Transplantation von Haut-Schwanz zu allogene CD4-T-Zellantworten in Mäusen untersucht

Zusammenfassung

Die Schwanzhauttransplantation ist ein leistungsfähiges Modell zur Untersuchung der T-Zell-abhängigen Abstoßung und Toleranzinduktion während allogener Immunantworten bei Mäusen. Die Vorteile dieses Protokolls sind kleinere invasive Eingriffe und eine einfache Überwachung, ohne dass die Empfängermaus geopfert werden muss.

Zusammenfassung

Die Untersuchung von T-Zell-Antworten und deren Konsequenzen bei der Erkennung von Allo-Antigenen erfordert ein Modell, das es ermöglicht, zwischen Spender- und Wirts-T-Zellen zu unterscheiden, das Transplantat einfach zu überwachen und das System anzupassen, um verschiedene immunologische Fragen zu beantworten. Medawar und Kollegen etablierten 1955 die allogene Schwanzhauttransplantation bei Mäusen. Seitdem wurde das Hauttransplantationsmodell kontinuierlich modifiziert und angepasst, um spezifische Fragestellungen zu beantworten. Durch die Verwendung von Schwanzhaut ist dieses Modell leicht für die Abstoßung von Transplantaten zu bewerten, erfordert weder eine umfangreiche Vorbereitung noch eine tiefe Anästhesie, ist auf Tiere aller genetischen Hintergründe anwendbar, verhindert ischämische Nekrosen und ermöglicht chemische und biologische Eingriffe.

Im Allgemeinen sind sowohl CD4⁺ als auch CD8⁺ allogene T-Zellen für die Abstoßung von Allotransplantaten verantwortlich, da sie nicht übereinstimmende Haupthistokompatibilitätsantigene aus verschiedenen Mausstämmen erkennen. Es wurden mehrere Modelle für die Aktivierung allogener T-Zellen in hauttransplantierten Mäusen beschrieben. Die Identifizierung von Molekülen der Klassen I und II des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) in verschiedenen Mausstämmen, einschließlich C57BL/6-Mäusen, war ein wichtiger Schritt zum Verständnis und zur Untersuchung von T-Zell-vermittelten Alloantworten. In dem hier beschriebenen Schwanzhauttransplantationsmodell reicht eine Drei-Punkt-Mutation (I-A^bm12) in der Antigen-präsentierenden Rille des MHC-Klasse II (I-A^b) Moleküls aus, um eine starke allogene CD4⁺ T-Zellaktivierung in C57BL/6-Mäusen zu induzieren. Hauttransplantate von I-A^bm12-Mäusen an C57BL/6-Mäusen werden innerhalb von 12-15 Tagen abgestoßen, während syngene Transplantate bis zu 100 Tage akzeptiert werden. Das Fehlen von T-Zellen (CD3^-/- und Rag2^-/- Mäuse) ermöglicht eine Hauttransplantatakzeptanz von bis zu 100 Tagen, die durch den Transfer von 2 x 10⁴ Wildtyp- oder transgenen T-Zellen überwunden werden kann. Adoptiv übertragene T-Zellen vermehren sich und produzieren IFN-γ in I-A^{bm12-transplantierten} Rag2^-/- Mäusen.

Einleitung

Transplantation von soliden Organen wie Haut, Herz und Nieren ist inzwischen ein Standardverfahren in der medizinischen Praxis weltweit ^ein. Erfolgreich transplantierten Organen kann durch Aktivierung des Immunsystems des Empfängers, der die Haupt-Histokompatibilitäts-Antigene des Spenders erkennt zurückzuweisen. Daher transplantierten Patienten müssen die Behandlung mit Immunsuppressiva ^2. Die allogene Hauttransplantation bei Mäusen wurde durch Medawar und Kollegen im Jahr 1955 gegründet und war hilfreich für die Identifizierung der Zielmoleküle später als Major Histocompatibility Complex (MHC) Klasse I und II beschrieben. Seitdem hat sich die Haut Transplantationsmodell kontinuierlich modifiziert und angepasst ist, um die Rolle der T-Zelluntergruppen und die Bedeutung von chemischen und biologischen Intervention bei der Unterdrückung der Abstoßung ^2-4 studieren. Haut aus dem Ohr und Rumpf sind schwieriger herzustellen und sind anfälliger für Hypoxie und Nekrose als Schwanzhaut ^5; jedochdas Transplantationsverfahren ist ähnlich. Neben der Überwachung der Schwanzhauttransplantaten ist einfach aufgrund der charakteristischen Haarstruktur der Haut.

