Ein Leitfaden zur In vivo Single-Unit-Aufnahme von Optogenetically Identifizierte kortikalen inhibitorischen Inter

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir unsere Strategie, um stabile, gut isolierte Einzelaufnahmen von identifizierten inhibitorischen Interneuronen in der anästhesierten Mausrinde zu erhalten. Neuronen, die ChR2 exprimieren, werden durch ihre Reaktion auf blaues Licht identifiziert. Die Methode verwendet standardmäßige extrazelluläre Aufzeichnungsgeräte und dient als kostengünstige Alternative zur Kalziumbildgebung oder visuell gesteuerten Pflasterung.

Zusammenfassung

Eine große Herausforderung in der Neurophysiologie war es, die Reaktionseigenschaften und Funktion der zahlreichen hemmenden Zelltypen in der Großhirnrinde zu charakterisieren. Wir teilen hier unsere Strategie für den Erhalt von stabilen, gut isolierten Single-Unit-Aufnahmen von identifizierten hemmenden Inter im narkotisierten Maus Kortex mit Hilfe eines von Lima und Kollegen ¹ entwickelten Methode. Die Aufnahmen werden in Mäusen, Channelrhodopsin-2 (ChR2) in bestimmten neuronalen Subpopulationen durchgeführt. Mitglieder der Population werden durch ihre Reaktion auf einen kurzen Blitz aus blauem Licht identifiziert. Diese Technik - genannt "PINP" oder Photostimulation gestützte Identifizierung von neuronalen Populationen - Verwendbar mit Standard extrazellulären Kontrollgerät durchgeführt werden. Es kann als kostengünstige und leicht zugängliche Alternative zu Calcium Imaging oder visuell geführte Patch dienen, zum Zwecke der Ausrichtung der extrazellulären Aufnahmen genetisch identifizierten Zellen. Hehe wir bieten eine Reihe von Leitlinien für die Optimierung der Verfahren in der täglichen Praxis. Wir verfeinert unsere Strategie speziell für Targeting Parvalbumin-positive (PV +) Zellen, haben aber festgestellt, dass es für andere Intern Typen sowie wie Somatostatin-exprimierenden (SOM +) und Calretinin-exprimierenden (CR +) Inter.

Einleitung

Die Charakterisierung der unzähligen Zelltypen, aus denen das Gehirn von Säugetieren besteht, war ein zentrales, aber lange schwer fassbares Ziel der Neurophysiologie. So sind beispielsweise die Eigenschaften und Funktionen verschiedener inhibitorischer Zelltypen in der Großhirnrinde Themen von großem Interesse, die aber noch relativ unbekannt sind. Dies liegt zum Teil daran, dass herkömmliche blinde In-vivo-Aufzeichnungstechniken in ihrer Fähigkeit, zwischen verschiedenen Zelltypen zu unterscheiden, begrenzt sind. Die extrazelluläre Spike-Breite kann verwendet werden, um putative Parvalbumin-positive inhibitorische Neuronen von exzitatorischen Pyramidenzellen zu trennen, aber diese Methode unterliegt sowohl Typ-I- als auch Typ-II-Fehlern^2,3. Alternativ können aufgezeichnete Neuronen gefüllt, wiederhergestellt und gefärbt werden, um später ihre morphologische und molekulare Identität zu bestätigen, aber dies ist ein mühsamer und zeitaufwändiger Prozess. In jüngster Zeit sind genetisch identifizierte Populationen von inhibitorischen Interneuronen mittels Calcium-Imaging oder visuell geführten Patch-Aufzeichnungen zugänglich geworden. Bei diesen Ansätzen ermöglicht die virale oder transgene Expression eines Kalziumreporters (wie GCaMP) oder eines fluoreszierenden Proteins (wie GFP) die Identifizierung und Charakterisierung von Zelltypen, die durch Promotorexpression definiert sind. Diese Ansätze verwenden die 2-Photonen-Mikroskopie, die teure Geräte erfordert, und sind aufgrund der Lichtstreueigenschaften des Hirngewebes auch auf oberflächliche kortikale Schichten beschränkt.

