Summary
Este protocolo describe el uso de reacciones de acoplamiento de amida del ácido isonicotínico y diaminoalcanos para formar ligandos puente adecuados para su uso en la síntesis de complejos de platino multinucleares, que combinan aspectos de los medicamentos contra el cáncer BBR3464 y picoplatin.
Introduction
Medicamentos contra el cáncer de platino siguen siendo uno de la familia más ampliamente utilizado de los agentes en el tratamiento del cáncer humano 1. A pesar de su éxito, que están limitadas en su aplicación por los efectos secundarios limitantes de la dosis graves 2-4. Las dosis limitadas que pueden ser administrados a pacientes que también significa que los tumores pueden desarrollar resistencia 5. Como tales, los nuevos medicamentos se siguen desarrollando para mejorar el perfil de efectos secundarios y superar la resistencia adquirida, como phenanthriplatin 6 y 7 phosphaplatin.
A finales de 1990, un fármaco de platino trinuclear fue desarrollado, BBR3464 (Esquema 1) 8, es decir hasta 1000 veces más citotóxica in vitro de los principales fármacos de platino, cisplatino. BBR3464 también es capaz de superar la resistencia adquirida en un panel de líneas celulares de cáncer humano 9. Desafortunadamente, el aumento de la actividad de BBR3464 se corresponde con 50 - a 100 - veces mayor toxicidad, quelimita su uso 10-12. También se degrada fácilmente en el cuerpo, es decir, un poco del medicamento alcanza núcleos intactos cáncer 9.
Picoplatin es un fármaco a base de platino mononucleares que contiene un ligando 2-metil-piridina (Esquema 1) 13. El grupo metilo de este fármaco protege del ataque por nucleófilos biológicos; en particular, la cisteína y la metionina que contiene péptidos / proteínas 14-16. Como tal, el fármaco es muy estable y tiene una concentración mucho más alta que llega a los núcleos de cáncer en comparación con tanto BBR3464 y cisplatino 17. Su reactividad reducida también significa picoplatin tiene una dosis máxima tolerada más alta en comparación con BBR3464 y cisplatino 10,18,19.
Por tanto, este proyecto se propuso combinar las propiedades de BBR3464 y picoplatin para producir nuevos medicamentos que son capaces de superar la resistencia adquirida que se vea mejorada la estabilidad biológica y menos severa lado-efeCTS (por ejemplo, Figura 1). De este modo, una gama de complejos de platino dinucleares se prepararon con ligandos bispiridina puente 20. Los ligandos se realizan mediante reacciones de acoplamiento de amida con ácido isonicotínico, o sus derivados, como el 2-metil-isonicotínico, diaminoalcanos de longitud variable. La reacción de un equivalente molar de los ligandos con dos equivalentes molares de transplatin produce los complejos de platino deseados (Esquema 1).
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Protocol
1 Síntesis de la N, N '-. (, N-alcano-diilo 1) diisonicotinamide
- Secar un solo cuello o matraz de fondo redondo de tres bocas en un horno (100 º C, 1 h) para asegurar que se elimina toda la humedad.
- Añadir ácido isonicotínico sólido, o su derivado, en el matraz junto con una barra de agitación magnética. Si el ligando (s) diaminoalcano son sólidos a temperatura ambiente, a continuación, 0,5 mol (a los moles número de ácido isonicotínico) se añadió al matraz en esta etapa.
- Se tapa el cuello (s) del matraz con tabiques de caucho y reemplazar el aire en el matraz con nitrógeno, ya sea a través de una corriente continua de nitrógeno o mediante el uso de globos lleno de nitrógeno.
- Utilice una aguja hipodérmica y una jeringa para añadir dimetilformamida o dimetilsulfóxido anhidro (4 ml por 500 mg de ácido isonicotínico o ácido 2-metil-isonicotínico) para disolver el sólido. Si los sólidos no se disuelven fácilmente, a continuación, calentar la solución suavemente.
- Añadir 7 equivalentes molares (a la unamonte de ácido isonicotínico utilizado) de trietilamina (base débil) y 0,5 equivalentes molares del diaminoalcano. Si la solución es un líquido a temperatura ambiente, a continuación, añadir 1,5 equivalentes molares.
- Añadir un equivalente molar de anhídrido 1-propilfosfónico (agente de acoplamiento) con agitación continua y permita que la reacción se complete durante 5-12 horas.
