder nur einen winzigen Bruchteil des Zellvolumens wie im Fall von Mitochondrien in einer heterogenen Zell Szene (Bild 4G2). Abhängig von der Größe des Datensatzes und des Prozentsatzes der Volumen, Segmentierung erfordert, kann es am effizientesten zu verwendenmanuelle Ansätze. In anderen Fällen, beispielsweise wenn man sich für eine Vielzahl von Funktionen ist, gibt es keine Alternative zur Verwendung von halbautomatischen Segmentierungsansätze.
4. Ein weiteres Schlüsselkriterium ist die subjektive Menge an Ressourcen man bereit ist, in den Segmentierungsprozess zu investieren, ist und in welcher Höhe der Treue erforderlich ist, um eine biologische Frage zu beantworten. Man kann wollen und brauchen, um volumetrische Parameter einer Funktion (wie Größe, Volumen, Oberfläche, Länge, Abstand zu anderen Funktionen, etc.) zu quantifizieren, in welchem ​​Fall mehr Sorgfalt erforderlich, um eine genaue quantitative Informationen (Abbildung 4H1) zu erhalten, oder der Zweck auch sein mag, lediglich ein Bild von seinem 3D-Form (Abbildung 4H2) einrasten. In einer idealen Welt, in der Ressourcen unbegrenzt sind, eine deutlich würde nicht wollen, keine Kompromisse zu machen, aber für die genaueste Weg der benutzergeführten manuellen Merkmalsextraktion nicht entscheiden. Während dies für viele Datensätze arbeiten, in naher Zukunft 3D-Volumen wil l in der Größenordnung von 10k sein von 10k von 10k oder höher und manuelle Segmentierung nicht mehr in der Lage, eine herausragende Rolle bei der Segmentierung eine so große Raum zu spielen. Abhängig von der Komplexität der Daten und andere Daten Merkmale können halbautomatischen Segmentierung einer Notwendigkeit geworden.

In Figur 5 sind Stärken und Schwächen kurz für die vier Segmentierungsansätze aufgeführt. Die persönlichen Ziele und die Bildeigenschaften in Abbildung 4 identifiziert, die mit jedem Ansatz koppeln können, werden als gut beschrieben. In Abbildung 6 sind die persönlichen Ziele und die Bildeigenschaften der sechs Datensätze exemplarisch, wie die Daten zu sichten und zu entscheiden, über die beste Vorgehensweise. Beide Figuren 5 und 6 werden auf in der Diskussion erweitert.