Kürzlich haben Lima und Kollegen¹ eine neuartige Anwendung der Optogenetik entwickelt, um elektrophysiologische Aufzeichnungen auf genetisch identifizierte Neuronaltypen in vivo auszurichten, genannt "PINP" – oder Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations. Die Aufzeichnungen werden an Mäusen durchgeführt, die Channelrhodopsin-2 (ChR2) in spezifischen neuronalen Subpopulationen exprimieren. Mitglieder der Bevölkerung werden durch ihre Reaktion auf einen kurzen blauen Lichtblitz identifiziert. Im Gegensatz zu vielen anderen optogenetischen Anwendungen geht es nicht darum, die Schaltkreisfunktion zu manipulieren, sondern lediglich darum, Neuronen zu identifizieren, die zu einer genetisch definierten Klasse gehören, die dann während der normalen Gehirnfunktion charakterisiert werden können. Die Technik kann mit standardmäßigen extrazellulären Aufzeichnungsgeräten implementiert werden und kann daher als zugängliche und kostengünstige Alternative zur Kalziumbildgebung oder zum visuell geführten Patching dienen. Hier beschreiben wir einen Ansatz zum PINPing spezifischer Zelltypen im anästhesierten auditorischen Kortex, mit der Erwartung, dass die allgemeineren Punkte in anderen Präparaten und Hirnregionen sinnvoll angewendet werden können.

Im Kortex ist PINP besonders vielversprechend für die Untersuchung der in vivo Reaktionseigenschaften von inhibitorischen Interneuronen. GABAerge Interneurone umfassen eine kleine, heterogene Untergruppe kortikaler Neuronen⁴. Verschiedene Subtypen, die durch die Expression bestimmter molekularer Marker gekennzeichnet sind, haben kürzlich gezeigt, dass sie in den kortikalen Schaltkreisen^5-9 unterschiedliche Rechenrollen spielen. Mit der Verbesserung der genetischen Werkzeuge könnte es schließlich möglich sein, morphologisch und physiologisch trennbare Typen zu unterscheiden, die in diese breiten Klassen fallen. Wir stellen hier unsere Strategie vor, um stabile, gut isolierte Einzelaufnahmen von identifizierten inhibitorischen Interneuronen im anästhesierten Mauskortex zu erhalten. Diese Strategie wurde speziell für das Targeting von Parvalbumin-positiven (PV+) Zellen entwickelt, aber wir haben festgestellt, dass sie auch für andere Interneuronentypen funktioniert, wie z. B. Somatostatin-exprimierende (SOM+) und Calretinin-exprimierende (CR+) Interneuronen. Obwohl PINPing konzeptionell einfach ist, kann es in der Praxis überraschend unnachgiebig sein. Wir haben durch Versuch und Irrtum eine Reihe von Tipps und Tricks gelernt, die für andere, die die Methode ausprobieren, nützlich sein können.

Protokoll

HINWEIS: Das folgende Protokoll entspricht den Richtlinien der National Institutes of Health, die vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss der Universität von Oregon genehmigt wurden.

