Methodenartikel

Ein kleines Volumen Verfahren für Viral Konzentration von Wasser

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DOI:

10.3791/51744

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3. Februar 2015

 , 
1U.S. EPA

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wurde ein Ansatz entwickelt, um optimale Viruskonzentrationsbedingungen für Wasserproben mit kleinem Volumen unter Verwendung von Spikes des humanen Adenovirus zu identifizieren. Die hier beschriebenen Techniken werden verwendet, um Konzentrationsparameter für andere virale Ziele zu identifizieren, und werden auf groß angelegte Experimente zur Viruskonzentration angewendet.

Zusammenfassung

Die kleinskalige Konzentration von Viren (Probenvolumen 1-10 L, hier simuliert mit 100 ml Wasserproben) ist eine effiziente, kostengünstige Methode, um optimale Parameter für die Viruskonzentration zu identifizieren. Viren können durch Filtration (elektropositiv, elektronegativ, Glaswolle oder Größenausschluss) aus Wasser konzentriert werden, gefolgt von einer Sekundärkonzentration mit Rindfleischextrakt, um Viren von den Filteroberflächen freizusetzen, und schließlich einer Tertiärkonzentration, die zu einem Viruskonzentrat mit einem Volumen von 5-30 ml führt. Um optimale Konzentrationsverfahren zu identifizieren, wurden zwei verschiedene elektropositive Filter (ein Glas/Zellulose-Filter [1MDS] und ein Nano-Aluminiumoxid/Glas-Filter [NanoCeram]) sowie verschiedene Sekundärkonzentrationstechniken evaluiert; Bei der Celit-Technik, bei der drei verschiedene Celit-Partikelgrößen (fein, mittel und groß) bewertet wurden, wurde diese Technik mit der etablierten organischen Flockungsmethode verglichen. Verschiedene Elutionsadditive wurden auch auf ihre Fähigkeit untersucht, die Freisetzung von Adenovirus-Partikeln (AdV) von Filteroberflächen zu verbessern. Feinpartikel-Celit gewann ähnliche Konzentrationen von AdV40 und 41 wie bei der etablierten organischen Flockungsmethode, wenn während der Sekundärkonzentration virale Spikes hinzugefügt wurden. Der Glas-/Zellulosefilter gewann im Vergleich zu einem Nano-Aluminiumoxid-/Glasfaserfilter höhere Konzentrationen von AdV40 und 41 zurück. Obwohl statistisch nicht signifikant, wurden durch die Zugabe von 0,1 % Natriumpolyphosphat modifiziertem Eluans Rindfleischextrakt 10 % mehr AdV-Partikel im Vergleich zu unmodifiziertem Rindfleischextrakt zurückgewonnen.

Einleitung

Menschendarmviren sind wichtige Erreger von Wasser übertragenen Krankheiten 1-3, aber sind in der Regel in geringer Anzahl in kontaminierten Umwelt Gewässern, so dass ihr Nachweis schwierig, ohne Konzentration. Verfahren verwendet werden, um Viren zu konzentrieren umfassen typischerweise ein Filtrationsschritt, gefolgt von Filter Elution und Sekundär Konzentration des Filter Eluat. Eine gemeinsame Filtrationsverfahren stützt sich auf den Einsatz von geladenen Membranen wie elektro Filter (vor kurzem in 4,5 überprüft). Diese Filter verlassen sich auf die Erfassung von Viren in Wasser suspendiert, elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der Filteroberfläche (positiv geladen) und gezielte Viruspartikel (negativ geladen). Zwei elektro Filter, die kommerziell verfügbar sind, beruhen auf dieser Technologie, die Glas / Cellulose und Nano-Aluminiumoxid / Glasfaser-Filtern. Die Glas / Cellulose-Filterkosten um bis zu 10-fache des Nano-Aluminiumoxid / Glasfaser, das die Verwendung des Glases / ce begrenzenllulose Filter für die routinemäßige Virenüberwachung. Jüngste Studien haben festgestellt, Unterschiede nominal zwischen diesen beiden Filter in der Wiederaufnahme von Enteroviren von Umgebungswasser 6,7 sind, rechtfertigt den Einsatz eines preiswerter Filter Alternative. Weitere Filteroptionen wie elektro und Glaswolle-Filter untersucht worden, aber sie erfordern entweder die Vorbehandlung der Quelle Wasser (elektro Filter) oder nicht im Handel erhältlich (Glaswolle-Filter). Die Entwicklung der Viruskonzentration Verfahren hat sich vor allem auf die Optimierung der primären Konzentrationstechniken (Filter), um Virenrückforderungen aus dem Wasser zu verbessern konzentriert. Allerdings Sekundär Konzentration Verfahren, die das Volumen des Elutionsmittels typischerweise 1 L senken, Volumes Milliliter, kann auch einen erheblichen Einfluss auf die Virus Erholungen 8.

