Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Zusammenfassung

Ein Verfahren zur schnellen Isolierung von Mitochondrien aus Säugergewebebiopsien beschrieben. Rattenleber-oder Skelettmuskelpräparate wurden mit einem kommerziellen Gewebe Dissociator homogenisiert und Mitochondrien wurden durch Differentialfiltration durch Nylon-Mesh-Filter isoliert. Mitochondriale Isolation Zeit <30 min im Vergleich zu 60 bis 100 min mit alternativen Methoden.

Zusammenfassung

Zuvor beschriebenen mitochondrialen Isolationsverfahren unter Verwendung differentieller Zentrifugation und / oder Ficoll-Gradienten-Zentrifugation erfordert 60 bis 100 min in Anspruch. Wir beschreiben ein Verfahren zur schnellen Isolierung von Mitochondrien aus Säugetierbiopsien unter Verwendung eines kommerziellen Gewebe Dissociator und Differentialfiltration. In diesem Protokoll ist eine manuelle Homogenisierung mit standardisierten Zyklus der Homogenisierung des Gewebes Dissociator ersetzt. Dies ermöglicht eine einheitliche und konsequente Homogenisierung von Gewebe, das wird nicht leicht mit Hand Homogenisierung erreicht. Nach Gewebedissoziation wird das Homogenat durch Nylon-Mesh-Filter, die sich wiederholenden Zentrifugationsschritten beseitigen gefiltert. Als Ergebnis kann die mitochondriale Isolierung in weniger als 30 min durchgeführt werden. Diese Isolation Protokoll ergibt etwa 2 x 10 ¹⁰ lebensfähige und Atmung zuständige Mitochondrien von 0,18 ± 0,04 g (Nassgewicht) Gewebeprobe.

Einleitung

Mitochondrien existieren in jeder Zelle des Körpers mit Ausnahme der roten Blutzellen und in einer Vielzahl von wichtigen zellulären Stoffwechselprozesse und ^1-4 involviert. Aufgrund dieser vielen Funktionen können mitochondriale Schäden schädlichen Wirkungen ³ aufweisen. Um die Funktion der Mitochondrien und mitochondriale Dysfunktion mehrere Isolationsmethoden zu untersuchen, wurden beschrieben. Die frühesten veröffentlichten Konten von mitochondrialen Isolierung Datum auf den 1940er ^5-8. Der erste dokumentierte Versuch demonstriert mitochondrialen Isolierung durch Schleifen Lebergewebe in einem Mörser, gefolgt von Zentrifugation in....

Protokoll

Vorbereitung

1. Bereiten 1 M K-HEPES-Stammlösung (einstellen mit KOH pH-Wert auf 7.2).
2. Bereiten 0,5 M K-EGTA-Stammlösung (einstellen mit KOH pH-Wert auf 8,0).
3. Bereiten 1 M KH ₂ PO ₄ Stock Lösung.
4. Bereiten 1 M MgCl _{2-Stammlösung.}
5. Vorbereitung Homogenisierungspuffer (pH 7,2) 300 mM Saccharose, 10 mM K-HEPES, 1 mM K-EGTA. Lagerung bei 4 ° C.
6. Vorbereitung Respiration Puffer 250 mM Saccharose, 2 mM KH ₂ PO _4, 10 mM MgCl _2, 20 mM K-HEPES-Puffer (pH 7,2) und 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Lagerung bei 4 ° C.
7. Vorbereitung 10x PBS-Stammlösung hergeste....

Ergebnisse

Eine Figur skizziert die Verfahrensschritte bei der Isolierung von Mitochondrien mit Gewebedissoziation und Differenz Filtration ist in Abbildung 1 dargestellt. Gesamtverfahrensdauer weniger als 30 min.

Gewebeproben wurden mit einem 6 mm-Biopsie Punch erhalten. Gewebegewicht betrug 0,18 ± 0,04 g (Feuchtgewicht). Die Anzahl der Mitochondrien isoliert, wie durch die Teilchengröße Zählung bestimmt war 2,4 x ¹⁰ 10 ± 0,1 x ¹⁰ 10 Mitochondrien für Skelettmusk.......

Diskussion

Um erfolgreich zu isolieren Mitochondrien mit diesem Protokoll ist es wichtig, alle Lösungen und Gewebeproben auf Eis zu halten, um die mitochondriale Lebensfähigkeit bewahren. Auch wenn auf Eis gehalten wird isolierten Mitochondrien eine Abnahme der funktionellen Aktivität im Laufe der Zeit ¹⁹ aufweisen. Wir empfehlen, dass alle Lösungen und Ergänzungen vor, vorbereitet werden. Wir voraus wiegen und zu speichern Subtilisin A in 4 mg Aliquots in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und speichern sie bei -20 ° C. Ä.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Saccharose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Lumineszenz-Assay-System, 1.000 Assay-Kit	Perkin Elmer
50 ml Konische Röhrchen	BD	352098
40 μ m Nylon-Filter	BD	352340
GentleMACS C Röhrchen	Miltenyl Biotech	120-005-331
1,5 ml Eppendorf Röhrchen	Fisher Scientific	05-408-129
6 mm Biopsiestanze	Miltex	33-36
10 μ m Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Zentrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS Dissoziator	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-Well-Platten, gewebekulturbehandelt	VWR	82050-732
Rotomax 120 Orbitalschüttler	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode   Mikroplatten-Reader	BioTek
Multisizer 4 Scharzähler	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
Hämazytometer	Fisher Scientific	267110

6016941