1. Akutchirurgie

1. Betäuben Sie das Tier mit einem Ketamin-Medetomidin-Cocktail durch intraperitoneale (i.p.) Injektion (Tabelle 1).
   HINWEIS: Die in diesen Experimenten verwendeten Mäuse wurden durch Kreuzung einer cre-abhängigen ChR2-eYFP-transgenen Linie10 mit Interneuronen-Treiberlinien (Pvalb-iCre11, PV+; Sst-iCre12, SOM+; Cr-iCre12, CR+). Die virale Verabreichung von ChR2 oder verwandten Opsinen sollte gleich gut funktionieren, vorausgesetzt, es werden ähnliche Expressionsniveaus erreicht.
2. Stellen Sie vor Beginn der Operation sicher, dass das Tier keine Reaktion auf ein leichtes Einklemmen der Zehen zeigt. Verabreichen Sie während des gesamten Experiments bei Bedarf erneut Anästhetika, um diese Narkosetiefe aufrechtzuerhalten. Wenn Sie injizierbare Anästhetika verwenden, implantieren Sie optional einen i.p. Katheter für Erhaltungsinjektionen.
3. Halten Sie das Tier während des gesamten Versuchs mit Kochsalzlösung oder Laktat-Ringer-Lösung hydratisiert (ca. 3 ml/kg/h), z. B. durch Verwendung eines entsprechend verdünnten Anästhesiecocktails für Erhaltungsinjektionen (Tabelle 1).
4. Das Tier ist in ein stereotaktisches Gerät oder ein anderes Kopfhaltegerät zu setzen. Stellen Sie sicher, dass der Schädel gut gesichert ist. Dies ist für die Aufrechterhaltung stabiler Einzelzellaufzeichnungen unerlässlich.
5. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern. Halten Sie die Körpertemperatur bei 36,5-37 °C.
6. Führen Sie eine Zisternendrainage für zusätzliche Aufnahmestabilität durch. Entfernen Sie mit einer Skalpellklinge Gewebe von der hinteren Seite des Schädels, um die Cisterna magna freizulegen. Machen Sie einen kleinen Kerb in die Dura, um das Liquor cerebrospinalis abzulassen. Verwenden Sie nur die Spitze der Klinge und vermeiden Sie den Kontakt mit dem Kleinhirn oder dem Hirnstamm.
7. Führen Sie mit dem Skalpell eine kleine Kraniotomie (~2 mm²) über dem kortikalen Interessenbereich durch (für den auditorischen Kortex, etwa -2,3 mm hinter dem Bregma, 4,5 mm lateral der Mittellinie).
8. Entfernen Sie die Dura und bedecken Sie die freiliegende Rinde mit einer 0,5 - 1 mm dicken Schicht warmer Agarose (1,5 % Agarose in Kochsalzlösung, 0,9 % NaCl; bei ~37 °C auftragen). Halten Sie die Agarose während des gesamten Experiments feucht, indem Sie regelmäßig mehrere Tropfen Kochsalzlösung auftragen.