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Abbildung 1. Workflow für biologische Bildgebung Rekonstruktion und Analyse. Diese Tabelle gibt einen Überblick über die verschiedenen Schritte zur Erfassung und Verarbeitung von Bildern durch Tomographie gesammelt, Focused Ion Beam SEM und Serienblockfläche SEM. Rohdatenerhebung Ergebnisse in 2D Kippserie oder Serienschnitte. Diese 2D-Bildsätzen ausgerichtet werden muss und rekonstruiert in 3D, dann um das Rauschen zu reduzieren und den Kontrast von interessierenden Merkmalen gefiltert. Schließlich können die Daten segmentiert und analysiert, was letztlich zu einem 3D-Modell werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2.. Beispiele für Workflow für verschiedene Datentypen aus Tomografie und FIB-SEM jedem Schritt der Workflow nach der Datenerfassung wird durch vier Datensätzen (Zeilen AD) gezeigt: Harz eingebettet Bunt Tomographie von Längsschnitt Stereozilien, Harz eingebettet Bunt Tomographie von Pflanzenzellwand Zellulose, FIB-SEM von Brust-Epithelzellen Mitochondrien und SBF-SEM von E. coli-Bakterien. Ein 2D-Schnitt durch den Rohdaten ist in Spalte 1 gezeigt, und ein Bild von den Daten nach der Ausrichtung und 3D-Rekonstruktion umfasst Spalte 2. Die Filtertechniken in der Spalte 3 angewendet, sind die folgenden: Medianfilter (A3), nicht-anisotropen Diffusionsfilter (B3), Gaußsche Unschärfe (C3) und MATLAB imadjust Filter (D3). Ein Beispiel für die beste Segmentierung für alle Daten aus der zugeschnittene Bereich von Interesse (Spalte 4) festgelegt ist, wie ein 3D-Rendering in Spalte 5 Maßstabsbalken angezeigt: A1-A3 = 200 nm, 150 nm = A4, A5 = 50 nm, B1-B3 = 200 nm, B4-B5 = 100 nm, C1-C3 = 1 mm, C4-C5 = 500 nm,D1-D3 = 2 mm, D4-D5 = 200 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Anwendung der vier Segmentierungsansätze beispielsweise Datensätze Sechs beispielsweise Datensätze wurden von allen vier Ansätze segmentiert. Manuelle abstrahierten Modellgeneration, manuelle Rückverfolgung, automatische Segmentierung Dichte-basiert und maßgeschneiderte automatisierte Segmentierung. Hand abstrahierten Modellgeneration war wirksam für den Embedded-Bunt Tomographie Stereozilien (A)-Harz, in dem der Zweck war es, ein Modell für quantitative Zwecke nicht zu schaffen, um Dichten zu extrahieren. Für das Harz eingebettet gefärbten Tomographie von Pflanzenzellwand (B), automatisierte segmenta dichtebasiertetion war die effektivste Methode, um die Cellulose schnell extrahieren durch viele Scheiben, wo, wie die manuellen Methoden nahm viel mehr Aufwand auf nur ein paar Scheiben von Daten. Hand abstrahierten Modellgeneration erzeugt die Mikrotubuli-Triplett im gefärbten Tomographie Kinozilium (C), während andere Segmentierungsverfahren nicht taten, doch die zwei automatisierte Ansätze extrahiert die Dichten schneller und wurden daher bevorzugt. Aufgrund der Form der Mitochondrien von FIB-SEM von Brust-Epithelzellen (D), vorausgesetzt, manuelle Rückverfolgung die sauberste Ergebnis und der geringen Bevölkerungsdichte in Verbindung mit der Nutzung der Interpolationsverfahren für die schnelle Segmentierung erlaubt. Angesichts des großen Volumens, das segmentiert werden benötigt, erwies maßgeschneiderte automatisierte Segmentierung als am wirksamsten zur Segmentierung des SBF-SEM Bakterien Daten (E), aber beide automatische Ansätze waren vergleichbar. Obwohl zeitaufwendig, war die einzige Methode, um die FIB-SEM von Brust-Epithelzellen Membran (F) zu extrahieren Handverfolgung Maßstabsbalken.:A1-A5 = 100 nm, B1-B5 = 100 nm, C1-C5 = 50 nm, D1-D5 = 500 nm, E1-E5 = 200 nm, F1-F5, Balken = 500 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine Größere Version der Figur.