Dieser Artikel enthält eine detaillierte Prozedur für die MHC-Klasse-II-Fehlanpassung Schwanzhauttransplantation, die für die Untersuchung verschiedener Aspekte der CD4 ⁺ T-Zell-vermittelten Abstoßung und Toleranz bei Mäusen ermöglicht. Die natürliche Dreipunktmutation in der MHC-Klasse-II-Molekül IA ^b (genannt IA ^{BM12) 6-9} ist ausreichend, um eine Abstoßung von Hauttransplantate in C57BL / 6 Mäusen ⁸ induzieren. Die IA ^BM12 Molekül aktiviert CD4 ⁺ T-Zellen mit verschiedenen αβ-T-Zellrezeptor (TCR)-Ketten von C57BL / 6 Mäusen, unter denen Vα2Vβ8-TCR-spezifische T-Zellen, um eine TcR-transgenen Maus ¹⁰ erzeugt identifiziert. Der adoptive Transfer von Vα2Vβ8-TCR-spezifische T-Zellen wurde verwendet, um eine Abstoßungsmodell in immundefizienten C57B etablierenL / 6 Rag2 ^{- / -} Mäuse mit IA ^BM12 Haut transplantiert.

Genetische Unterschiede zwischen Spender und Empfänger beeinflussen das Ergebnis der Transplantat-Akzeptanz und Zurückweisung. Es gibt verschiedene Arten von Transplantationen: autologen Transplantationen sind vom Empfänger Individuum selbst; syngrafts und Allografts sind Transplantationen von genetisch identisch und genetisch nicht verwandten Individuen sind. Akzeptanz unterschiedlicher allogenen Organtransplantationen durch chemische und biologische Intervention bei Patienten und Mausmodellen ^11,3,4 nachgewiesen. In einem grundlegenden Ansatz zeigte anti-CD3-Antikörper-behandelten C57BL / 6 Mäuse verlängerten Überlebenszeit von IA ^BM12 tail-Haut (unveröffentlichte Daten). Depletion von CD4 ⁺ und CD8 ⁺ T-Zellen vor der Transplantation in Empfängermäuse führte die Annahme der MHC-Klasse I und II nicht übereinstimm Transplantate (rev. ^12). Interessanterweise Abstoßung von Hauttransplantaten, von der Anwesenheit von CD4 ⁺ T-Zellen (rev. ^12). In diesem Modell, auf bestimmte Interaktionen zwischen den verschiedenen Immunzellen durch Blockierung kostimulatorische Moleküle mit Antikörpern oder Unterdrückung der regulatorischen T-Zellen könnte Toleranz (unveröffentlichte Daten) zu induzieren. In der Tat, Sperrung sowohl CD40 und CD28 führte zu langfristigen Hauttransplantattoleranz ^13,14.

Schwanz-Hauttransplantation ist einfach durchzuführen und einfach zu überwachen, im Vergleich zur Transplantation anderer Organe. Darüber hinaus sind Schwanzhauttransplantate leicht herzustellen und sind weniger anfällig für Ischämie als andere Hautgewebe. Im Gegensatz zu injizierenden Anästhetika, die Verwendung von Narkosegas (Isofluran) während der Transplantation verkürzt sowohl die Verfahren und Empfänger Erholungszeit. Curling der Schwanzhaut-Transplantation, die unvollständig Wundheilung und Transplantat-Abstoßung führen kann, wird durch die Anwendung von Gewebekleber verhindert. Darüber hinaus wird die ^IA-BM12 Schwanz Hauttransplantation Modell aktiviert CD4 ausschließlich ^{+ T-Zellen sowohl in der immunkompetenten und immungeschwächten Mäusen (aus dem gleichen genetischen Hintergrund) die Erleichterung der Interpretation der Ergebnisse.}

Dieses Protokoll beschreibt einen zuverlässigen, reproduzierbaren und leicht überwacht Maus-Modell, das für die chemische und biologische Eingriffe ermöglicht. Das Modell ist für die Untersuchung von Ablehnung und Toleranzinduktion von tail-Hauttransplantationen vorgesehen.

