Technische Grundlagen Elemente der Gefrierbruch-/ Gefrier Etch in Biological Elektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Grundlegende Techniken und Ausgestaltungen der Gefrierbruch-Verarbeitung von biologischen Proben und Nanomaterialien für die Prüfung durch Transmissionselektronenmikroskopie beschrieben. Diese Technik ist eine bevorzugte Methode für die Entdeckung ultrastrukturelle Merkmale und Spezialisierungen von biologischen Membranen und für den Erhalt von ultrastruktureller Ebene dimensionale und räumliche Daten in den Materialwissenschaften und der Nanotechnologie-Produkte.

Zusammenfassung

Gefrierbruch-/ Gefrier Etch beschreibt einen Prozess, bei dem Proben, in der Regel biologische oder Nanomaterialien in der Natur, werden eingefroren, zerbrochen, und repliziert werden, um ein Kohlenstoff / Platin für die Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie "cast" beabsichtigt. Proben werden ultraschnellen Gefriergeschwindigkeiten unterworfen, oft in Gegenwart von Kryoschutzmitteln Eiskristallbildung zu begrenzen, mit anschließendem Brechen der Probe in flüssigem Stickstoff gekühlten Temperaturen im Hochvakuum. Die resultierenden gebrochenen Oberfläche repliziert und durch Verdampfung von Kohlenstoff und Platin aus einem Winkel, der Oberfläche verleiht dreidimensionalen Detail auf die Guss stabilisiert. Diese Technik hat sich als besonders aufschlussreich für die Untersuchung von Zellmembranen und ihre Spezialisierungen bewährt und hat sich für das Verständnis der Zellform zu verwandten Zellfunktion bei. In diesem Bericht, die Geräteanforderungen und technisches Protokoll für die Durchführung überblicken wirGefrierbruch, der zugehörige Nomenklatur und Eigenschaften der Bruchflächen, Variationen über das herkömmliche Verfahren und Kriterien für die Interpretation der Gefrierbruch-Bilder. Diese Technik wurde häufig für ultrastrukturelle Untersuchung in vielen Bereichen der Zellbiologie und hält Versprechen als eine aufstrebende bildgebendes Verfahren für die molekulare, Nanotechnologie und Materialwissenschaften Studien.

Einleitung

Das Konzept und die praktische Anwendung der Gefrierbruch-Verarbeitung von biologischen Proben wurde von Steere ¹ mehr als die Hälfte vor einem Jahrhundert eingeführt. Die frühe Gerät angeeignet unterschiedlichen Komponenten in einem Arbeits geschlossene Einheit ^1. Die ursprüngliche Vorrichtung wurde modifiziert, und um die kritische Notwendigkeit für die Fernmanipulation, Wartung von Hochvakuum aufzunehmen in handelsübliche Instrumente raffiniert, und die Verdampfung von Kohlenstoff und Metallen, um eine geeignete Prüfungs durch Transmissionselektronenmikroskopie (Abbildung 1 und Abbildung Replik zu erzeugen 2).

Das typische Instrument besteht aus einer Hochvakuumkammer mit Probentisch und Mikrotom Arm mit regelbaren flüssigem Stickstoff Durch (Abbildung 1). Die Kammer beinhaltet auch zwei Elektronenkanonen, einer zum Stabilisieren Kohlenstoffverdampfung bei 90 ° Winkel zu dem Objekttisch und der andere für plati positioniertnum / Kohlenstoff-Shadowing in einem einstellbaren Winkel, in der Regel 15 ° - 45 ° (Abbildung 2). Stromversorgung des Gerätes wird angewendet, um die Vakuumpumpe zu betreiben und elektronische Tafeln regeln Temperatureinstellung und Elektronenkanone Kontrolle.