Abbildung 4. Ziel die Bildeigenschaften und subjektiven persönlichen Ziele für die Selektierung von Datensätzen. Anhand von Beispielen des Datensatzes Merkmale, Kriterien vorgeschlagen, eine Entscheidung, welche Segmentierungsansatz zu verwenden, zu informieren. In Bezug auf die objektiven Merkmale, können die Daten, die von Natur aus dagegen niedrig, mittel oder hoch (A1-A3), werden unscharf oder knackig (B1-B2), heraus gesperrt oder überfüllt (C1-C2) und haben komplexe oder einfach organisierten Funktionen (D1-D2). Subjektive persönliche Ziele sind die gewünschten o IEL-Targeting ein vereinfachtes Modell oder Extraktion der genauen Dichten (E1-E2), Identifizierung eines gewundenen Blatt, gewundenen Volumen oder lineare Morphologie als Merkmal von Interesse (F1-F3), die Wahl eines hohen oder niedrigen Bevölkerungsdichte des Merkmals von Interesse (G1-G2) und der Entscheidung über die Trade-off zwischen High-Fidelity-und High-Ressourcenzuweisung für eine abnehmende Rendite auf Investitionen wie Zeit (H1-H2) Skala Bars:. A1 = 50 nm, 1500 nm = A2 , A3 = 100 nm, B1 = 1500 nm, B2 = 200 nm, 100 nm = C1, C2 = 200 nm, D1 = 10 mm, D2 = 200 nm, E1 = 100 nm, E2 = 50 nm, F1-F2 = 500 nm, 50 nm F3 =, G1 = 100 nm, G2 = 1 mm, H1-H2 = 100 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5. Vergleichstabelle der Dateneigenschaften und subjektiv für verschiedene Segmentierungsansätze geeignete Ziel. Dieser Tabelle sind die Stärken und Schwächen der einzelnen Segmentierungsansatz. Die Kriterien von Abbildung 4 kann helfen, festzustellen, welche Datensätze für die Segmentierungsverfahren sind. Diese objektiven und subjektiven Bildeigenschaften persönlichen Ziele wurden für die optimale Nutzung der einzelnen Ansätze gewählt, aber verschiedene Kombinationen behindern oder unterstützen die Effizienz der Segmentierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. Entscheidung Flussdiagramm für eine effiziente triage von Segmentierungsansätze für Datensätze mit unterschiedlichen Eigenschaften. Basierend auf die Merkmale in Abbildung 4 hervorgehoben, zeigt dieses Diagramm die vier Kriterien am meisten zur endgültigen Entscheidung über die besten Segmentierungsansatz für alle Daten aus Abbildung 3 beigetragen. Jeder Datensatz wird farbkodiert, um schnell folgen die kühnen Linien, die die primäre Entscheidungsprozess, sowie die gestrichelten Linien, die einen alternativen Weg, das kann oder nicht im gleichen Ansatz führen kann reflektieren. Die Kinozilium, Bakterien und Pflanzenzellwand-Daten wurden am besten mit den beiden automatischen Ansätze unterteilt. Im Gegensatz dazu die Zellmembran und Mitochondrien Wege immer auf manuelle Verfolgung führen aufgrund ihrer schwierigen Eigenschaften. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Effektive Strategien für die Gewinnung von relevanten Merkmalen aus 3D EM Volumina dringend erforderlich, um mit der Daten Tsunami, der vor kurzem getroffen hat biologische Bildgebung erforderlich halten. Während Daten kann in Stunden oder Tagen erzeugt werden, dauert es viele Monate, um die 3D-Volumen in der Tiefe zu analysieren. Daher ist es klar, dass die Bildanalyse wurde zum Engpass für wissenschaftliche Entdeckungen; ohne angemessene Lösungen für diese Probleme, Imaging Wissenschaftler werden Opfer ihres eigenen Erfolgs. Dies ist zum Teil auf die hohe Komplexität der Daten und auch das makromolekulare Verdrängung typischerweise in biologischen Zellen, in denen Proteine ​​und Proteinkomplexe aneinander angrenzen und im wesentlichen als kontinuierlicher Gradient von Graustufendichten angezeigt gefunden. Das Problem wird durch die Probenvorbereitung und Imaging Unvollkommenheiten kompliziert, und in einigen Fällen Bildrekonstruktionsartefakte, die zu weniger als perfekt volumetrischen Daten, die Herausforderungen für die vollautomatische Ansatz darstellen könnenES. Wichtigsten jedoch ist die Tatsache, dass die Experten in der Probenvorbereitung, Imaging, und der biologischen Interpretation nur selten gut in Computational Science versiert sind und daher Hinweise, wie effektiv nähern Merkmalsextraktion und Analyse. Deshalb durch den Einsatz von verschiedenen Beispielen, erklärt das Protokoll, wie Daten für die Segmentierung sowie die Schritte für die manuelle abstrahierten Modell Generierung, die automatische Segmentierung Dichte-basierte, manuelle Rückverfolgung von interessierenden Merkmalen und maßgeschneiderte automatisierte Segmentierung vorzubereiten. Die manuellen und automatischen Ansätze in dem Verfahren beschrieben in einer Vielzahl von Segmentierungs Software, von denen einige hier erwähnt gefunden werden, aber andere ähnliche Funktionen und sind gleichermaßen gut geeignet.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Wirksamkeit von jedem der 3D-Segmentierungsansätze variiert für jede andere Art von Datensätzen. Obwohl die verschiedenen Ansätze qualitativ produziert similar 3D-Renderings als Endprodukt, die Menge an Zeit und Mühe auf jede verbrauchte während des Segmentierungsprozesses erheblich variiert. Die Empfehlungen für geeignete Bildeigenschaften und persönlichen Ziele pro Segmentierungsansatz sind in Abbildung 5, die in den folgenden vier Unterabschnitten näher erläutert wird zusammengefasst. Diese Kriterien wurden auf die sechs Datensätze Obwohl die 5 aufgebracht, wie in der Entscheidung Flussdiagramm von 6 gezeigt. Und 6 sind lediglich dazu da, um eine Begründung für jeden Datensatz liefern und wie die einzelnen Kriterien wurden in den Entscheidungsprozess gewichtet, bieten sie nicht eine narrensichere Anleitung, sondern ein Ausgangspunkt. Es gibt einfach zu viele Kriterien, die die Entscheidungsprozesse beeinflussen: einige sind objektive Kriterien, wie beispielsweise Daten-Set Eigenschaften, während andere eher subjektive Kriterien, wie das angestrebte Ziel. Es ist sicher zu sagen, dass die Datenmengen, die einen hohen lev anzeigenel Kontrast mit scharfen klaren Grenzen, haben Eigenschaften, die auch getrennt und relativ homogene (nicht zu unterschiedlich) sind, und werden mit dem Ziel der Darstellung einer Dichtemodell für eine große Anzahl von Objekten verarbeitet, werden automatisierte Ansätze überlegen sein, wenn nicht für die Tatsache, dass manuelle Ansätze würde einfach Ressource (Zeit) -prohibitive sein. Auf der anderen Seite, wenn Kontrast niedrig ist, ist die Daten unscharf und erfordert Wissen eines Experten, sind die Objekte überfüllt, und die Merkmale zeigen eine hohe Vielfalt und sind somit heterogene So kann man keine andere Wahl als die manuelle Merkmalsextraktion / Segmentierung.