2. La purificación de los ligandos
- Para bispiridina ligandos hechas usando ligandos diaminoalcano con 10 o más grupos metileno, esperar a que los productos a precipitar de la solución a medida que avanza la reacción.
- Para bispiridina ligandos hechas usando diaminooctano, precipitar el producto mediante la adición de ~ 40 ml de agua.
- Para bispiridina hizo usando diaminoalcanos de cinco y cincuenta y ocho grupos metileno, añadir ~ 40 ml de agua y permite que los compuestos se cristalizan a más de 1-3 días.
- Recoger cada ligando bispiridina por filtración a vacío y se recristaliza a partir de aproximadamente 400-500 ml de agua hirviendo por 200mg de ligando. Nota: Se necesita más agua para los ligandos ya bispiridina debido a su reducida solubilidad en agua.
- Añadir NaOH y KOH (pH 9) a la solución para asegurar que los compuestos son bases libres mediante recristalización.
3. Síntesis y purificación de los dinucleares de platino Complejos
- Disolver completamente trans-diamminodichloridoplatinum (II), transplatin, en (70-80 º C) agua caliente (150 ml por 200 mg de transplatin) para producir una solución de color amarillo claro con fuerza.
- Añadir un 0,5 equivalente molar del ligando bispiridina y se agita la solución a temperatura hasta que se disuelva ligando (solución clara). Espere a que la solución para convertir casi incoloro, se apaga el fuego, y se agita a temperatura ambiente durante un par de horas adicionales.
- Eliminar el disolvente por evaporación rotatoria, que dar un polvo de color amarillo.
- Purifica, el complejo de platino (es) por disolución en una cantidad mínima de agua caliente (~ 50 y# 186; C). Si los sólidos restantes de color amarillo o blanco están presentes, después se filtra fuera de estos.
- Añadir acetona a la solución hasta que se forma un precipitado blanco que parece ser una forma polimérica de los complejos metálicos y representa hasta el 10% del producto de reacción. Continuar la adición de acetona (~ extras 20-30 ml) hasta que no aparezca más precipitado. Nota: este precipitado blanco es una impureza.
- Eliminar este precipitado por filtración de los contenidos a través de papel de filtro de nylon (0,2 m de tamaño de poro) y rotatorio evaporación de la solución restante a sequedad, lo que dió un producto puro. Nota: Si es necesario, etapas de precipitación en acetona y luego adicionales se pueden realizar hasta el complejo es puro.
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Representative Results
Los ligandos bispiridina y sus respectivos complejos de platino dinucleares se caracterizan por 1 H, 13 C y 195 Pt RMN (Tablas 1 y 2), y espectroscopia de masas con ionización por electrospray. Puntos de fusión precisas se pueden determinar usando calorimetría diferencial de barrido y la pureza se determina mejor mediante análisis elemental para C, H y N contenido en porcentaje. De mayor uso es de 1 H RMN ya que es rápido y fácil de usar, dando resultados en cuestión de minutos de aislamiento de los productos finales con resonancias que puedan demostrar definitivamente exitosas de acoplamiento de amida y de coordinación de platino (Tablas 1 y 2).
Ácido isonicotínico tiene tres resonancias; dos dobletes en la región aromática (7 a 9 ppm) y una muy amplia resonancia alrededor de 13 ppm para el protón del ácido carboxílico. Las resonancias de protones diaminoalcano están ubicados en la región alifática entre 1 y 4 ppm. Como tque la longitud de la cadena de diaminoalcano aumenta muchas de las resonancias de metileno convertirse equivalente, y, como tal, un menor número de picos se observan en la región alifática que sería de esperar; aunque son significativamente más intensa y se pueden asignar libremente por sus integraciones (Tablas 1 y 2). Por ejemplo véanse las figuras 1 y 2 para la estructura química y 1 H espectros de RMN de la N, N '- (octano-1 ,8-diil) bis (isonicotinamida), biao, ligando. Debido a la simetría en la molécula que normalmente se esperaría que cinco resonancias alifáticas para biao; pero los cuatro picos más metileno interiores son magnéticamente equivalentes y se muestran como una gran resonancia a ~ 1,2 ppm.
La resonancia de protones amina de la cadena de diaminoalcano desacoplado se encuentra en la región alifática y es la resonancia más importante a medida que avanza significativamente campo abajo, en la región aromática, tras el acoplamiento To el ácido carboxílico. La resonancia de protones de amida subsiguiente se ve alrededor de 8,7 ppm para todos estos ligandos, como una relativamente amplia resonancia triplete (Figura 2).
