Nanogold Markierung der Hefe Endosomale System für Ultrastrukturanalysen

Zusammenfassung

Hefe, Saccharomyces cerevisiae, war ein wichtiger Modellorganismus zu identifizieren und zu untersuchen Gene Regelung der Biogenese und Funktion des endosomalen Systems. Hier präsentieren wir eine detaillierte Protokoll für die spezifische Markierung von den Endosomen für ultrastrukturelle Studien.

Zusammenfassung

Endosomen sind einer der Hauptmembransortier Checkpoints in eukaryotischen Zellen, und sie Verwertung oder Vernichtung von Proteinen regulieren hauptsächlich von der Plasmamembran und Golgi. Als Ergebnis der endosomalen System spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Zelle, und Mutationen in Genen zu diesem Netzwerk von Organellen durch Vesikeltransport miteinander verbunden gehören, verursachen schwere Erkrankungen wie Krebs und neurobiologischen Erkrankungen. Es ist daher von größter Bedeutung, um die Mechanismen der Biogenese und der Organisation des endosomalen System zugrunde liegen. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist in dieser Aufgabe entscheidend. Um spezifisch zu markieren und zu analysieren, auf ultrastruktureller Ebene die endosomalen System dieser Modellorganismus, hier präsentieren wir eine detaillierte Protokoll für die positiv geladenen Nanogold-Aufnahme durch Spheroplasten gefolgt von der Visualisierung dieser Teilchen durch eine Silberverstärkung Reaktion. Dieses Verfahren ist auch ein wertvoller zul für die morphologische Untersuchung von Mutanten mit Defekten in endosomalen Handel. Darüber hinaus ist es nicht nur anwendbar für ultrastrukturelle Untersuchung kann aber auch mit Immun Markierungen zur Proteinlokalisierung Untersuchungen kombiniert werden.

Einleitung

Die endosomalen System ist ein Hauptmembransortiervorrichtung, die mehrere entscheidende Rollen einschließlich Mobilhandel lysosomalen Enzyms Sortier Rezeptoren und das Recycling von Plasmamembran (PM)-Rezeptoren spielt ^1,2. Endosomen in drei Kammern, nämlich unterteilt. die frühen Endosomen (EE), die späten Endosomen (LE) und die Recycling-Endosomen. Diese Einstufung basiert auf der Zeit, die für die Endozytose Material, um sie zu erreichen, auf die bestimmte Markerproteine ​​und über deren Morphologie. Membranen, dh Protein-und Lipiddoppelschichten, von der PM verinnerlicht kann entweder über Endosomen zu den Lysosomen zum Abbau geliefe....

Protokoll

1. Spheroplastenpräparation

1. Inkubieren der Hefe über Nacht bei 30 ° C in 10 ml des entsprechenden Mediums durch die Gestaltung des Experiments bestimmt.
2. Am Tag danach Messen der optischen Dichte der Kultur bei 600 nm (OD ₆₀₀₎ unter Verwendung eines Photometers, verdünnt Zellen im gleichen Kulturmedium bis zu einer OD ₆₀₀ von 0,2-0,4 wachsen sie zu einem exponentiellen Wachstumsphase, wenn die Konstruktion der Experiment erfordert einen anderen Zustand. Zellen in der exponentiellen Phase, wenn die Kultur eine OD ₆₀₀ von 1-2.
3. Sammeln 10 OD ₆₀₀ Äquivalente Zellen durch Zentrifugation bei 3.500 × ....

Ergebnisse

Gemäß der vorgestellten Protokoll kann die Morphologie der Hefe Endosom System zugänglich sein durch Übertragungs EM. Fig. 1 zeigt verschiedene Arten von Endosomen, die erreicht haben und deshalb mit Nanogold markierten. Das Silber-Nanogold verbessert deutlich als Elektronen-dichten Teilchen gesehen werden. Die für die Silberverstärkung Reaktion etabliert optimalen Einstellungen können mit Goldpartikeln in einer homogenen Größenbereich zwischen 5 und 15 nm, die nicht mit der Ultrastruktur der Hefezelle .......

Diskussion

Immuno-Elektronenmikroskopie ist eine Technik, kombiniert Lokalisierung von Proteinen mit der ultra Auflösung der Träger und Organellen, in denen diese Proteine ​​befinden können. Dies ist besonders wichtig, wenn die Untersuchung der Hefe endosomalen System, weil seine Fächer erscheinen als punktförmigen Strukturen in der Fluoreszenzmikroskopie. Es ist daher schwierig, sie zu unterscheiden. Aus diesem Grund ist der Einsatz einer Sonde nachweisbar EM und Eingabe der endocytischen Weg in einer zeitabhängigen Weise ist ent.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
PIPES (Piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensäure)	Merck, Darmstadt, Deutschland	1.102.200.250
HEPES	Merck, Darmstadt, Deutschland	391.340
EGTA	Sigma, St. louis, MO	E4378
MgCl2· 6H2O	Merck, Darmstadt, Deutschland	1.058.330.250
DL-Dithiothreitol	Sigma, St. louis, MO	D0632
Sorbit	Sigma, St. louis, MO	S1876
Positiv geladene Nanogold-Nanosonden	, Yaphank, NY	2022	lagern bei -20 ° C
HQ-silver&trade Erweiterungskit	Nanoprobes, Yaphank, NY	2012	Lagern bei -20 ° C
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma, St. Louis, MO	441244
Glutaraldehyd 8% EM-Qualität	Polyscience, Inc., Warrington, PA	216	bei -20 & deg lagern; C
Lytic	enzyme MP Biomedicals, Santa Ana, CA	153526	lagern bei -20 ° C
Parafilm M	Sigma, St. Louis, MO	P7793
50 Maschen Nickelgitter	Agar Scientific, Stansted, Vereinigtes Königreich	G209N
Kryo-Immun-Diamantmesser 35°	Diatome AG, Biel, Schweiz	N.A.
UCT-Ultramikrotom	Leica, Solms, Deutschland	N.A.
Formvar 15/95 Harz	Elektronenmikroskopie, Hatfield, PA	15800
50 Maschen Nickelgitter	Agar Scientific, Stansted, Vereinigtes Königreich	AGG2050N
Parafilm	Sigma, St. louis, MO	P7793
Gitter Aufbewahrungsbox	Leica, Solms, Deutschland	162-50
Falcon 100 mm x 15 mm Petrischale	Corning, Corning, NY	351029
Pasteur Kapillarpipetten 150 mm	Van Bruggen Glas, Rotterdam, Niederlande	10216234
1,5 ml Mikrozentrifuge	Sarstedt, Nü mbrecht, Deutschland	72690001
50 ml Tube	Bio-one, Alphen aan den Rijn, Niederlande	210296
Benchkote Oberflächenschutz	Whatman, Maidstone, Vereinigtes Königreich

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