Hand Abstracted Model Generation

Hand abstrahierten Modell-Tracing ist besonders wirksam bei der Segmentierung lineare Elemente, die Bereitstellung Samen Punkte (Kugeln), die automatisch verbunden werden können (Sticks). Wie Bälle und Stöcke-Modelle können sehr mächtig, um eine Länge zu messennd Ausrichtung eines solchen Modells und bieten eine ausreichend abstrahiert Modell für qualitative Prüfung und quantitative Analyse. Hand abstrahierten Modellgeneration wird häufig verwendet, wenn die Minimierung Ressourcen auf der Analyse verbracht ist wichtiger als absolute Treue zu den Formen der ursprünglichen Daten. Es ist am erfolgreichsten mit linearen und homogenen Merkmale von Interesse (zB Filamente, Rohre). Daten hingegen Knusprigkeit und Gedränge nicht eine große Rolle spielen bei der Bestimmung den Erfolg dieser Methode, so lange wie das menschliche Auge kann das Objekt von Interesse zu erkennen. Manchmal werden solche Modelle auch als Skelett-Segment der Karte 3D in einer Zone um das Skelett eingesetzt werden. Obwohl das Modell ist abstrakt und nicht ein Spiegelbild der genauen Dichten, stellt sie eine skelettierte Version der 3D-Dichte und ermöglicht störungsfreie Visualisierung und qualitative Analyse so. Quantitative Messungen wie Länge kann auch aus dem Näherungsmodell bestimmt werden. Für eineBeispiel Software mit manueller abstrahierten Modellgeneration, besuchen Sie bitte die Chimera ausführliche Bedienungsanleitung im Internet unter http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html .

Hand Tracing von interessierenden Merkmalen

Hand Pinsel Verfolgung funktioniert gut mit fast allen Dateneigenschaften, aber es ist auch die zeitaufwändige Methode. Manchmal ist die einzige Technik zum Extrahieren eines Merkmals von Interesse aus einem komplexen Bildsatz enthält eine Vielzahl von Funktionen, wie die dünne und gewundene Zellmembran. Ein nützliches Werkzeug, in einigen Programmen ermöglicht Interpolation zwischen intermittierend segmentiert Scheiben, wenn die Funktion von Interesse ändert reibungslos. Handverfolgung am effizientesten eingesetzt, wenn die Daten ist knackig und hat mittlere bis hohe Kontrast werden, es kann aber auch genutzt werden,für anspruchsvollere Datensätzen, so lange wie der Benutzer mit dem Objekt von Interesse bekannt. Die Datenkomplexität kann von diskreten Objekte bis hin zu komplexen und überfüllten Datensätzen, in denen Objekte dicht gepackt liegen. Im letzteren Fall kann eine manuelle Segmentierung die einzige Wahl sein, da die automatische Ansätze oft schwer, Segment die gewünschte Lautstärke und extrahieren zu viel oder zu wenig. Schwierig Feature Morphologien, wie gefaltet Blätter oder Volumina, kann auch mit dieser Methode gewonnen werden. Allerdings sollte der Anwender im Auge zu behalten, dass ein Datensatz mit mehreren schwierigen Eigenschaften können nur segmentiert werden, wenn die Populationsdichte der Merkmale von Interesse ist gering, da die Segmentierung der hohen Bevölkerungsdichten der Merkmale von Interesse wird zeit unerschwinglich. Ein Beispiel für die Software mit manueller Rückverfolgung, besuchen Sie bitte Amira ausführliche Bedienungsanleitung im Internet unter http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.