Protokoll

In diesem Video-Veröffentlichung und Protokoll wurden alle Tier Verfahren in Übereinstimmung mit der von der Kantonsbehörde Basel-Stadt, Schweiz zugelassenen Tier Protokoll durchgeführt. Führen Sie alle in sterilen Bedingungen, soweit möglich.

1. Vorbereitung der Chirurgie

1. Autoklav alle chirurgischen Instrumenten und Gaze vor dem Gebrauch.
2. Erhitzen Sie die warmen Kissen und organisieren chirurgische Instrumente auf dem Tisch (Table of Materialien / Methoden).
3. Öffnen Sie die Fingerleiste Bandagen. Vaseline auf die Wundauflage mit einem Wattestäbchen (sicherstellen, dass die Gaze vollständig bedeckt ist).
4. Wiegen Sie die Mäuse und verwalten Analgesie Buprenorphin 0,05 mg / kg Körpergewicht. Hinweis: dies wird Analgesie unmittelbar nach der Transplantation bieten.

2. Vorbereitung der Schwanzhaut für Transplantation

1. Euthanize Spendermäusen (zB IA ^BM12) pro CO _2-Erstickung und disinfect die Schwänze mit Desinfektionslösung vor Exzision.
2. Positionieren Sie den Schwanz mit dem schwarzen Streifen unten auf eine saubere Plastikbrett und schneiden Sie es in Längsrichtung über die Mittellinie, so dass eine oberflächliche Inzision, die nur die Hautschicht.
3. Ziehen Sie die Haut vom Schwanz mit Greifzange.
4. Setzen Sie den Schwanz-Haut in einer 10 cm Zellkulturschale mit 10 ml HBSS gefüllt.

3. Chirurgisches Vorgehen

1. Betäuben Empfängermäuse (beispielsweise C57BL / 6) durch Inhalation einer 3% Isofluran Lösung in einem transparenten Induktionsfeld. Hinweis: Es dauert 3-5 min für die Maus, um chirurgische Anästhesie-Ebene zu erreichen. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.
2. Legen Sie die Maus auf den warmen Pad und gelten 1,5% Isofluran über eine Mundmaske und Esel jedes Tier Reflex Zehen Kneifen.
3. Rasieren Sie die dorsale Seite der Empfängermäuse (zB C57BL / 6) und entfernen verunreinigende Haare mit einem trockenen Gaze swab.
4. Desinfizieren Sie rasiert Transplantation Website mit aseptischen Lösung.
5. Klemmen Sie die Haut mit einer Pinzette in der Mitte / rechts Seite des Rückens und einer gebogenen Schere verwenden, um eine Runde Schnitt von etwa 1 x 0,6 cm zu machen.
6. Wenn Blutungen auftreten, dann reinigen Sie die Wunde mit einem sterilen Wattestäbchen.
7. Bewerten Sie die Größe des Einschnitts und schneiden eine Transplantation von der geschätzten Größe von der Schwanzhaut mit dem Skalpell.
8. Schneiden Sie die Ecke der Transplantation runden.
9. Laden Sie die Transplantation auf dem Skalpell, trockenen Überschuss von HBSS auf einem sterilen Wattestäbchen und legen Sie sie in das Transplantat Bett der Empfängermaus.
10. Vermeiden Sie Überlagerung von Spender und Empfänger Haut und wenden Gewebekleber auf die Kontaktzone ausschließlich.
11. Tragen Sie eine Putz ohne Falten rund um die Maus Taille.
12. Kleber nicht-elastische Binde, das Pflaster auf die Maus zu beheben (3 mm verschoben).
13. Einzuschneiden mit der Schere etwa 3 mm im oberen ventralen Stelle der Bandage. Hinweis: Dies ist zu vermeiden, trapping von der Maus die Zähne während der Erholungsphase.
14. Entfernen Sie die Narkose-Mund-Maske und halten die transplantierten Mäusen auf dem Heizkissen bis wach.
15. Zurück transplantierten Mäusen in ihre Käfige nur bei vollständig erholt und beurteilen ihre Mobilität zu gewährleisten, dass der Verband nicht zu eng.
16. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit 70% Ethanol, bevor mit der nächsten Operation fortfahren.