Ursprünglich als Mittel gedacht, um eine verbesserte Abbildung von Viren zu erreichen, Gefrierbruch als eine Technik für die Untersuchung und Analyse von Zellmembranen und ihre Spezialisierungen ^{2, 3} gewonnen noch mehr Popularität. In der Tat hat dieses Verfahren schon fester Bestandteil der Aufklärung Struktur / Funktions-Beziehungen in Zellen und Geweben, und viele dieser Studien stehen als klassische Beiträge zur Zell-und Molekularbiologie ^4-9. Das Hauptziel und Gründe für die Entwicklung der Gefrierbruchtechnik war Artefakte beobachtbar elektronenmikroskopischen Auflösung, die sich aus chemischen Fixierung und Verarbeitung in herkömmlichen biologischen Elektronenmikroskopie begrenzen. Hier ist das Ziel, chemisch zu begrenzenFixierung und die Probe mit ausreichender Geschwindigkeit und häufig in Gegenwart eines Kälteschutzmittels, um die Bildung von Eiskristallen und andere Einfrieren Artefakte begrenzen einzufrieren. In jüngerer Zeit hat diese Technik ein Wiederaufleben des Interesses von Molekularbiologen und Materialwissenschaften Ermittler zur Untersuchung von Nanopartikeln und Nanomaterialien gefunden.

Gefrierbruch-und gefrier Etch Bilder zeigen einen dreidimensionalen Charakter und manchmal irren für rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen. Jedoch sind Gefrierbruch-Zubereitungen durch Transmissionselektronenmikroskopie untersucht und ihre wichtigen Beitrag zur Hochauflösung morphologische Studien ist ihre eindeutige Darstellung der Struktur / Funktionselemente der Zellmembranen. Gefrierbruch-Verarbeitung wird durch Einfrieren von Zellen und Geweben mit ausreichender Geschwindigkeit, um Eis Kristallisation und / oder mit der Verwendung von Tieftemperaturschutzmittel, wie Glycerin begrenzen eingeleitet. Die Proben werden anschließend unter Vakuum und einem Vertreter gebrochenLICA durch Verdampfung von Kohlenstoff und Platin auf der Bruchfläche erzeugt. Die ursprüngliche Probe wird von der Replik, die auf einem Standard-EM Objektgitter abgerufen wird verdaut. Ein weiterer häufiger Fehlinterpretation der Gefrierbruch-Bilder ist, dass sie den Zelloberflächen darzustellen. Jedoch ist die Grundprämisse der Gefrierbruch ist, dass biologische Membranen durch die Lipiddoppelschicht durch die Bruchverfahren (3) aufgeteilt. Dieser Prozess in biologischen Membranen ergibt zwei Bruchflächen, eine, die die Organisation der Hälfte der Membran benachbart zu dem Zytoplasma, der PF-Fläche zeigt, und eine, die die Hälfte der bimolekularen Membranschicht, die angrenzend an die extrazelluläre ist enthüllt Milieu, das EF-Gesicht. Wahre Zelloberflächen sind nicht Gefrierbruch Bilder dargestellt, sondern nur angezeigt werden, wenn der nachfolgende Schritt hinzugefügt gefrier Radierung nach der Bruchverfahren verwendet wird. Um effektiv zu ätzen zuvor gebrochen Proben Oberfläche detai zeigenl, müssen Proben mit einer schnellen Rate und ohne unetchablecryoprotectant eingefroren werden. Ätzen von Wasser von der Oberfläche der gebrochenen Probe enthüllt zugrunde liegenden Funktionen wird durch Positionieren des Kühl Mikrotom Arm über dem Probentisch Erzeugen einer Temperaturdifferenz zwischen der Phase hält die Probe und die Kühl Mikrotom Arm, der bewirkt, daß Wasser von der Oberfläche sublimieren erreicht. Wird Wasser von der Oberfläche der gebrochenen Probe während des Gefriert Ätzen Manöver sublimiert, kann Aspekte der aktuellen Zelloberflächen, extrazelluläre Matrix, Cytoskelett-Strukturen und Molekularanordnungen mit hoher Auflösung offenbart. So Gefrierbruch und gefrier Etch sind nicht austauschbare Begriffe, sondern spiegeln eine schrittweise Prozess von denen die letztere kann nicht je nach den Bedürfnissen der jeweiligen Studie notwendig oder wünschenswert sein.