Sekundäre Konzentration von Darmviren beruht in der Regel auf einem Flockungsmittel, wie einige Arten von Rinderextrakt (organische floccunung) oder Magermilch Flockung 9-12 zu Viruspartikeln aus Filterflächen zu entfernen. Kürzlich wurde eine weitere sekundäre Konzentrationsverfahren unter Verwendung von Rinderextrakt zusammen mit der Zugabe von Celite (feine Teilchen) Versprechen zur Rückgewinnung Adenovirus, Enteroviren und Norovirus 8,13,14 gezeigt. Celite Konzentration Arbeiten unter ähnlichen Prinzipien wie die des organischen Ausflockungsverfahren dass Viruspartikel befestigen und von Teilchen (Flocken oder Celite) durch Änderung des pH der Suspension die Lösung freigesetzt. Vergleiche zwischen diesen beiden Sekundär Konzentration Techniken bei der Beitreibung von Stachel Adenovirus (AdV) Typen 40 und 41 8 bewertet worden. Diese Studie ergab, dass die beiden Sekundärkonzentrationstechniken waren in der Wiederaufnahme von Adenoviren statistisch ähnlich. Jedoch erfordert das organische Ausflockungsverfahren 30 min. Inkubation bei pH 3,5, während das Celite Technik erfordert eine kürzere Inkubation (10 min) bei pH 4,0. Die organische flocculatIonen erfordert auch den Einsatz von teuren Laboreinrichtungen (Zentrifugen) Flockenpartikel während tertiäre Konzentration sammeln, das Celite Technik im Gegensatz nur die wichtigsten Laborausrüstung (Vakuumfiltration), um Celite Teilchen aus der Suspension zu trennen.

Bestimmte Kombinationen von Filtern und Sekundär Elutionstechniken kann auch Auswirkungen auf Virus-Rückforderungen. Eine Studie ergab, dass bestimmte Kombinationen von primären (elektro Filter) und sekundäre Konzentrationstechniken (Celite oder organischen Flokkulation) einen signifikanten Einfluss der Erholung von Adenovirus-13 hatte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Optimierung ist, um optimal zu erholen Zielvirus aus einer gegebenen Wassermatrix bei der Verwendung dieser Techniken erforderlich. Optimierung ist ein zeitaufwendiger, aktiv zu vermeiden mühsamer Prozess viele Forscher seit vielen Variablen werden ausgewertet (Filtertyp / Marke pH Elutionslösung, Celite / organischen Flokkulation).

Dafür study, ein Verfahren entwickelt, um optimale Bedingungen für die Viruskonzentration von Wasser zu identifizieren mit Stachel humane Adenovirus-Stämme 40 und 41 Vermutlich da jeder Virustyp zeigt eine einzigartige Kapsid Morphologie und spezifische Kapsid Ladung, müssen Konzentrationsprotokolle für jeden Virus optimiert werden zielen, um eine optimale Virusrückgewinnung zu erreichen. Diese Studie liefert einen Ansatz für die AdV 40 und 41 Konzentration: 1) Auswertung Virus Erholungen in Leitungswasser mittels elektroFilterScheiben, gefolgt von 2) Auswertung eines etablierten organischen Flockungsmethoden gegenüber dem Celite-Technik als Sekundär Konzentration, und 3) Bewertung der Elutionspuffer für tertiäre Konzentration.