4. Post-operative Betreuung

1. Hinzufügen Paracetamol enthaltenden Sirup zum Trinkwasser (4 mg / ml) und zu verwalten, für 7 Tage.
2. Zurück Maus an den Tierraum, sobald sie sich erholt hat.
3. Mäuse auf klinische Anzeichen wie Depressionen oder andere Verhaltensänderungen (Essen oder Immobilität), abnorme Erscheinung (mangelnde Pflege) oder Körperhaltung (Piloerektion oder gekrümmte Haltung) für die Zeit, die Binde ist vorhanden (1 Woche) genau beobachten.

5. Bandage Removal (6-7 Tage nach der Transplantation)

1. Anesthetize Mäuse durch Inhalation einer 3% Isofluoran Lösung in einem transparenten Induktionsfeld (siehe oben).
2. Schneiden Verband und Gips mit Arterie Schere und sorgfältig zu entfernen. Hinweis: Vermeiden Sie Strecken des Transplantations Ort.
3. Überwachen Sie den transplantierten Mäusen für die klinische Anzeichen (siehe 4.3) und Punkte für die Ablehnung von Hauttransplantaten (Tabelle 1). Hinweis: Das Transplantat Score-System nutzt die Vorteile der verschiedenen Haartypen auf den Schwanz-Haut im Vergleich zu der Rückenhaut. In drei Typen wird das Aussehen des Transplantates und seiner Ablehnung kategorisiert. Die allogene Haut (MHC II nicht übereinstimm, z. B., IA ^BM12) Transplantate von C57BL / 6 immunkompetenten Mäusen in der Regel innerhalb von 12 bis 15 Tage nach der Transplantation (eigene Daten und ^15-20) abgelehnt.

Ergebnisse

In einem ersten Ansatz wurden C57BL / 6 Mäuse mit IA ^BM12 Allografts und IA ^b syngrafts transplantiert. Bandage nach Entfernung Transplantate offensichtlichen Anzeichen der Wundheilung ohne Schließung der Kontaktzone in C57BL / 6 Mäusen (Fig. 1A). Bandage nach Entfernung führte CD4 ⁺ T-Zell-vermittelte Entzündung zu dem Auftreten von Nekrosen (rote Punkte) und Ablehnung IA ^BM12 Allotransplantaten in C57BL / 6 Mäusen innerhalb von 13 Tagen nach der Transplantat...

Diskussion

Hauttransplantation ist ein weit verbreitetes Verfahren zur Untersuchung Ablehnung und Toleranz abhängig von T-Zellen. Da die Haut Transplantationsmodell gegründet wurde, wurden mehrere Anpassungen und Änderungen angewandt. Bei dem beschriebenen Verfahren wird ^IA-BM12 Schwanz Hauttransplantation durchgeführt unter Verwendung von Narkosegas (Isofluran). Die Verwendung von Gas Narkose verringert die Zeit der Ausführung und Mäuse Erholung, die die Belastung der transplantierten Mäusen abnimmt. Das Verfahren besc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Betadine Standardlösung	Mundipharma
Wattestäbchen	Carl Roth GmbH	31025060
Dafalgan , UPSA	Bristol Myers Squibb UPSA
Hansaplast Fingerstreifen	Beierdorf AG	REF.76861
Histoacryl Gewebekleber	Braun	REF.1050052
Leukotape classic , 2 cm x 10 m	BSN Medical SAS	REF.02204-00
PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4	Invitrogen	10010015	GIBCO
Sterile Gaze, 5 x 5 cm, 8-lagig	MaiMed GmbH	21010
Zange mit schmalem Muster	FST	11003-12
Feine Irisschere gebogen	FST	14095-11
Feine Irisschere	FST	14094-11
Mayo-Schere	FST	14010-15
Arterienschere Kugelspitze 11,5 cm	FST	14080-11
Gewebezange	FST	11021-14
Chirurgische Klinge Nr. 20	Swann-Morton LTD	3006	Kohlenstoffstahl
Chirurgische Klingengriffe	Swann-Morton LTD
Spritze, 1 ml	ARTSANA		Einweg
Temgesic, Buprenorphin	ESSEX Chemie AG		0,3 mg/ml
Gewebekulturschalen 10 cm, 60,1 cm2	TPP
Vaseline	Vifor SA
Warmes Pad	Solis		Typ 223