Automatisierte dichtebasierte Segmentierung

Im Gegensatz zu den manuellen Techniken, die automatisierte Ansätze im Allgemeinen weniger zeitaufwendig, was ein wichtiger Faktor bei der Segmentierung eines großen Stapels von Bildern ist. Jedoch können einfache Schwellen nicht so genau zu sein, und viel mehr Zeit kann auf Raffinesse und Kuration der automatisch segmentierten Volumen ausgegeben werden. Automatisierte Segmentierung Dichte-basierte funktioniert am besten auf Datensätzen, die eine große Anzahl von ähnlichen Eigenschaften von Interesse, dass alle erfordern Segmentierung anzuzeigen. Wenn die Daten komplexer, können diese automatisierten Techniken noch als einen ersten Schritt zu dienen, wird aber wahrscheinlich erfordern eine manuelle Eingriffe auf der ganzen Linie, um ein Teilvolumen die Funktion von Interesse enthält angeben. Diese Strategie funktioniert in der Regel gut auf lineare Morphologien oder gewundenen Bände, aber es selten erfolgreich mit dünnen gewundenen Blättern, wie istZellmembranen. Minimalem Benutzereingriff mit automatisierten Ansätze ermöglicht die Segmentierung durch große oder kleine Mengen, während aufwendet wenige Benutzer Ressourcen wie Zeit im Gegenzug für hohe Wiedergabetreue. Ein Beispiel für die Software mit automatisierten Segmentierung Dichte-basierte, besuchen Sie bitte Amira ausführliche Bedienungsanleitung im Internet unter http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf .

Maßgeschneiderte Automatisierte Segmentierung

Maßgeschneiderte automatisierte Segmentierung ermöglicht die Strom Anpassung von Algorithmen für eine bestimmte Datenmenge, aber es ist oft spezifisch für die Datensatz oder Datentyp, für eine begrenzte Anzahl von Merkmalseigenschaften falls und kann nicht einfach verallgemeinert werden. Die hier präsentierten Verfahren unterscheidet sich von den allgemeinen automatisierte Segmentierungsansätze, wie zum Beispiel Wasserscheide Eintauchen und andere Ebene Set-Methoden, die auf einem programmierten Bestimmung des kritischen Saatpunkte verlassen, gefolgt von schnellen Marsch Würfel Expansion aus diesen Samen Punkten. Eine Variation dieses Themas ist Randsegmentierung, wo Gradientenvektors Informationen informiert Feature-Grenzen. Im Gegensatz dazu angepasst Skript hier stützt sich auf eine Trainingsstufe, wo der Benutzer manuell verfolgt einige Beispiele. Durch maschinelles Lernen, werden spezifische Algorithmen erkennen und dann lernen, selbstständig Eigenschaften und Datenmerkmale konsequent in den Spuren gefunden zu erkennen. Ein Experte Benutzer kann die Algorithmen umzuschulen und die Genauigkeit der Segmentierung zu verbessern, indem mehr Beispiel wird, um eine größere Menge von Merkmalskriterien liefern. Insgesamt kann Schwellen und verwandte Ansätze, oder auch maßgeschneiderte Ansätze nicht so nützlich, um ein einzelnes Merkmal von Interesse aus einem Bild mit komplexen Vielfalt von Organellen oder Formen zu extrahieren, wie Kuration kann nur als arbeitsintensiv, da manuelle Verfolgung sein.

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Strategien für die Selektierung Daten und Wahl eines Segmentierungsansatz

