Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A Trichoderma reesei In Tabakpflanzen

Summary

Tabakpflanzen wurden verwendet, um eine Pilz-Cellulase, TrCel5A erzeugen, über einen transienten Expressionssystem. Die Expression kann unter Verwendung eines fluoreszierenden Fusionsproteins überwacht werden, und die Proteinaktivität wurde nach der Expression charakterisiert.

Abstract

Zellulose abbauende Enzyme, Cellulasen, sind Ziele der Forschung und industriellen Interessen. Das Übergewicht dieser Enzyme in schwer Kulturorganismen wie Hyphen bild Pilze und anaeroben Bakterien, ist die Verwendung von rekombinanten Technologien in diesem Bereich beschleunigt. Pflanzenexpressionsverfahren sind ein wünschenswertes System zur großtechnischen Herstellung von Enzymen und anderen industriell nützlichen Proteinen. Hierin sind Verfahren für die transiente Expression eines Pilz-Endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A in Nicotiana tabacum demonstriert. Erfolgreiche Proteinexpression angezeigt wird, durch Fluoreszenz mit einem mCherry-Enzym-Fusionsproteins überwacht. Zusätzlich ist ein Satz von Basistests werden verwendet, um die Aktivität von transient exprimierten T. prüfen reesei Cel5A, einschließlich SDS-PAGE, Western Blot, Zymographie, wie Fluoreszenz-und farbstoffbasierten Substratabbau Assays. Das hier beschriebene System kann auf eine aktive Zelle verwendet werdenULASE in einer kurzen Zeitperiode, um so das Potential für die weitere Produktion in Pflanzen durch konstitutive oder induzierbare Expressionssysteme zu beurteilen.

Introduction

Der Abbau von Lignocellulose-Biomasse und deren Umwandlung in flüssigen Kraftstoff als ein Verfahren, um die Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen verringern vorgestellt worden. Eine wesentliche Hürde bei der Gründung wirtschaftlich machbar Biomasse Verarbeitungssysteme ist in den enzymatischen Abbau von Cellulose und Hemicellulose ^ein. Pflanzenexpressionssystemen zeigen großes Potenzial für die Produktion von Enzymen im industriellen Maßstab. Landwirtschaftliche Anlagen bis zur Ernte Pflanzen wirtschaftlich und Volumen bereits etabliert sind, wie sie seit Tausenden von Jahren. Die Produktion von Cellulasen in Pflanzen aufgrund von Faktoren wie die ....

Protocol

1. Wachstum von Wildtyp N. tabacum Pflanzen

1. Um N. wachsen tabacum L. cv. Petit Havana SR1 Pflanzen auf Erde, legen Tabaksamen über geeignete Töpfe mit normaler Blumenerde für die Keimung gefüllt. Nach 2 Wochen übertragen Sämlinge auf einzelne Töpfe. Inkubieren Pflanzen in einem Gewächshaus mit konstanten 22 ° C (dunkle Zeit) bzw. 25 ° C (Lichtperiode) und die relative Luftfeuchte 70%. Geben Beleuchtung in einem 16/8 h Licht / Dunkel-Zyklus (zB Philips IP65 400 W-Lampen, 180 mmol · s ^-1 · m ^-2; λ = 400-700 nm) und Wasser täglich.

2. Transiente Expression von TrCel5A u....

Results

TrCel5A und TrCel5A-mCherry wurden erfolgreich in Tabakpflanzen unter Verwendung des transienten Expressionssystem (1A und 1B) ausgedrückt. Die Untersuchung der Expressionsmuster des TrCel5A mCherry-Fusionsprotein zeigte gesunde Blätter (1C), die weit verbreiteten Proteinexpression unter grünen Licht (1D) zeigte.

Extraktion der gesamten löslichen Proteine ​​wurden auf Tabakpflanzen, die Blätter, die enthalten waren durch die.......

Discussion

Rekombinante Expression von Cellulasen ist ein Feld von großem Interesse, auf den Wunsch nach effizienteren Produktion von Biokraftstoffen Systeme ^ein. Pflanzen bieten viele Möglichkeiten für eine erfolgreiche Cellulaseproduktion, mit Funktionen wie wirtschaftliche Erntetechniken und Methoden Autohydrolyse sehr wünschenswerte Eigenschaften für eine groß angelegte Produktion von Biokraftstoffen. Ferner ist die Verwendung von verschiedenen Lokalisierungen zur Herstellung von Proteinen erlauben, falls erforderli.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Methylumbelliferyl β-D-Cellobiosid	SIGMA-ALDRICH	M6018
Essigsäure	ROTH	3738
Acetosyringon (konzentriert)	ROTH	6003
Antibiotikum - Kanamycin	ROTH	T832
Antibiotikum - Rifampicin	ROTH	4163
Antibiotikum - Carbenicillin	ROTH	6344
Antikörper - Kaninchen anti His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
Antikörper - Ziege anti Kaninchen AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carboxymethylcellulose	MEGAZYME	S-ACMC
β-Cyclodextrin	SIGMA-ALDRICH	C4805
Calciumchlorid-Dihydrat	SIGMA-ALDRICH	C5080
Carboxymethylcellulose	ROTH	3333.1
Cellulase aus Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
Kongorot	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie brillantblau G 250	ROTH	9598.2
D(+)-Glukose	ROTH	8337
Ethanol	ROTH	K928
Filterpapier - Rotilabo Löschpapier	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
MES Puffer	ROTH	4256
Methanol	ROTH	8388
Natriumcitrat	ROTH	3580
Natriumdodecylsulfat	SERVA	20765
Natronlauge	ROTH	6771
Boden, Einheitserde classic	PATZER GMBH
Spektrometer - Unendlich M200	TECAN
Saccharose	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-Hydroxybenzhydrazid	SIGMA-ALDRICH	H9882
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	ROTH	1058
UV-Lichtquelle - BLAK RAY	UVP
Vibratome - VT1000S	Leica