Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

Zusammenfassung

Ein Verfahren, um die Fähigkeit der isolierten Maus-Alveolarmakrophagen, um das Wachstum von phagozytierten Aspergillus-Sporen durch konfokale Mikroskopie Steuerung auszuwerten.

Zusammenfassung

Die Lunge ist eine Schnittstelle, wo Wirtszellen werden routinemäßig an Mikroben und mikrobielle Produkte ausgesetzt. Alveolarmakrophagen sind die First-Line-Fresszellen, die eingeatmeten Pilzen und anderen Mikroben zu begegnen. Makrophagen und anderen Immunzellen erkennen Aspergillus Motive durch Erreger Erkennungsrezeptoren und nachgeschalteten Entzündungsreaktionen auslösen. Die Phagozyten NADPH-Oxidase erzeugt reaktive Sauerstoff-Intermediate (ROIs) und ist entscheidend für die Immunabwehr. Obwohl NADPH-Oxidase ist für neutrophile Granulozyten vermittelten Wirtsabwehr ^{werden 1 - 3,} die Bedeutung der NADPH-Oxidase in Makrophagen nicht gut definiert ist. Das Ziel dieser Studie war es, die spezifische Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Vermittlung der Immunabwehr gegen A. abzugrenzen fumigatus. Wir fanden, dass NADPH-Oxidase in Alveolarmakrophagen steuert das Wachstum von phagozytierten A. fumigatus Sporen ^4. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Bewertung der Fähigkeit von Maus-alveolar Makrophagen (AMS), das Wachstum der Phagozytose Aspergillus-Sporen (Konidien) zu steuern. Alveoläre Makrophagen in vivo gefärbt und zehn Tage später aus Mäusen isoliert durch Lavage (BAL). Makrophagen werden auf Deckgläschen überzogen, dann mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-exprimierenden A. ausgesät fumigatus Sporen. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die Zellen fixiert und die Anzahl der intakten Makrophagen phagozytierten Sporen durch konfokale Mikroskopie untersucht.

Einleitung

Alveolarmakrophagen sind die First-Line-Fresszellen, die eingeatmete Keime begegnen. Makrophagen erkennen Aspergillus Motive durch Erreger Erkennungsrezeptoren, aufnehmen und das Wachstum von inhalierten Sporen (Konidien) zu begrenzen, und Entzündungsreaktionen auslösen. Phagozyten NADPH-Oxidase wandelt molekularen Sauerstoff in Superoxid-Anion und stromabwärts reaktiven Sauerstoffzwischenprodukte (ROI). Chronische Granulomatose (CGD) ist eine erbliche Erkrankung der NADPH-Oxidase, die durch schwere bakterielle und Pilzinfektionen und durch übermäßige Entzündungsreaktionen.

Obwohl NADPH-Oxidase ist für neutrophile Granulozyten ve....

Protokoll

Alle Verfahren an Tieren in dieser Studie durchgeführt wurden, von der Animal Care und Verwenden Ausschuss am Roswell Park Cancer Institute genehmigt und mit allen Landes-, Bundes eingehalten werden, und National Institutes of Health Vorschriften.

1. In-vivo-Makrophagen-Labeling

Hinweis: PHK26 ein lipophiler Farbstoff, der von phagozytierenden Zellen sowohl in Umlauf und in den Geweben, wenn sie intravenös (iv) verabreicht genommen wird. PKH26 wurde für in vivo-Markierung verwendet, um die Menge der nach der Ernte Manipulation der Makrophagen zu minimieren. PKH-26 hat den Vorteil, stabil zu der....

Ergebnisse

Sammeln Alveolarmakrophagen von BAL aus nicht-stimulierten Mäusen wird in einem> 95% reine Population basierend auf Zytologie führen. Die 3 und 7 h (Abbildung 2) Zeitpunkten gehen der Hyphen-Phase des Pilzwachstum und damit für einen Vergleich der Effizienz der phagocytic Konidien unter Genotypen. Die 14 Stunden Zeitpunkt, wo Genotypen hinsichtlich der Fähigkeit, den Übergang von phagozytierten Konidien zum Gewebe-invasive Hyphen Stufe (Fig. 3) zu inhibieren, verglichen werden........

Diskussion

Unter Verwendung dieses Ansatzes für die ex vivo Analyse der Antipilz-Aktivität der Makrophagen in vivo zusammen mit Pilz Herausforderung, die wir früher gezeigt, dass NADPH-Oxidase in Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der Abwehr gegen A. ⁴ fumigatus. Die Verwendung von isolierten Alveolarmakrophagen ermöglicht es uns, auf ihre fungizide Aktivität in der Abwesenheit von anderen Immunzellen (zB rekrutierten Neutrophile), die gegen Aspergillus verteidigen <.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
PKH26 Rot fluoreszierendes Zellvernetzer-Kit für die allgemeine Zellmembranmarkierung	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromethanol	Sigma	T48402	Wird zur Herstellung von AverttinAnästhetikum
2-Methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Verwendet zur Herstellung von AvertinAnästhetikum
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (ohne Calcium und Magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Wird zur Herstellung von ACK-Erythrozyten-Lysepuffer
KHCO3	Sigma	P91444	Wird zur Herstellung von ACK-Erythrozyten-Lysepuffer
EDTA		Sigma E6758	Wird zur Herstellung von ACK-Erythrozyten-Lysepuffer
22 G x 1,00 Zoll i.v. Katheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
Insulin Spritzen
6 ml Spritzen
4-Wege Absperrhahn	Fisher Scientific	50-700-077
Nahtfaden
50 ml konische Zentrifugenröhrchen
Mullschwämme (4 Zoll im Quadrat)
RPMI 1640 mit L-Glutamin	Corning	10-040-CV
Fötales Rinderserum-Hyklon		SH30396.03	hitzeinaktiviertes
Hema 3 Fleckenset	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar mit Chloramphenicol und Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous Stamm, der grün fluoreszierendes Protein			, bereitgestellt von Dr. Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Kanada
100 μ m Zellsiebe	BD Falcon	64753-00
Schere
Zange
Biologische Sicherheitswerkbank Klasse II
Sorval ST40 Zentrifuge mit Ausschwingrotor
Leica DM1000 Lichtmikroskop
Hämozytometer
Cytospin 2 Zentrifuge	Thermo Scientific
Zellkultur-Inkubator			37 > C, 5%  CO2
22 x 22 mm Mikro-Deckglas	VWR	48366-227	Glasdeckgläser
6-Well-Zellkulturplatten	Corning	3506
10% neutral gepuffertes Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield Eindeckmedium mit DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 System mit Laserpunktscanner			Montiert auf dem DMIRE2-Fluoreszenzmikroskop

exprimiert