Nach dem Gefrierbruch-/ Gefrier Ätzverfahren, die Bruchflächen sind zu richten Verdampzogentive Mäntel aus Kohlenstoff und Platin, um die Unterstützung und Imaging Gegensatz zu der Replik bieten. Das Platin / Kohlenstoff Abbildungsverdampfung kann unidirektional oder Dreh und wird entweder durch Widerstand oder Elektronenkanonen erfolgt. Unidirektionale Abschattung von einem bekannten Winkel, typischerweise 30 ° - 45 °, ist nützlich bei der Durchführung bestimmter morphometrische Berechnungen. Exemplare, die zu tief Ätzen unterzogen worden sind, in der Regel sind Dreh beschattet und die resultierenden Bilder dieser Proben sind fotografisch für die Bewertung umgekehrt.

Die historische sowie ein Ziel der vorliegenden Gefrierbruch-/ Gefrier Ätztechnik ist die chemische Fixierung und Verarbeitung Probe Artefakte, die mit mehr konventionellen Transmissionselektronenmikroskopie Verfahren verbunden sind, begrenzen. Allerdings bietet diese Technik eine wesentliche Vorteil in der Fähigkeit, dreidimensionale Detail verleihen und damit Erwerb von morphometrischen Daten in biologischen, Materialwissenschaften zu erleichtern, und nanotechnology Proben. Gefrierbruch-und gefrier Etch Verfahren sind komplex und vielschichtig und einige Aspekte ihrer Anwendung zugeschnitten sind. Diese Präsentation gibt einen Überblick Ansicht der wichtigsten Funktionen des Prozesses und der Leser wird auf umfassende veröffentlichten Protokollen ^{10, 11,} um die Details anzugehen und gestalten den Prozess für bestimmte Forschungsbedarf bezeichnet.

Protokoll

1. Herstellung von biologischen Proben für Gefrierbruch-/ Gefrier Etch

1. Verwenden eines herkömmlichen EM Fixiermittelformulierung wie 2% Glutaraldehyd und 2% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer für 1 Stunde. Primär Fixierung von biologischen Geweben durchzuführen. HINWEIS: Während es wünschenswert, einige Arten von Proben ohne vorherige Fixierung einzufrieren, Universal Blut übertragene Krankheitserreger Vorsichtsmaßnahmen Mandat entsprechende Fixierung, wo die Probe aus menschlichem Gewebe.
2. Folgenden primären Fixierung, Spülung der Probe in dem gleichen Puffer mit 0,2 M Saccharose nicht mehr als 1 h ergänzt.
3. Die Probe wird auf eine Kälteschutzmittellösung, bestehend aus 25% Glycerin in 0,1 M Phosphatpuffer für nicht mehr als 1 Stunde.

2. Einfrieren und Lagerung der Proben im Vorfeld der Gefrierbruch

1. Wählen Sie Gold oder Kupfer Probe Stubs von geeigneter Größe und Form für die Probe verarbeitet werden (Abbildung 4 ).
2. Mit feinen Pinzette Klasse und / oder kleine Gauge-Spritze Nadeln kleine Fragmente Position der Probe auf der Spitze einer Metallprobe Stummel.
   1. Reduzieren Sie den Flüssigkeitsgehalt der Probe zu einer klebrigen, Konsistenz leicht kleben durch Abziehen von Flüssigkeit aus dem Rand der Stub mit Filterpapier.
   2. Für einzelne Repliken, verwenden kleine Gauge-Spritze Nadeln auf einen Hügel von Gewebe auf der Stub erstellen. Für Doppel Repliken, kehren andere Stummel und die Position genau über dem Stub und legen leicht auf die Probenoberfläche zu schaffen ein Sandwich (5A). Die Probe aus zwischen den beiden Stichleitungen Drücken Sie nicht.
3. Füllen Sie zwei isolierten Dewargefäßen mit flüssigem Stickstoff. Hinweis: Der erste Behälter nimmt einen Metallpfosten, die einen kleinen Brunnen, der verwendet wird, um ein kleines Volumen von Propangas aus einem handelsüblichen Zylinder (5B) verflüssigt. Der zweite Behälter ist ein partitionierten Speicher / Haltebehälter für kurzely Aufrechterhaltung gefrorenen Proben unter flüssigem Stickstoff.
   1. Verwendung der Zylinder Düse in der Propan gut positioniert, öffnen Sie das Flaschenventil und damit das Gas in den Brunnen des ersten Schiffes, wo es verflüssigt fließen. HINWEIS: ACHTUNG !! PROPANE ist explosiv, kann eiskalt Verletzung auf KONTAKT, und ist ein erstickend. Verwenden Propan Nur in einem Chemieabzug für einen solchen Einsatz die Betreuung auch für Fremd Zündquellen zu vermeiden, mit Kleidungsstücken Schutz gegen die niedrigen Temperaturen und die Aufrechterhaltung ausreichende Lüftung zertifiziert.
   2. So schnell wie möglich, nehmen Sie den Probenhalter mit feinen Pinzette Grade und tauchen sie in das verflüssigte Gas in dem ersten Behälter für einige Sekunden dann schnell in den zweiten Aufnahmebehälter mit flüssigem Stickstoff (5B) zu übertragen.
   3. Sobald die Proben werden eingefroren, speichern unter flüssigem Stickstoff bis bereit, auf die Gefrierbruch-Anlage zu übertragen. Übertragen Sie die Stichleitungen zu einem größeren Speicher flüssigem Stickstoff Dewar Behälter für längereSpeicher wenn gewünscht, jedoch sollte darauf geachtet werden, nicht zuzulassen, die Stubs zu tauen.