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Protokoll

1. Herstellung der Glasgeschirr und Filtergehäuse

  1. Wenn nicht anders angegeben, sterilisieren alle Gläser, Filtergehäuse und Lösungen bei 121 ° C für 15 min. Um die Sterilität zu gewährleisten, decken alle Öffnungen oder freiliegenden Flächen entweder mit Aluminiumfolie oder Klebeband gesicherten Papier vor der Sterilisation.
  2. Montieren Sie Filtervorrichtung durch Anbringen von Filter-Gehäuse (47 mm Durchmesser) auf 1 L Seitenarm Erlenmeyerkolben. Filter erforderlich sammeln: 47 mm Durchmesser elektro / elektroScheibenFiltern.
  3. Herstellung von 1 l 1,5% Rinderextrakt (Ausflocken, produziert Flockenpartikel beim pH der Lösung wird auf 3,5 oder nichtflock abgesenkt, das aber nicht bei pH 3,5 hat Aggregat) durch Auflösen von 15 g Rinderextrakt in, mit 0,05 M Glycin, 1 l entionisiertem Wasser und Zugabe von 3,75 g Glycin.
    HINWEIS: Nicht-Flockungsmitteln Rindfleischextrakten wird die Zugabe von Celite vor tertiären Konzentration erfordern.
  4. Fügen Elution Additiv Natrium polyphosphate um Rindfleischextrakt in einer Konzentration von 0,1%.
  5. 1 M Salzsäurelösung tropfenweise von dem Mischungsrindfleischextrakt, pH-Lösung um den gewünschten pH. Autoklav Rindfleischextrakt für 15-30 min bei 121 ° C.
  6. Messen Sie 0,1 g feine, mittlere oder große Partikel Celite (zur Verwendung mit nicht-Flockungsmittel Rindfleischextrakt nur).
  7. Bereiten Vakuum / Sog durch das Anbringen kompatibler Schlauch an Erlen Seitenarm Kolben und an die Vakuumsteckdose.

2. Herstellung von Lösungen und Virenvektor

  1. Herstellung von 1 l 1 M HCl.
  2. Herstellung von 1 l 1 M NaOH.
  3. Bereiten 1x PBS-Lösung (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,47 mM K 2 PO 4 und 4,3 mM NaH 2 PO 4).
    1. Der pH-Wert von 1 × PBS auf 9,0 unter Verwendung von 1 M NaOH.
  4. Vorbereiten und verdünnen Lager Virus bis 10 4 -10 5 wahrscheinlichste Zahl (MPN) ml-1 durch Mischen von 1 ml Stammvirus mit 9 ml PBS (pH7), wie zuvor beschrieben, 8,13. Bei -80 ° C in 1 ml-Teilmengen.
    1. Sterilisieren Virusstamm mit Hilfe einer Spritze Filterung (0,22 um Porengröße), um mögliche Verunreinigungen zu entfernen.
  5. Entchlortem Leitungswasser
    1. Maßnahme 1 l sterilem Leitungswasser mit einer sterilen Messzylinder abgemessen und in einen 2 l-Becherglas mit Magnetrührer.
    2. Hinzufügen von 0,7 g Natriumthiosulfat und mischen, bis Granulate aufzulösen. Der pH-Wert des Leitungswassers auf 7-7,5 bei Bedarf mit 1 M HCl oder 1 M NaOH-Lösung.
    3. Thaw Virus Spike (1 ml) und fügen gesamte Volumen der Spitze zu 1 l dechloriert sterilem Leitungswasser. Mischen Sie für 10 Minuten.
    4. Bereiten Sie eine leere Methode (dechloriert Leitungswasser ohne Adenovirus) mit jedem Experiment und Verfahren in der gleichen Weise wie der angereicherten Probe.

3. Herstellung von Millipore Filtergerät

  1. Entfernen steriler Verband Filtergehäuse. Dafür Sorgengute Passform zwischen den Filtergehäuseoberschale und unteren Filter Bildschirm Probe Leckage während der Filtration zu vermeiden.
  2. Entfernen sterilen Abdeckung von 1 l Erlenmeyerkolben. Sicherzustellen, dass der Korken von der Filtereinheit paßt genau in die obere Öffnung des Erlenmeyerkolben, der eine gute Abdichtung.
  3. Entfernen Sie die obere Schale mit Filtereinheit von der unteren Filterscheibe, und legen Sie 47 mm elektroFilterScheibe direkt über Bildschirm mit einer sterilen Pinzette. Befestigen Sie Filtergehäuse Schüssel zum unteren Bildschirm und einrasten durch Verdrehen gegen den Uhrzeigersinn.

4. Tippen Sie auf Wasserfiltration (Primary Konzentration)

  1. Messen Sie 100 ml Virus versetzt Leitungswasser mit sterilen Messzylinder.
  2. Gießen Sie 100 ml Virus versetzt Leitungswasser in das Filtergehäuse, die entweder ein 47 mm Falten Glas / Cellulose-Filter oder eine Nano-Aluminiumoxid / Glasfaser-Scheibenfilter.
  3. Damit das Wasser langsam durch Filter. Bewerben leichtem Vakuum, um die verbleibenden Reste zu entfernen of Leitungswasser aus Filterfläche.
  4. Bei der Verwendung von Trypsin-Behandlung, 5 ml 0,25% Trypsin, um Oberflächen filtern und Inkubation für 5 min.
  5. Von Filterfläche mit 50 ml sterilem deionisiertem Wasser waschen Trypsin.