Coordinación del grupo del platino a los ligandos bispiridina se observa a través de cambios selectivos de resonancias aromáticos del ligando (0,15 ppm campo abajo de desplazamiento de las resonancias Ha y 0,07 ppm campo arriba de desplazamiento de las resonancias de Hb) y la observancia de acoplamiento de platino en la resonancia doblete para el Ha protones (Figura 3). Coordinación de los grupos de platino para el ligando bispiridina también puede observarse fácilmente usando RMN Pt 195. El desplazamiento químico de una resonancia de platino está directamente relacionada con los tipos de átomos coordinados 21. Ligandos Chlorido desplazan 195 resonancias Pt campo abajo (hacia 0 ppm) y soy (m) ino ligandos cambian las resonancias campo arriba (hacia -2500 ppm). Los complejos de platino dinucleares sintetizados aquí muestran un solo r esonance alrededor de -2.300 ppm debido a la 3 x am (m) ino y 1 x Estado coordinación chlorido (Figura 4) 22. Impureza transplatin sin reaccionar mostraría como una resonancia alrededor de -2100 ppm mientras que si dos ligandos reaccionaron con una sola molécula transplatin (4 x AM (m) ambiente ino) a continuación, esta impureza sería fuera del campo de -2400 ppm 22.
Esquema 1 Las estructuras químicas de los fármacos de platino picoplatin y BBR3464 y el esquema sintético general para la síntesis de los ligandos bispiridina y sus respectivos complejos de platino dinuclear.; R = H o CH3; . n = 1-6 Iones contrarios para los complejos de platino se han omitido; utilizando el método descrito aquí son sales de dicloruro.
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Figura 1 La estructura química de la N, N '-.. (Octano-1 ,8-diilo) bis (isonicotinamida) ligando, Biao, y el esquema de numeración de protones utiliza para la asignación de las resonancias en la 1 H RMN Nótese la equivalencia de los cuatro protones de metileno (HE) en el centro de la molécula.
Figura 2 El 1 H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) de N, N '-. (Octano-1 ,8-diilo) bis (isonicotinamida), biao Anote la ubicación de la resonancia amida triplete en torno al 8,7. ppm, hasta 1-2 ppm para la resonancia amina diaminooctano antes del acoplamiento.
Figura 3. El 1 H RMN (D2O, 400 MHz) del espectro de trans-[{Pt (NH3) 2 Cl 2} μ-biao] 2 +. Tenga en cuenta el acoplamiento de platino en el aromático de resonancia Ha a 8,82 ppm.
Figura 4. El 195 Pt RMN (D2O, 400 MHz) del espectro de trans-[{Pt (NH3) 2 Cl}. 2 μ-biao] 2 + Nota la sola resonancia amplia alrededor de -2300 ppm, que es coherente con un entorno PtN 3 Cl; N = am (m) ine.
Tabla 1 Los 1 H RMN datos de caracterización de los ligandos bispiridina en DMSO-d6 a 400 MHz d = doblete..; t = triplete; q = cuarteto; m = multiplete.
Tabla 2. Los 1 H RMN datos de caracterización de los complejos de platino dinucleares en D 2 </ Strong> O a 400 MHz d = doblete.; t = triplete; q = cuarteto; m = multiplete.
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Discussion
En este trabajo complejos de platino dinucleares han sido sintetizados como agentes anticancerosos potenciales. Al hacerlo ligandos bispiridina puente se sintetizaron a través de una reacción de acoplamiento de amida usando ácido isonicotínico y diaminoalcanos de longitud variable. Anteriormente se ha informado de la síntesis de bispiridina ligandos y sus análogos de metilo con 2 a 8 grupos metileno y sus respectivos complejos de platino. En este trabajo, el método de síntesis y purificación ha sido revisada por lo que es más rápido y más barato y lo han demostrado mediante la síntesis de ligandos bispiridina con 8, 10 y 12 grupos metileno (el menor de los ocho grupos de metileno, Biao, se realizó para comparar la nueva método de purificación con el método más antiguo). Dinucleares complejos de platino también se hicieron usando estos ligandos.
La síntesis de los ligandos bispiridina se completó en disolvente anhidro y bajo una atmósfera de nitrógeno inerte, utilizando trietilamina como una base débil yanhídrido propilfosfónico como el agente de acoplamiento. De cualquier DMF o DMSO pueden utilizarse como el disolvente, aunque el ácido isonicotínico se disuelve mejor en el DMSO que lo hace en la DMF. Para cualquiera de disolvente, calentamiento suave bajo una corriente de funcionamiento de agua caliente se puede utilizar para ayudar a la disolución.