3. Betrieb des Gefrierbruch-Gerät und Probenverarbeitung

1. Laden Proben auf dem Messinghalter und in die Kammer
   1. Laden die Goldprobe Stubs in einer Broschüre vom Typ Doppel Replik Probenhalter oder Klemmvorrichtung unter flüssigem Stickstoff und es zu halten, bis Sie sie in der Probenkammer (Abbildung 6) zu positionieren.
   2. Wenn die Kammer hat Hochvakuum (ca. 2 x 10 ^-6 mbar) erreicht und die Bühne wurde auf Temperatur von flüssigem Stickstoff gekühlt wurde, schalten Sie die Pumpe zu entlüften die Kammer, und positionieren Sie die Probe montiert Stubs auf dem Probentisch so schnell wie möglich .
   3. Schalten Sie die Pumpe wieder her, Hochvakuum und elektronische Bühne und Arm der Temperaturregler auf dem Probentisch Temperatur bis -100 ° C und direkte flüssigem Stickstoff auf dem Mikrotom Arm und bri einstellenng es um Temperatur von flüssigem Stickstoff.
2. Die Bruchprozess
   1. Nach Erreichen Hochvakuum, eine Bühne Temperatur von -100 ° C und Mikrotom Arm Temperatur von flüssigem Stickstoff, fern die doppelte Replik Probenhalter dabei zu brechen die Proben auf die Probe Halterungen öffnen (gefrier fracture_movie1.mov).
   2. Im Fall der Proben für das Ätzen folgende Bruch soll, verwenden Sie eine Rasierklinge in einer Klammer gehalten am Mikrotom Arm zu rasieren (dh Bruch) die Oberfläche der Proben anstelle von Schritt 3.2.1 (gefrier etch_movie2.mov).
   3. Wenn die zugegefrier Ätzschritt durchgeführt werden soll, positioniert der gekühlten Mikrotoms Arm über die Bruchflächen für eine bis mehrere Minuten. HINWEIS: Dieses Manöver wird sublimiert (dh Etch) Wasser aus der Bruchfläche. Die Wirkung dieser Manöver ist wahr Zelloberflächen, extrazellulären Matrix und / oder molekulare Aggregate durch Sublimation von Wasser zeigen, zusätzlich zu frald Flächen durch die Lipid-Doppelschicht von Membranen vorbei.
3. Metall-Shadowing und Replika Unterstützung Verdunstung mit Elektronenkanonen
   1. Aktivieren Sie die Platin / Kohlenstoff-Elektronenkanone oder Widerstand und lassen Sie ihn eine dünne Schicht (ca. 2 nm) aus Platin / Kohlenstoff über der Bruchfläche von einem Winkel von 30 ° zu verdampfen - 45 °. Dies erfordert in der Regel etwa 15 bis 20 Sekunden.
   2. Aktivieren Sie die C-Elektronenkanone oder Widerstand, wie in Schritt 3.3.1 und verdampfen eine dünne Schicht von Kohlenstoff zu der gebrochenen Probenoberfläche direkt von oben (90 °), um Unterstützung für die Replik zu geben. Dies erfordert in der Regel etwa 15 bis 20 Sekunden.
4. Abruf von Repliken
   1. Nach Abschluss der Replikation Abschattung und Kohlenstoff-Stabilisierung, schalten Sie die Vakuumpumpe, Entlüftungs die Kammer, und entfernen Sie die Probenhalterung vom Instrument.
   2. Mit einem Paar feine Note Zange nehmen Sie jede Gold Probe Stummel aus der DoppelReplik Broschüre / Klemme und lassen Sie es einige Sekunden, bevor sanft Senkung der Stummel auf eine Wasseroberfläche an einer Stelle, Platte (Abbildung 7) auftauen. HINWEIS: Der Kohlenstoff / Platin Reproduktion mit anhaftenden Probenmaterial wird auf die Wasseroberfläche schwimmen.
   3. Manövrieren Sie die Replikate entweder mit einem feinen Drahtschlinge oder eine herkömmliche Kupfer Elektronenmikroskop Gitter durch feine Note Pinzette und Übertragung auf eine andere Stelle Platte mit 5% Natriumdichromatlösung in 50% iger Schwefelsäure für ein bis mehrere Stunden gehalten. HINWEIS: Dieses Bad verdaut die tatsächlichen biologischen Probenmaterial von der Replik. Voller Stärke Haushaltsbleiche kann für die Dichromat / Schwefelsäure-Lösung ersetzt werden.
   4. Wenn die Verdauung abgeschlossen ist, übertragen Sie die Replik auf eine saubere Wasseroberfläche und auf eine Standard-Kupfer-Elektronenmikroskopie Raster abzurufen. (HINWEIS: Replicas können in kleinere Stücke während der Verdauung zu fragmentieren, aber auch sehr kleine Nachbildungen können wesentliche Informationen enthalten und sollte ret seinieved und untersucht.) Store Replik Unterstützung Netze in handelsüblichen Gitterboxen, wo sie seit Jahren stabil mit leichter Handhabung zu bleiben.