5. Virus Elution von Filter

  1. Entfernen Sie Filtergehäuse aus zwei L-Erlenmeyerkolben, und setzen Sie auf 250 ml Seitenarm Kolben.
  2. Messen Sie 100 ml Fleischextrakt unter Verwendung von Messzylinder. Gießen Sie langsam 100 ml Fleischextrakt in das Filtergehäuse.
  3. Lassen Rindfleischextrakt durch Filter gießen, der Erfassung Rindfleischextrakt in einem kleinen (250 ml) Erlenmeyerkolben. Gib Vakuum durch Restfleischextrakt aus dem Filter zu ziehen.

6. Celite Sekundär Konzentration

  1. Transfer-Kolben, die die eluierten Viren auf einer Rührplatte. In sterilen Magnetrührer und auf Rührplatte, Mischen zu leichten Wirbel zu erzeugen.
  2. Mit 0,1 g CelitePulver zu 100 ml Fleischextrakt und lassen Celite zu zerstreuen. Zeigen sterile pH-Sonde in Fleischextrakt.
  3. Fügen tropfenweise 1 M HCl auf Rindfleischextrakt auf pH 4,0 zu erreichen. Lassen Sie langsam mischen für 10 min.
  4. Platz 47 mm-Vorfilter auf Filtergehäuse (wie zuvor beschrieben) mit einem 2 l-Erlenmeyerkolben.
  5. Gießen Sie 100 ml Fleischextrakt / Celite-Mischung über Vorfilter. Lassen Rindfleischextrakt durch gießen. Mit leichtem Unterdruck, durch Restfleischextrakt aus dem Filter zu ziehen.
  6. Zeigen Metallrohr Clip auf Ende des Filtergehäuses Auslauf. Bringen sterile 15 ml-Polypropylen-Sammelrohr, um Metallrohr Clip. Zeigen Filtergehäuse zurück in Erlenmeyerkolben.
  7. 5 ml 1x PBS-Puffer, pH 9,0 über Celite am Vorfilter gesammelt.
  8. Lassen PBS durch Vorfilter tropfen. Mit leichtem Unterdruck, durch Rest PBS in 15 ml Sammelröhrchen zu ziehen.

7. Organische Flockung Sekundär Konzentration

  1. Übertragen Sie die Becher, die das eluierte Virus auf einer Rührplatte. In sterilen Magnetrührer zu 100 ml Fleischextrakt und mischen, um leichten Wirbel zu erzeugen.
  2. Zeigen sterile pH-Sonde in Fleischextrakt.
  3. 1 M HCl tropfenweise zu Rindfleischextrakt und pH-Wert auf 3,5. Mischen für 30 min.
  4. Gießen des Eluats in 250 ml Zentrifugen konische Röhrchen und Zentrifugieren bei 2.500 xg für 15 min bei 4 ºC.
  5. Überstand abgießen dabei nicht, das Sediment nicht zu stören. Das Pellet in 5 ml 1x PBS, pH 9.
  6. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 4.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand abgießen und verwerfen das Pellet.
  7. PH-Wert auf 7-7,5 filtersterilisieren durch 0,22 & mgr; m-Spritzenfilter übertragen und bei -80 ° C.

8. viralen Nukleinsäureextraktion

  1. Extrahieren viralen Nukleinsäuren unter Verwendung eines geeigneten handelsüblichen Kits nach den Anweisungen des Herstellers.

9. AdV 40/41 qPCR

  1. Verwenden Primer und Sonden sowie den Reaktionsmischung und Temperaturwechselprofile veröffentlicht als 8,13.
    Hinweis: Das Nachweisgrenze für den Test ist ca. 5 qPCR Einheiten pro Reaktion.
  2. Hinzufügen von Komponenten einer PCR-Amplifikation Mischungen in Konzentrationen wie folgt: 10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 4,5 mM MgCl 2, 10 mM dNTPs, 10 & mgr; M Primer und 1 & mgr; M Sonde und 0,5 & mgr; l Polymerase sodass Endvolumen von 45 ul können auf geeignete Anzahl von Wells einer 96-Well-PCR-Reaktionsplatte gegeben werden.
  3. Last 45 ul der PCR-Amplifikation Mischung zu jedem entsprechenden Vertiefung einer 96-well, schnelle Reaktion PCR-Platte.
  4. In 5 ul DNA extrahiert Probe Vertiefungen der PCR-Platte.
  5. Abdeckplatte mit hitzebeständigem Deckeldichtung, drehen Sie die Platte um alle Tröpfchen nach unten von PCR-Plattenvertiefungen zu bewegen.
  6. Stellen Sie die PCR-Amplifikation Zyklen wie folgt einteilenOWS: 95 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 sec und 60 ° C für 1 min.

