Mikrodissektion wurde ausgiebig für die Untersuchung von DNA, RNA und Protein in Gewebe eingesetzt. Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) ist die am häufigsten verwendete Methode, aber eine neue Frästechnik mesodissection ist kürzlich verfügbar. Wir zeigen, RNA-Extraktion aus Formalin fixiert mesodissected Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von Mycobacterium tuberculosis Granulome.
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Methodenartikel
A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mikrodissektion wurde zur Untersuchung von Gewebe an DNA-, RNA-und Protein-Ebene für über ein Jahrzehnt verwendet. Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) ist die häufigste Mikrodissektion Technik heute verwendet. Bei dieser Technik wird ein Laser verwendet, um fokal Schmelze eines thermoplastischen Membran, die einen dehydrierten Gewebeschnitt 1 überlagert. Der Gewebeschnitt Verbund wird dann angehoben und von der Membran getrennt. Obwohl diese Technik erfolgreich zur Gewebeuntersuchung verwendet werden, ist es zeitaufwendig und teuer. Weiterhin ist die erfolgreiche Abwicklung der Verfahren unter Verwendung dieser Technik erfordert die Verwendung eines Lasers, wodurch ihre Verwendung eingeschränkt wird. Eine neue erschwingliche und praktische Mikrodissektion Ansatz namens mesodissection ist eine mögliche Lösung, um die Fallstricke der LCM. Diese Technik nutzt die MESO-1/MeSectr System zu fräsen das gewünschte Gewebe von einem Schlitten montiert Gewebeprobe während gleichzeitig Aufnahme und Abgabe Flüssigkeit, um die gewünschte Gewebeprobe in erholenein Verbrauchs Mühle wenig. Bevor die Dissektion Prozess beginnt, richtet der Anwender die Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) gleitet mit einer Hämatoxylin und Eosin (H & E)-Referenzrutsche. Danach annotiert der Bediener die gewünschte Dissektion Bereich und weiter zu den entsprechenden Segments zu sezieren. Das Programm erzeugt eine archivierte Bild der Dissektion. Der Hauptvorteil der mesodissection ist die kurze Dauer benötigt wird, um eine Folie zu zerlegen, wobei ein Durchschnitt von zehn Minuten von eingerichtet zu Generation in diesem Versuch probieren. Zusätzlich ist das System deutlich kostengünstiger und bedienerfreundlich. Ein kleiner Nachteil ist, dass es nicht so präzise wie Laser-Capture-Mikroskopie. In diesem Artikel zeigen wir, wie mesodissection kann verwendet werden, um RNA aus Folien aus FFPE Granulome durch Mycobacterium tuberculosis (Mtb) verursacht zu extrahieren.
Einleitung
Die Proben wurden traditionell von Hand aus entweder ganze Gewebe oder Folien mit einer Nadel und Skalpell mikrodissektiert. Dies erfordert eine klare Trennung zwischen dem Gewebeschnitt des Interesses und der umgebenden Gewebe Abschnitten 2. Mit den Fortschritten in der aktuellen Molekularprofilierungstechnologie hat es einen zunehmenden Bedarf an Gewebe auf zellulärer Ebene zu bewerten. Aufgrund der Einschränkungen der manuellen Mikrodissektion wurden Techniken wie LCM gegründet, um größere Isolation Präzision ermöglichen. Diese Technik ermöglicht es dem Forscher, bestimmte Zellpopulationen aus verschiedenen Zelltypen und Objektträger, die dann für nachfolgende Assays wie Genexpressionsprofile verwendet werden können, zu isolieren. Obwohl sehr effektiv für die nachgeschalteten Tests ist LCM nicht ohne Einschränkungen. Erstens ist LCM ein teurer und zeitaufwendiger Prozess. Darüber hinaus aufgrund der instabilen Natur der RNA, ist es oft eine Herausforderung, qualitativ hochwertige RNA aus Proben LCM 2 zu erhalten. Aufgrund der disadvantages von LCM, werden neue Fortschritte in der Technologie-Mikrodissektion noch benötigt es leichter zugänglich für eine größere Anzahl von Forschern in einem erschwinglichen und zeitkritische Art und Weise zu machen.