2. Aufnahme-Setup

1. Bereiten Sie eine Wolframelektrode vor (7-14 MΩ, 127 μm Durchmesser, 12° konische Spitze, epoxidbeschichtet). Kleben Sie die Elektrode mit Sekundenkleber auf ein Glaskapillarrohr und fügen Sie einen Schrumpfschlauch hinzu, um sie zu greifen (Abbildung 1).
2. Montieren Sie die Elektrode an einem motorisierten (oder hydraulischen) Mikromanipulator, der so eingestellt ist, dass er orthogonal zur kortikalen Oberfläche verläuft. Schieben Sie einen Draht unter die Haut gegen den Schädel. Vermeiden Sie den Kontakt mit den Muskeln an der Seite des Kopfes und im Nacken, da diese elektromyographische Artefakte erzeugen können.
3. Verstärken Sie das elektrische Signal mit einem extrazellularen Verstärker, der für die Aufnahme mit einem Gerät geeignet ist und vorzugsweise mit einem Impedanzprüfmodus ausgestattet ist. Überwachen Sie die laufende Spike-Aktivität (Bandpass 300 - 5.000 Hz) mit zwei Oszilloskopen und einem Satz aktiver Lautsprecher. Dabei werden die aufgenommenen Daten kontinuierlich mit einer Abtastrate von 10 kHz digitalisiert; Spikes werden offline extrahiert.
4. Schieben Sie die Elektrode durch die Agarose, bis die Spitze die Oberfläche der Hirnrinde erreicht. Beobachten Sie diesen Schritt durch ein Mikroskop. "Null" diese Position auf dem Mikromanipulator.
5. Um die Aufnahmetiefe am besten zu bestimmen, vergewissern Sie sich visuell, dass die Elektrodenspitze die kortikale Oberfläche in einer Tiefe von Null verlässt, wenn Sie die Elektrode am Ende einer Penetration zurückziehen.
   HINWEIS: Eine Diskrepanz zwischen dem Messwert des Manipulators und der beobachteten Elektrodenposition deutet darauf hin, dass er relativ zum Gewebe driftet ist. Dies kann durch eine Instabilität des Gehirns oder des Tieres oder durch die Drift des Manipulators verursacht werden.
   1. Um sicherzustellen, dass dieser Null-Sollwert der Oberfläche des Kortex entspricht, überwachen Sie als zusätzliche Überprüfung die stimulusevozierten Feldpotentiale, während Sie durch die ersten paar hundert Mikrometer des Gewebes vordringen. Bei der Überwachung von Feldpotentialen ist die untere Bandpassfilter-Cutoff des extrazellulären Verstärkers auf 10 Hz zu senken. Vergewissern Sie sich, dass sich die Polarität des lokalen Feldpotentials in einer Tiefe von ~100 μm in der Nähe der Schicht I/II-Grenze¹³ umkehrt. Dies ist ein zuverlässiger Referenzpunkt für den auditorischen Kortex, kann aber für andere kortikale Bereiche unterschiedlich sein.
6. Montieren Sie eine optische Faser, die mit einer blauen Lichtquelle gekoppelt ist (Abbildung 2), an einem manuellen Mikromanipulator. Positionieren Sie die Spitze der Faser mit dem Mikroskop so nah wie möglich an der Oberfläche der Agarose. Zentrieren Sie den Strahl dort, wo die Elektrode in das Gewebe eintritt.
7. Regulieren Sie die Ausgabe der Lichtquelle mit einem Steuergerät, das in der Lage ist, eine TTL-Impulsfolge (Transistor-Transistor-Logik) mit einer bestimmten Breite und Dauer zu liefern – z. B. ein Arduino (Abbildung 3), eine Computer-I/O-Karte (wie abgebildet) oder ein handelsüblicher Impulsgenerator.
   1. Überwachen Sie das Signal auf beiden Oszilloskopen.
8. Messen Sie die Gesamtlichtleistung (mW) an der Spitze der optischen Faser mit einem Leistungsmesser. Verwenden Sie diesen Wert, um die Bestrahlungsstärke (mW/^{mm 2}) zu berechnen, indem Sie durch die Querschnittsfläche des Faserkerns dividieren. Beginnen Sie mit einem Intensitätswert im Bereich von 10 - 15 mW/mm² und passen Sie ihn bei Bedarf nach unten an, bis Artefakte beseitigt sind.
9. Überprüfen Sie, ob die Elektrode in der Agarose leichte Artefakte hat, die bereit sind, in das Gewebe einzudringen. Starten Sie die Suchimpulsfolge (z.B. 30 ms Lichtimpulse, 500 ms Interstimulus Interstimulus Interval (ISI)).
   1. Beseitigen Sie transiente Lichtartefakte (Abbildung 4), indem Sie die optische Faser relativ zur Elektrode neu positionieren, um den Winkel des einfallenden Lichts zu ändern. Wenn Artefakte bestehen bleiben, versuchen Sie, die Lichtleistung zu verringern. In dem seltenen Fall, dass Artefakte nicht vollständig eliminiert (nur minimiert) werden können, verlängern Sie die Dauer des Suchimpulses. Dies kann bei der Identifizierung echter neuronaler Spikes helfen.

