Microscale Vortex-unterstützte Electroporator für Sequential Molekulare Liefer

Summary

Eine mikrofluidische Vortex Assisted Elektroporation Plattform wurde für die sequentielle Übertragung mehrerer Moleküle in Zellpopulationen identisch mit präzisen und unabhängigen Steuer Dosierung entwickelt. Größe basiert Zielzelle Reinigungsschritt voran Elektroporation des Systems geholfen, um molekulare Lieferung Effizienz und verarbeitet die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern.

Abstract

Elektroporation wurde zunehmende Aufmerksamkeit in den letzten Jahren erhalten, weil es ein sehr leistungsfähiges Verfahren zum physikalischen Einführen nicht-durchdringenden exogenen molekulare Sonden in Zellen. Diese Arbeit berichtet über eine mikrofluidische Plattform Elektroporation der Lage ist, mehrere Molekül Lieferung an Säugetierzellen mit präzisen und molekularen abhängigen Parametersteuerung. Die Fähigkeit des Systems, um Zellen mit einheitlicher Größenverteilung zu isolieren lässt weniger Variation in Elektroporationseffizienz pro gegebenem elektrischen Feldstärke; damit verbesserte Probenfähigkeit. Darüber hinaus ermöglicht die Beobachtung des Fluoreszenzmolekularaufnahmeprozess in Echtzeit, die prompt Molekular Lieferung Parametereinstellungen zur Effizienzsteigerung ermöglicht in situ seine Prozessvisualisierungsfunktion. Um die riesigen Möglichkeiten der Plattform gemeldet zeigen, Makromoleküle mit verschiedenen Größen und elektrische Ladungen (zB Dextran mit MW von 3.000 und 70.000 Da) warengeliefert metastasierendem Brustkrebs-Zellen mit hoher Fördereffizienzen (> 70%) für alle getesteten Moleküle. Die entwickelte Plattform wurde das Potenzial für den Einsatz in den Ausbau der Forschungsfelder, wo auf dem Chip Elektroporationstechniken von Vorteil sein kann bewiesen.

Introduction

In den letzten Jahren hat die Verwendung von elektrischen Impulsen an das cytosolische Abgabe von extrazellulären Molekülen erleichtern zu einem attraktiven Mittel zum Manipulieren Säugerzellen. ¹ Dieses, auch als Elektroporation bekannt ist, reversibel permeabilisiert der Zellmembran, so dass für inhärent Membran undurchlässig Moleküle um Zugang zu erhalten intrazellulären Milieu der Zellen. Da praktisch jedes Molekül in das Cytosol über temporäre erzeugt Poren in der Membran von jeder Art von Zellen unter Verwendung von Elektroporation eingebracht werden, ist die Technik, wie berichtet, wobei reproduzierbarer, universell einsetzbar und effizienter als an....

Protocol

1. Zellpräparation

1. Platte 1 × 10 ⁵ Zellen / ml von metastatischen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 in einem Volumen von 10 ml pro Gewebekultur T75-Kolben in Leibovitz L-15-Medium, ergänzt mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin.
2. Inkubieren MDA-MB-231-Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C bei 0% CO _2-Umgebung.
3. Ernten der Zellen für Experimente 2 Tage nach der Saat, indem man die Zellen mit 0,25% Trypsin-EDTA für 2 min und Inaktivierung der enzymatischen Aktivität von Trypsin durch Zugabe von 8 ml Wachstumsmedium.
4. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 200 × g....

Results

Der entwickelte parallele mikrofluidische Elektroporator geliefert Makromoleküle mit verschiedenen Größen und elektrische Ladungen in lebende metastasierendem Brustkrebs-Zellen. Erfolgreiche Molekularliefer wurde qualitativ durch Überwachung von Veränderungen in der Fluoreszenzintensität des elektroporierten umlaufenden Zellen in situ bestimmt und durch quantitative Messungen mittels Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt. 4A zeigt, dass 90% der behandelten Zellen Auffassung 70.000 Da neutral D.......

Discussion

Mit der neuen Plattform parallelisiert Elektroporation, 10-fache Verstärkung in Durchsatz und Effizienz von Multi-Molekül Lieferung wurde zusätzlich zu all den Vorzügen, die die zuvor entwickelten Ein-Kammer-System bietet erreicht. Bisher ¹⁸ verfügbar Verdienste umfassen (i) Vorreinigung Zielzellen mit einheitlicher Größenverteilung für die Lebensfähigkeit Verbesserung, (ii) präzise und individuelle molekulare Dosierungssteuerung, und (iii) geringe Betriebs elektrischen Strom. Fluoreszierend markierte Dextran.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 Krebszelllinie	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-26
Leibovitz s L-15 Medium	Cellgro, Mediatech, Inc.	10-045-CV
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco, Life Technologies	16000-044
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Cellgro, Mediatech, Inc.	21-030
Trypsin	Gibco, Life Technologies	25200-056
Durchflusszytometer easyCyte HT	Millipore	0500-4008
Sauerstoff-Plasmareiniger	Technics Micro-RIE
Dektak 6M Oberflächenprofiler	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 SILIKONELASTOMER KIT	Dow Corning
Compressed Nitrogen Gas	Airgas	NI 300
Hochdruckregler	McMaster-Carr	6162K22
Downstream-Regler	McMaster-Carr	4000K563
Hochgeschwindigkeits-3/2-Wege-8-Ventilblock	Festo
Inline-Rückschlagventil	Idex Health and Science	CV3320
5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan-Rohre	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" OD X 0,17" ID Polyurethan-Rohre	Pneumadyne	PU-250PB-4
1/16" PEEK-Schläuche	Festo	P1533
1/32" PEEK-Schläuche	Idex Gesundheit und Wissenschaft	P1569
PEEK-Schlauchverschraubungen	Idex Gesundheit und Wissenschaft	P881
Impulsgeber	HP	8110A
Aluminiumdraht	Bob Martin Company	6061 ALUM
Oszilloskop	Agilent	DSO3062A
50 ml Zentrifugenröhrchen	VWR	21008-178
15 ml Zentrifugenröhrchen	VWR	21008-216
T75 Kulturflasche	VWR	82050-862
Dextran, Tetramethylrhodamin, 3.000 MW, anionisches	Gibco, Life Technologies	D3307
Dextran, Tetramethylrhodamin, 70.000 MW, neutral	Gibco, Life Technologies	D1819
Dextran, Texas Red, 3.000 MW, neutral	Gibco, Life Technologies	D3329