Ein solcher Fortschritt in der Technologie-Mikrodissektion jetzt ist eine Technik, die als mesodissection bekannt. Bei dieser Technik wird eine Maschine zum Fräsen die kommentierte Gewebeschnitt von Interesse verwendet und saugt sie in eine Mühle Verbrauchs Bit 3. Weiter kann diese Probe in einem Sammelrohr angesaugt und für Downstream-Anwendungen verwendet werden. Die Vorteile dieses Systems sind, dass es wesentlich kostengünstiger und zeitempfindlich. Nach unseren Erfahrungen kann das System die Präparation eines Lungen Granulomgewebe Abschnitt in zehn Minuten. Auf der anderen Seite würde wahrscheinlich erfordern traditionelle LCM Stunden, um den Vorgang abzuschließen. Das System erlaubt es dem Bediener, eine Referenz Schlitten zu laden, um als Vergleichs sowie Werkzeug für Anmerkungen verwendet. Zusätzlich wird ein Bericht generiert umreißt the-Bereich der Folie, die seziert wurde. Es gibt zwei Hauptnachteile auf mesodissection. Obwohl wirksame Extraktion bei mehreren Zellen, ist es schwierig, eine einzelne Zelle zu isolieren. Darüber hinaus ist die Genauigkeit des erzeugten Bildes nicht so klar wie bei Verwendung anderer Abbildungs Mikroskopen.
Tuberkulose (TB) ist eine Infektionskrankheit, die großen Killer der Menschheit weltweit und Ergebnisse aus einer Infektion mit Mtb. In einer Mehrzahl von Individuen, Aerosole Mtb ausgesetzt wird, wird die Infektion latent beschränkt. In mindestens 10 Millionen Menschen jährlich, kommt es zu aktiven TB-Erkrankung 4. Während der latenten Infektion wird Mtb innerhalb pathologische Lungenläsionen als Granulome bekannte enthalten. So wurde argumentiert, dass das Ergebnis der Mtb-Infektion ist auf der Ebene des Granuloms 5 entschieden.
Hier zeigen wir, wie mesodissection kann verwendet werden, um Granulome von Mtb microdissect verursacht werden. Die verwendeten Foliensind von FFPE Lungengewebe von infizierten Rhesusaffen. Für den Zweck dieser Demonstration werden wir Granulomen in ihrer Gesamtheit zu sezieren. Wir zeigen auch, dass RNA aus dem wiederhergestellten Gewebe extrahiert werden. Diese Technik kann auf Gewebeproben von verschiedenen anderen Proben aufgetragen und dann für eine Vielzahl von Downstream-Assays verwendet.
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Protokoll
1. Kalibrieren Mesodissection Instrument mit 2id Imaging Software
Die 2id Imaging-Software wird entweder als Software oder des Programms für den Rest dieses Artikels bezeichnet werden. Dieser Schritt ist notwendig, um das Bild korrekt zu verfolgen sowie mehrere Dia-Rahmen auszurichten.
- Schalten Sie Gerät und Computer.
- Offene Software und wählen Sie "Kalibrierungsinstrument".
- Kalibrieren Stufe Reise mit dem Joystick. Bewegen Bühne obere linke Position. Drücken Sie auf "Set" unter Schritt 1 in Programm.
- Bewegen Bühne, um richtige Position zu senken. Drücken Sie auf "Set" unter Schritt 2 in Programm.
- Kalibrieren Aspiration, indem Sie zuerst "Z-Taste", um Kopfeinheit zu erhöhen. Drücken Sie auf "absaugen Puls" und "Dissektion"-Taste auf dem Joystick, bis Kolbensteuerstange erreicht Spitzenposition. Drücken Sie auf "Set" unter Schritt 3 des Programms.
- Drücken Sie auf "Reset absaugen &# 8221; -Taste. Sobald der Kolben hält an der unteren Position drücken Sie die "Set" in Schritt 4.
- Klicken Sie auf das "scale Register".
- Zeigen Kalibrierung Lineal auf leere Seite.