3. Direkter PINP-Eingang'

1. Schieben Sie die Elektrode langsam mit einer Geschwindigkeit von ca. 1 μm/s durch das Gehirn. Verwenden Sie ein Oszilloskop, um die laufende Aktivität zu überwachen. Auf der anderen Seite lösen Sie die Laserpulse aus.
2. Achten Sie auf den schwachen "Hash" von lichtevozierten Spitzen auf dem Audiomonitor, der anzeigt, dass sich die Elektrode einer ChR2+-Zelle nähert und oft gut wahrgenommen werden kann, bevor das elektrische Signal auf dem Oszilloskop sichtbar wird. Verlangsamen Sie die Geschwindigkeit des Fortschritts.
   HINWEIS: Wenn die Zelle direkt im Weg der Elektrode liegt, wird die lichtevozierte Aktivität größer (und lauter). Wenn sich die Elektrode einem einzelnen Interneuron nähert, löst sich der Hash in kleine, aber gut definierte Spikes von einheitlicher Größe und Form auf.
3. Sobald die lichtevozierten Spikes groß genug sind, um sie einzeln am Oszilloskop auszulösen, beginnen Sie damit. Passen Sie die Skalierung auf der horizontalen Achse an, um die genaue Form der Spike-Wellenform zu beobachten.
4. Halten Sie an und warten Sie, bis sich das Gewebe abgesetzt hat. Widerstehen Sie der Versuchung, die Elektrode näher an die Zelle zu bringen. Dieser Schritt ist entscheidend für eine stabile Aufnahme. Wenn sich das Signal-Rausch-Verhältnis nach einigen Minuten nicht verbessert hat, d.h. das Gewebe hat sich abgesetzt, aber die Zelle ist nicht näher an die Spitze der Elektrode herangerückt, gehen Sie 5 μm weiter und warten Sie erneut.
   1. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis entweder die Spitze oder das Tal des Aktionspotentials zuverlässig erfasst werden kann, wobei eine Spannungsschwelle weit über dem Grundrauschen liegt (z. B. +/-300 μV oder mehr).
      HINWEIS: Das Risiko von falsch-positiven Ergebnissen oder Mehrdeutigkeiten beim PINPing inhibitorischer Interneuronen ist gering. Die meisten Zellen können problemlos einer Reihe von Impulsen mit einer Dauer von 30 ms und einem Interpulsintervall von 500 ms oder schneller folgen, mit einer zuverlässigen ersten Spike-Latenz von 2-5 ms (Abbildung 5). Insbesondere die Mehrheit der PV+-Zellen kann das Feuer volle 1 Sekunde lang aufrechterhalten (Abbildung 6). Da es sich um inhibitorische Neuronen handelt, ist eine disynaptische (indirekte) Aktivierung kein großes Problem.
5. Überwachen Sie während der Aufzeichnung die laufende Aktivität des ersten Oszilloskops. Behalten Sie die Größe und Form der Spikes mit dem zweiten Oszilloskop genau im Auge. Achten Sie auf die Qualität des Klangs auf dem Lautsprecher.
   1. Hören Sie aufmerksam auf abrupte Veränderungen, die darauf hindeuten, dass die Zelle entweder zu nahe an die Elektrode heranrückt (wo sie Gefahr läuft, aufgespießt oder beschädigt zu werden) oder wegdriftet. Wenn die Stacheln groß und verzerrt werden, ziehen Sie sich zurück; Wenn sie kleiner werden, schieben Sie die Elektrode vor. Bewegen Sie sich langsam in 2 μm Schritten.
   2. Bestätigen Sie die Qualität der Aufnahme im Nachhinein, indem Sie alle Spike-Wellenformen überlagern, die auf Peak oder Tal ausgerichtet sind. Variieren Sie die Spannungsschwelle. Über einen weiten Bereich von Schwellenwerten hinweg sollte es immer nur eine konsistente Spike-Form mit einheitlicher Höhe geben (Abbildung 5a).
6. Wenn das Signal an irgendeinem Punkt mit Spikes von einem benachbarten Neuron verunreinigt wird, fahren Sie fort. Bewegen Sie sich langsam vor, für den Fall, dass die Elektrode außerhalb der Reichweite der Nachbarzelle verläuft, aber in Reichweite des Zielneurons bleibt. (Dies ist in der Regel erfolglos.)
7. Bewegen Sie die Elektrode bei jeder Penetration durch die gesamte Tiefe des Kortex (900+ μm). Wenn nach vielen Penetrationen keine lichtempfindlichen Neuronen auftreten oder umgekehrt die Aufzeichnungen routinemäßig mit Spikes von benachbarten ChR2-Zellen kontaminiert sind, versuchen Sie es mit einer neuen Elektrode.
   HINWEIS: Selbst innerhalb einer einzigen Charge können die Impedanz und die Spitzengeometrie einzelner Elektroden erheblich variieren. Beide Faktoren tragen zum effektiven "Abhörradius" der Elektrode bei, der groß genug sein muss, um lichtevozierte Spikes während der Suche zu erkennen, aber dennoch begrenzt genug, um ein einzelnes Interneuron isoliert aufnehmen zu können.
8. Prüfen Sie die Impedanz der Elektroden wie gewünscht. Um das Gewebe nicht zu beschädigen, tun Sie dies mit der Spitze der Elektrode im oberen Teil der Agaroseschicht, weit außerhalb des Gehirns. Im Bereich von 7-14 MΩ ist die genaue Impedanz kein sicherer Prädiktor für die Leistung oder Ausbeute für diese Anwendung. Nichtsdestotrotz ist es ein vernünftiger Proxy für den Hörradius: Elektroden mit niedrigerer Impedanz nehmen mehr Einheiten auf; höhere Impedanz, weniger.
9. Am Ende des Versuchs wird das Tier mit institutionell anerkannten Mitteln eingeschläfert, wie z. B. einer Überdosis Anästhetika oder einer Gebärmutterhalsluxation unter einer tiefen Anästhesieebene.