4. Ultrastrukturelle Untersuchung der Gefrierbruch-/ Etch Replicas

1. Ansicht Replikate in einem Transmissionselektronenmikroskop mit einer Beschleunigungsspannung typischerweise 50 bis 80 kV.
2. Nehmen Sie relevante Bilder auf Standard-TEM-Film oder mit einer hochauflösenden digitalen Kamera.

Ergebnisse

Der Schlüssel Prämisse der Gefrierbruch-Bild Interpretation ist, dass Bruchflächen durch die Lipid-Doppelschicht von Membranen verleihen beiden Bruchflächen, durch das Übereinkommen der PF-Fläche (Plasma-Fraktur-face) und EF-Gesicht (extrazelluläre Fraktur-face) (Abbildung genannt geben 3). Der PF-Fläche die Hälfte der Membranlipiddoppelschicht angrenzend an das Zytoplasma der Zelle und der EF-Fläche die Hälfte der Membranlipiddoppelschicht angrenzend an das extrazelluläre Milieu. Die G...

Diskussion

In den Jahren nach seiner Einführung und kommerzielle Verfügbarkeit, Gefrierbruch / Etch Verfahren wurden häufig für Untersuchungen der biologischen Membran-Struktur genutzt. In der Tat haben die besten Perspektiven der einige der strukturellen Spezialisierungen von Membranen in der Gefrierbruch / Etch Präparate erhalten. Diese Studien nicht nur dazu beigetragen, das Verständnis der strukturellen Organisation der Membranen, sondern auch Einblicke in Struktur und Funktion bezogen sind.

Das Au...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Balzers Gefrierbruch-/Gefrierätzanlage	Balzers	BAF400T
Standardpuffer	diverse Lieferanten
Standard Aldehyd Fixiermittel	diverse Lieferanten
Natriumdichromat	diverse Lieferanten
Schwefelsäure	diverse Lieferanten
Einwegartikel für Platin/Kohlenstoff-Verdampfung	Technotrade International
Flüssigstickstoff	diverse Lieferanten
Propan	diverse Lieferanten
Einwegartikel für die Elektronenmikroskopie	Elektronenmikroskopie Elektronenmikroskopie Sciences
Transmissionselektronenmikroskop	Carl Zeiss Inc.