- Fokus Mikroskop, wenn nötig.
- Zeichnet eine Linie zwischen den zwei Maßstäbe mit der Maus.
- Geben Sie Abstand in Feld Schritt 2 Drücken Sie die "Compute"-Taste. Gekennzeichnet.
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Fadenkreuz". Drehen Sie die Motordrehzahl auf 1.
- Setzen Sie in den Kopf xScisor Montage. Niederkopf-Anordnung in z-Achse Bereitschaftsstellung mit der Taste "z-Achse"-Taste. HINWEIS: Die Kopfanordnung ist die große Struktur auf der Oberseite der Dissektionsinstrument. Die xScisor wird als Verbrauchs Mühle Bit für den Rest dieses Artikels bezeichnet werden.
- Klicken Sie auf "Dissektion engagieren"-Taste am Joystick. HINWEIS: Diese Taste ist auf der Oberseite des Joysticks befinden.
- Drehzentrum visuell definieren. Um dies zu tun, bewegen Zentrum von Fadenkreuz über Drehzentrum mit definierend-Parameter in Schritt 1 des Programms. Verwenden Sie die Pfeile nach oben und unten in der "x" und "y-Achse" Bars, um die Pixel einstellen, um Fadenkreuz auszurichten. Klicken Sie auf "Fertig"-Registerkarte.
- Klicken Sie auf "Home"-Symbol. HINWEIS: Dies wird durch eine Haus-Bild in der rechten oberen Ecke vertreten.
2. Neues Referenzbild
- Zeigen H & E-Rutsche auf der Bühne. Zeigen lichtundurchlässige Abdeckung oben auf der Folie. Fahren Sie das Gerät mit dem Joystick auf den gewünschten Bereich der H & E-Rutsche. Speichern Sie die generierte Bild. HINWEIS: Entweder die Registerkarte "capture Referenz" oder Registerkarte "sezieren" kann verwendet werden, um diesen Schritt abzuschließen.
3. Richten Tissue für Dissection
- Klicken Sie auf die "sezieren Gewebe" Option auf dem Home-Bildschirm.
- Füllen Sie die "Betreiber", "Dissektion Zugangsnummer", "Referenz-Zugangsnummer", "xScisor Barcode-Nummer," & #8220; Dissektion Flüssigkeit Los-Nummer "," xScisor Größe "und" Beschreibung "in der Registerkarte" Einstellungen ".
- Klicken Sie auf der Registerkarte "finden Gewebe".
- Import Referenzbild zuvor gespeichert.
- Legen Sie eine ungefärbte FFPE Rutsche von 5 Mikrometer Dicke auf der Bühne. Bewegen Stufe auf den gleichen Bereich wie der in dem Referenzbild dargestellt. Klicken Sie auf "Bild einfügen"-Registerkarte.
- Klicken Sie auf die Registerkarte "align". Benutzen Sie die Maus und die zugehörigen Pfeile, um das Referenzbild auf die ungefärbten Bild auszurichten.
4. Kommentieren Slide
- Klicken Sie auf der Registerkarte "kommentieren".
- Benutzen Sie die Maus, um einen Kreis um den gewünschten Bereich der Folie, die mikrodissektiert werden ziehen.
5. Legen Verbrauchs Mühle Bit
- Füllen Verbrauchs Mühle bisschen mit gewünschten Puffer, hier PKD-Puffer, indem Sie den Kolben nach oben und unten in einer flüssigen Bewegung mehrere Male. Stellen Sie sicher, um Luft auszuschließenBlasen.
- Heben Z-Achse mit der Taste "Z-Achsen-Button".
- Legen Verbrauchs Mühle in Bit Maschine. Tun Sie dies, indem Sie den Verbrauchs Mühle Bit in den oberen Teil der Maschine, so dass die weiße Linie auf der Gerätelinien mit der schwarzen Linie auf der Verbrauchs Mühle wenig. Drücken Sie auf "Aspiration-Reset"-Taste, damit Kolben, um in die richtige Position abgesenkt werden. HINWEIS: Es sollte einfach sein, die Verbrauchs Mühle bisschen gleiten. Wenn es nicht sicher, dass die Kerben korrekt ausgerichtet sind.