Ergebnisse

Wir stellen hier unsere Strategie zur Ableitung von Einzelzell-Aufzeichnungen aus genetisch klassifizierten hemmenden Interneuronen im anästhesierten Mauscortex mithilfe einer optogenetischen Methode vor, die von Lima et al.¹ entwickelt wurde. Tabelle 1 enthält Details zum empfohlenen Anästhetikumgemisch aus Ketamin, Medetomidin und Acepromazin („KMA“). Abbildung 1 zeigt eine für die Ableitung vorbereitete Wolframelektrode. Abbildung 2 enthält ein Sch...

Diskussion

Obwohl PINP konzeptionell einfach ist, kann es in der Praxis eine Herausforderung darstellen. Ein wesentlicher Faktor für den Erfolg ist die Wahl der Elektrode. Der elektrische Abhörradius ist der entscheidende Parameter. Er muss groß genug sein, um lichtevozierte Spikes zu erkennen, wenn die Spitze noch in einiger Entfernung von einer ChR2+-Zelle ist, damit man die Vorschubrate entsprechend anpassen kann. Gleichzeitig muss sie so begrenzt sein, dass eine gute Isolierung von einzelnen Einheiten möglich ist. Das heißt, di...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ChR2-EYFP-Linie	Jackson-Kolonien	12569
Pvalb-iCre (PV)-Linie	Jackson-Kolonien	8069
Sst-iCre (SOM)-Linie	Jackson-Kolonien	13044
Cr-iCre (CR)-	Linie Jackson-Kolonien	10774
Agarose	Sigma-Aldrich	A9793	Typ III-A, hoher EEO-Mikropunkt
(dural Haken)	FST	10066-15
Chirurgische Schere	FST	14084-09
Skalpell	FST	10003-12 (Griff), 10011-00 (Klingen)
Puralube Ophthalmic Salbe	Foster & Smith	9N-76855
Homöotherme Decke	Harvard Apparatus	507220F
Wolfram-Mikroelektroden	A-M Systems	577200	12 MΩ AC-Widerstand, 127 μ m Durchmesser, 12°; konische Spitze, epoxidbeschichtet
Kapillarglasröhre	Warner Instruments	G150TF-3
Schrumpfschlauch	DigiKey	A332B-4-ND
Zapit Beschleuniger	DVA	SKU ZA/ZAA	Verwendung mit Standard-Sekundenkleber.
Mikroelektrode AC-Verstärker 1800	AM Systems	700000
MP-285 Motorisierter Mikromanipulator	Sutter	MP-285
4-Kanal Digitale Oszilloskope	Tektronix	TDS2000C
Aktivlautsprecher	Harman	Modell JBL  Duet
Manueller Manipulator	Scientifica	LBM-7
800 µ m Glasfaser Patchkabel	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Leistungsmesser	ThorLabs	PM100D (Leistungsmesser), S121C (Standard Leistungssensor)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	LED Leistung und Effizienz nehmen kontinuierlich zu, daher empfehlen wir, nach den neuesten Produkten zu suchen (www.cree.com).
Arduino UNO	DigiKey	1050-1024-ND