Este antiguo método requiere largos tiempos de reacción (varios días) y un proceso de purificación de múltiples etapas que incluye la extracción líquido / líquido contra éter dietílico y neutralización con NaHCO 3, que ahora se elimina. Las reacciones de síntesis de ligandos ahora se completan en cuestión de horas a temperatura ambiente, después se añaden todos los reactivos en un solo paso. Los ligandos bispiridina precipitar de la solución con la adición de agua (para ligandos con 8 o menos grupos metileno) y precipitar de la solución después de la formación de los 10 y 12 ligandos grupo metileno. Todos los ligandos puede ser recristalizado en agua hirviendo y en algunos casos su recrystall lentazación puede producir cristales adecuados para la difracción de rayos X.
Los complejos de platino dinucleares se preparan haciendo reaccionar dos moles de transplatin a un mol de los ligandos bispiridina. El efecto trans-labializing de los ligandos chlorido asegura que el producto principal es la coordinación de los fármacos de platino a través de un solo sitio en los ligandos bispiridina (el átomo de nitrógeno del anillo). Los complejos de platino dinucleares tienen buena solubilidad como sales dicatión tanto en agua, DMF y DMSO.
La purificación se logra mediante precipitación fraccionada con acetona. La impureza no identificada precipita antes de que el producto y se elimina por filtración a través de papel de filtro de poro estrecha. Es importante tener en cuenta que la precipitación con acetona funciona mejor con el aumento de cantidad de producto a ser purificado. En cantidades inferiores a 200 mg, el método no funciona tan bien y precipitaciones acetona repetidas puede ser requerida. Para cantidades alrededor de 200 mg omás nos hemos dado cuenta que los pasos individuales de precipitación acetona generalmente sólo requieren.
Si bien este documento se detalla la síntesis de ligandos específicos y complejos de platino, las técnicas utilizadas aquí se pueden aplicar para sintetizar una gama mucho más amplia de ligandos y complejos de platino multinucleares. Por ejemplo, con grupos protectores adecuados otros ligandos diaminoalcano, tales como espermina y espermidina, se pueden usar para hacer ligandos bispiridina. Ligandos bispiridina no simétrica también podrían hacerse usando ácido isonicotínico en un extremo y 2-metil-isonicotínico en el otro extremo. Estos ligandos no simétricas podrían ser generados mediante el uso de Fmoc /-protección con BOC en un extremo de las cadenas de diaminoalcano. La amina sin protección de la cadena se puede hacer reaccionar con un derivado de isonicotínico utilizando las reacciones de acoplamiento de amida descritos. El grupo protector se escinde a continuación de la cadena de diaminoalcano y un derivado diferente de ácido isonicotínico se adjunta usando unaotra reacción de acoplamiento de amida. Complejos de platino trinuclear podrían potencialmente también pueden hacer uso de cualquiera de estos ligandos a través de una adaptación de un método que utiliza ligandos basados pirazolilo hacer trinuclear,-como BBR3464, complejos 22.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 151882 | 99.9% D |
| DMSO-d6 | Aldrich | 156914 | 99.96% D |
| 1,8-diaminooctane | Aldrich | D22401 | 98% |
| 1,10-diaminodecane | Aldrich | D14204 | 98% |
| 1,12-diaminododecane | Aldrich | D1,640-1 | 98% |
| Isonicotinic acid | Aldrich | I17508 | 99% |
| 1-Propylphosphonic anhydride solution | Aldrich | 431303 | 50 wt% in ethyl acetate |
| Trans-diaminodichloridoplatinum(II) | Aldrich | P1525 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | Z76855 | >99.9%, anhydrous |
| N,N’-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | 99.8%, anhydrous |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | >99% |
| Nylon filter membranes | Whatman | 7402-004 | Pore size, 0.2 µm |
| Magnetic stirring hotplate | |||
| Magnetic stirring bar | |||
| Round bottom or three neck flask | |||
| Rubber septums of sufficient size for chosen round bottom or three neck flask | |||
| 5 ml hypodermic syringes | |||
| Hypodermic needles | |||
| Rubber party ballons | |||
| Rubber bands | |||
| A source of N2 gas | |||
| Rotary evaporator | |||
| Drying oven | |||
| NMR tubes | |||
| NMR spectrometer | |||
| 500 ml beakers | |||
| Glass or plastic pipettes |
References
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