Angesichts der subjektiven und objektiven Kriterien in Abbildung 4 und Zusammenfassung von geeigneten Datensätzen in Abbildung 5 dargestellt, kann das Entscheidungsschema in Abbildung 6 dargestellt eine effektive Beurteilung der Merkmalsextraktion Strategien für eine Vielzahl von Datensätzen zu unterstützen. Die Datensätze werden in vier aufeinanderfolgenden Entscheidungen, von denen jede eine der vier jeweiligen Ziele sowie die vier subjektiven Kriterien in 4 eingeführt umfassen gesichtet. Als Beispiel ist 6 rationelle Selektierung für jede der sechs Daten Sätze in Abbildung 3 dargestellt. Zweifellos für jeden Datensatz gibt es nicht einen einzigen eindeutigen Pfad, sondern verschiedene Wege durch diese Matrix folgende Kriterien für die Entscheidungsfindung, die führen können to gleich oder verschieden Empfehlung für die Datensegmentierung. Während jeder Datensatz wird seinen eigenen Satz von Eigenschaften, die nicht vorhergesehen werden können, sind sechs Beispiele gegeben, die jeweils mit einer Erläuterung der Gründe für die bevorzugte Merkmalsextraktion / Segmentierungsansatz gepaart. Die meisten enthalten auch einen Vorschlag für eine alternative Route, die Entscheidung entweder Ergebnisse bei der Verwendung der gleichen oder einer anderen Segmentierungsansatz (Figur 6).

Die Kinozilium ist eine scharfe Daten mit klar definierten Grenzen, die automatisierte Ansätze mehr Aussicht auf Erfolg eingestellt ist. Alle Funktionen von Interesse sind gut voneinander getrennt, wodurch ein wieder automatisierten Ansatz. Außerdem sind die Eigenschaften von Interesse ähnlich zueinander, so dass es eine relativ homogene Datensatz ideal für maßgeschneiderte Segmentierung. Schließlich war es das Ziel, die gesamte Funktion zu extrahieren, Begünstigung eines halbautomatischen Ansatz. Als Folge wurde der Schluss gezogen, dass eine automatisierte Schwellwerte (Fest grüne Linie) sowie eine kundenspezifische (zB, Form überwacht Segmentierung) Ansatz (gestrichelte grüne Linie) sind beide wahrscheinlich auf diesem Datensatz gut tun.

Ähnliche Kriterien, wenn auch in einer anderen Reihenfolge bei der Entscheidungsfindung Netzwerk platziert, gelten für den Fall von Bakterien. Eine maßgeschneiderte Ansatz wird zum Teil empfohlen, da dieser Datensatz war sehr groß; Daher verbieten begrenzten Ressourcen eine arbeitsintensive manuelle Eingriffe / Segmentierungsansatz. Während Schwellen würde akzeptable Ergebnisse geliefert haben, war die kundenspezifische Ansatz in der Lage, Schlüsselziel der Studie ausführen, um die rundlichen Bakterienformen aus den extrazellulären Metallablagerungen, die sich entweder in-zwischen die Bakterien oder direkt neben den Bakterien zu trennen und damit die maßgeschneiderten Ansatz bevorzugt wurde.

Für Stereozilien Datensätzen, die erste Überlegung war das angestrebte Ziel: Das Ziel kann entweder die gesamte Dichte zeigenoder geometrische Modelle zu erstellen. Das Volumen von Interesse war überfüllten Raum, und das Ziel war es, Segment eine große Anzahl von Objekten getrennt, wie Objekte, um anschließend ausführen quantitative volumetrische Analyse, einschließlich Längen, Zahlen, Abstände, Ausrichtung, etc. Es war hilfreich, dass die Objekte der Interesse waren vor allem linear, und das machte geometrische Modell Tracing die Methode der Wahl. Allerdings, wenn anstatt das Ziel war es, die gesamte Dichte, dann ist die lineare Funktion Morphologie sowie relativ hohen Kontrast mit scharf definierten Grenzen würde eine automatisierte Schwellen Protokoll möglich machen zu zeigen.

Die Zellmembranen und Mitochondrien Daten Fällen sind eine Herausforderung für die automatisierte Ansätze aufgrund ihrer Kategorien der Morphologie-Funktion: Blätter gefaltet und Volumen auf. Das Ziel ist, die Zelle oder den Mitochondrien Umriss genau zu verfolgen, aber es gibt nur begrenzte Ressourcen, um dies zu tun. Darüber hinaus sind die Eigenschaften der interest sind komplex und nicht leicht automatisch erkannt oder Form-codiert sind, obwohl für die Mitochondrien-Daten setzt die kundenspezifische Scripting-Ansatz für die Bakterien hat möglicherweise mit weiteren Anpassung angewendet werden. Glücklicherweise ist die Membran und Mitochondrien selbst nur einen kleinen Teil des gesamten Volumens und somit ist eine einfache manuelle Rückverfolgung, wenn auch zeitaufwendige Vorgehensweise. Handverfolgung ist auch die Methode der Wahl für solche Datensätze, wenn der Kontrast nicht gering, und die Grenzen sind nicht unscharf. Als ein Ergebnis, auch wenn sie einen beträchtlichen Teil der Datensätze darstellen, müssen diese gewundenen Blätter manuell verfolgt werden, einfach aufgrund des Fehlens einer Alternative.