10. Datenanalysen

  1. Analysieren Dreifachmessungen der serielle 5-fache Verdünnungen der Proben Spanning 1: 5 bis 1: 625 Verdünnung Bereich um die wahrscheinlichste Zahl (MPN) der Viruspartikel zu bestimmen, wie zuvor beschrieben, 8,13.
  2. Analysieren serielle 5-fache Verdünnungen von Adenovirus experimentellen Spitzen Spanning 1: 5 bis 1: 15.625 Verdünnung Bereich um die wahrscheinlichste Zahl (MPN) der Viruspartikel zu bestimmen.
  3. Mit dem EPA MPN Rechner (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), stellen Sie den Rechner, um für Art der Verdünnung zu berücksichtigen (1: 5 oder 1:10), die Anzahl der Verdünnungen durchgeführt, und die Zahl der Parallelproben in Verdünnungsreihen.
  4. Führen log 10-Transformation der Daten, gefolgt von der Normalisierung auf eine Volumeneinheit (beispielsweise 1 ml, 100 ml, usw. ). Berechnen Wiedereinziehungen für gegebenen Experiment durch Division Anzahl der in Probe vorhandenen Viruspartikel konzentriert zur Zahl der in der experimentellen Spannungsspitzen vorhanden Viruspartikel.
  5. Bewerten der Wirkung der verschiedenen experimentellen Parametern (zB unterschiedliche Celite Typen pH-Bereichen, unterschiedliche Filtertypen und verschiedene sekundäre Konzentrationstechniken) auf AdV Einziehungen durch Ausführen parametrischer oder nicht-parametrischen statistischen Tests (zB gepaarter t-Test, ein oder zwei -Wege ANOVA) in Abhängigkeit von der Verteilung der Daten und die Konzeption des Experiments.

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Ergebnisse

Celite Auswahl

Drei verschiedene Arten von Celite wurden vor der Auswahl des besten Variante getestet. Celite mit feinen bis mittelgroße Partikel produziert die höchsten Adenovirus Erholungen. Einsatz größerer Celite führte zu niedrigeren Wiederfindungsraten für sowohl AdV40 und 41 (Bereich 32% -100%) (Abbildung 1). Durchschnittliche Rückforderungen von Adenovirus-40 waren 144% ± 52% (fein), 115% ± 28% (mittel) und 82% ± 53% (große) Partikel Celite und AdV41, 132% ± 39...

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Diskussion

Elektro Filter sind nützlich bei der Konzentration von Viren aus Wasser; aber diese Filter können in ihrer Struktur und Zusammensetzung, die wiederum ihre Wirksamkeit verändern könnten abweichen. Compoundierung dieses Problem, Kapsidstrukturen und Gebühren schwanken zwischen Virusstämme erfordern Konzentrationstechniken zugeschnitten auf optimale Erholung 15 zu gewährleisten. Durch einfache Änderungen an den vorhandenen Konzentrierungstechniken (zB elektro Filter, Rindfleischextrakt Elution), können ...

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Offenlegungen

Keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die in diesem Artikel geäußerten Ansichten sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien der US-Umweltschutzbehörde wider. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten stellt keine Billigung oder Empfehlung zur Verwendung dar.

Danksagungen

Wir möchten Dr. Nicholas J. Ashbolt und Dr. G. Shay Fout für ihre Durchsicht des Manuskripts danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Adenovirus 40 LagerATCCVR-931
Adenovirus 41 LagerATCCVR-930
NatriumthiosulfatFluka Chemical Co.72051
Celite #577Fluka Chemical Co.22142
NanoCeram 47 mmArgonidN/A
1MDS 47 mm3M6408502
AP-20 Vorfilter 47 mmMillipore Corp.
Glycin Sigma50046-1KG
NatriumpolyphosphatAcros Organics390930010
TrypsinGibco25200
PBSSigmaP5368
SalzsäureFisherA481-212
BBL RindfleischextraktBD Biosciences212303
Difco RindfleischextraktBD Biosciences211520
ABI 7900 Echtzeit-PCR-SystemABIN/A
Edelstahl-FiltergehäuseMillipore Corp.
Blut-DNA-ExtraktionskitQiagen 51104
EPA MPN Taschenrechnerhttp://www.epa.gov/nerlcwww/online.html
AP2004700XX2004720

Referenzen

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