- Nieder Z-Achse durch erneutes Drücken "Z-Achse"-Taste.
6. Dissect Tissue (Abbildung 4)
- Öffnen Sie Registerkarte "sezieren".
- Schalten Motor und Aspiration Geschwindigkeiten bis 1.
- Aktivieren Sie "Show-Tracking"-Box. Anmerkung: Dies ermöglicht es dem Benutzer, den sezierten Bereich während der Dissektion Prozess zu visualisieren.
- Einmal fertig zu sezieren, weiterhin halten Sie die Taste "engagieren" sowie "absaugen & #8221; Joystick-Taste während der Bewegung in einer Richtung gegen den Uhrzeigersinn, um Gewebe zu sezieren.
- Fahren Sie gegen den Uhrzeigersinn, bis die sezieren absaugen "voll" Registerkarte wird rot.
7. Leeren und entfernen Verbrauchs Mühle Bit
- Legen Sie eine 0,5 ul-Mikrozentrifugenröhrchen unter der Spitze des Verbrauchs Mühle wenig.
- Drücken Sie auf "Aspiration" Steuerstange schnell auf Probe in Mikrozentrifugenröhrchen auszuwerfen.
- Drücken Sie mit erhöhter Kraft zu gebrauchten Verbrauchs Mühle Bit auszuwerfen.
- Spülen Gewebefragment durch Ziehen Kolben zurück. Drücken Sie den Kolben nach vorne, um verbleibende Probe in Verbrauchs Mühle etwas auszudrücken. Das Gewebefragment wird nun im Mikrozentrifugenröhrchen enthalten sein.
8. Lyse Probe mit Proteinase K Verdauung durch Wärmebehandlung Gefolgt
- In 70 ul TE pH 8,5, 5 ug Proteinase K, um Gewebeprobe gewonnen.
- Zeigen Probe in programmierbare Heizkörper-Schüttler.
- Vollständige Verdauung mit programmierbaren Heizkörper-Schüttler bei der folgenden Einstellung: 60 ˚ C für 30 min bei 1.500 min; 82 ˚ C für 15 min bei 1.500 min; und 25 ˚ C für 1 min bei 450 UpM. Die Probe ist nun bereit für Downstream-Anwendungen.
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Ergebnisse
Die oben genannte Protokoll zeigt, wie eine neue mesodissection Technik verwenden, um RNA aus FFPE-Gewebeschnitten zu extrahieren. Dieses Protokoll Wirksamkeit durch FFPE Folien Lunge Granulome von NHP mit MTB verschiedene infektiöse Stadien infiziert gezeigt. Fig. 1-3 sind Bilder des Instruments. Fig. 4 zeigt, wie die Dissektion Prozesses auftritt und das resultierende Bild durch die Software. Tabelle 1 erzeugten zeigt die Ergebnisse der RNA-Extraktion mit ein...
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Diskussion
Mesodissection ist eine Technik, die RNA-Extraktion aus pathologischen Läsion gleitet durch eine Vielzahl von Krankheitserregern verursacht angewendet werden können. Es ist eine Notwendigkeit, dass der Benutzer verfolgt das Bild und das Bild richtig ausgerichtet ist. Um dies zu erreichen, muss das Gerät nach den Anweisungen auf dem Imaging-Software kalibriert werden. Bei der Analyse, wenn die Dia-und Interessengebiet seziert nicht passen, muss der Benutzer das Gerät neu kalibriert werden. Ein weiterer wichtiger Schritt ...
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Offenlegungen
Die Autoren beschreiben, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Die Autoren möchten die folgenden Auszeichnungen NIH / subawards für die Unterstützung dieser Forschung zu bestätigen: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08 und P51OD011104.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Weitere Größen | |
| verfügbar THOR | AvanSci Bio | Programmierbarer Heiz-Schüttler | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE Extraktionskit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE-System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR-Aufreinigungskit | Qiagen | 28104 |
Referenzen
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