Die Anlage Datensatz stellte seine eigenen Herausforderungen, denn das Ziel war es, alle Objekte Segment, die dicht angeordnet sind und machen einen überfüllten Landschaft. Anzeige der Dichte-Messungen ist, würde über die Form und Organisation der Objekte, sondern b ermöglicheneil manuell Segmentierung jedes Faden Objekt wird zu teuer, automatische Schwellen anstelle beschäftigt.

Die verschiedenen Schritte und die entsprechenden Ergebnisse bei der Erstellung eines 3D-Modells wurden hier angezeigt, aber noch wichtiger ist, die Dateneigenschaften und persönlichen Kriterien gefunden, für die Bestimmung des besten Pfades der Segmentierung sind auch aufgeklärt worden sein. Die wichtigsten Merkmale der Bilddaten selbst enthalten, was hier als Gegensatz Gedrängt, Knusprigkeit, und die Anzahl von verschiedenen Formen oder Eigenschaften (wie beispielsweise Organellen, Filamenten, Membranen) beschrieben. Subjektiven Kriterien zu berücksichtigen sind das angestrebte Ziel der Segmentierung (Mess / Zählen, skelettiert Darstellung der Daten / Anzeigen Volumen in 3D-Renderings), morphologische Merkmale des Merkmal von Interesse (linear, längliche, vernetzte, komplexe, gewundene), die Dichte der Merkmale von Interesse in Bezug auf das gesamte Volumen (der Anteil der Objekte, diewichtig und extrahiert werden müssen) und den Ausgleich der Kompromisse von Ressourcen aufwendet, um die Segmentierung der Treue der Originaldaten und die abnehmende Rendite auf die Investition, die inkrementelle Verbesserungen für wesentlich höhere Zuweisung von Ressourcen.

Der Bereich der Bildsegmentierung hat sich in den letzten Jahren gereift ist, doch gibt es keinen Königsweg, kein Algorithmus oder ein Programm, das alles kann. Datensatzgrößen haben aus Hunderten von Megabyte, routinemäßig Zehn Gigabyte aufgewachsen, und sie sind jetzt zu Terabyte überschreiten, so dass manuelle Segmentierung in der Nähe unmöglich. So brauchen mehr Ressourcen, um in den clever und zeitsparende Merkmalsextraktion Ansätze, die den menschlichen Entscheidungsprozess imitieren investiert werden. Solche Bemühungen müssen mit (1) geografischen Informationssystem (GIS) kombiniert werden basierte semantische hierarchischen Datenbanken (ähnlich wie bei Google Earth), (2) Datenabstraktionstechniken (dh den Übergangvon einem Voxel zu geometrisch / volumetrische Darstellung) mit computergestützten Entwurf (CAD)-Software, um die Datenmenge erheblich zu reduzieren und ermöglicht so die Anzeige von größeren Volumina ^35, (3) Simulationstechniken, wie sie häufig in den verwendeten kompatiblen Ingenieurwissenschaften, sowie (4) Erweiterte Animation und Film machen Fähigkeiten, einschließlich fly-through-Animationen (ähnlich dem, was für die Spieleindustrie entwickelt).

Klar, effiziente Merkmalsextraktion und Segmentierung liegt im Herzen dieser kommenden Revolution in der Zell-hochauflösende Bildgebung, und während bessere Ansätze werden immer benötigt werden, hier präsentiert die Grundsätze, sowie die Beispiele, was Ansatz wurde für verschiedene Datentypen genommen , liefert einige wertvolle Informationen, um eine Entscheidung, auf dem Ansatz zu nehmen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira	FEI Visualization Sciences Group		http://www.vsg3d.com/amira/overview
Chimera	UCSF		http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Fidschi/ImageJ	National Institute of Health		http://fiji.sc/Fiji,
http://rsbweb.nih.gov/ij/ IMOD	Boulder Laboratory für 3D-Elektronenmikroskopie von Zellen		http://bio3d.colorado.edu/imod/
Photoshop	Adobe		http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html
MATLAB	MathWorks		http://www.mathworks.com/
VLFeat	VLFeat		http://www.vlfeat.org/