Dieser Artikel beschreibt die Mikroinjektion und Elektroporation von Maus Hoden in vivo als Transfektionstechnik für Hodenzellen der Maus, um einzigartige Prozesse der Spermatogenese zu untersuchen. Das vorgestellte Protokoll beinhaltet Schritte Glaskapillare Vorbereitung, die Mikroinjektion über den Ausführungsgang und Transfektion durch Elektroporation.
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Methodenartikel
In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieses Video und Artikel Beitrag gibt eine umfassende Beschreibung der Mikroinjektion und Elektroporation von Maus Hoden in vivo. Diese besondere Technik für die Transfektion Hodenzellen der Maus ermöglicht die Untersuchung von einzigartigen Prozesse in der Spermatogenese.
Das folgende Protokoll konzentriert sich auf die Transfektion von Zellen mit der Maus Hoden Plasmid-Konstrukte. Insbesondere verwendeten wir die Reportervektor pEGFP-C1, das verstärkt grün fluoreszierendes Protein (eGFP) und die pDsRed2-N1-Vektor exprimiert, rot fluoreszierendes Protein (DsRed2) exprimieren. Beide Reportergene codiert wurden unter der Kontrolle des humanen Cytomegalovirus Immediate-early-Promotor (CMV).
Für die Durchführung Gentransfer in Mäusehoden werden die Reporter-Plasmid-Konstrukte in Hoden von lebenden Mäusen injiziert. Zu diesem Zweck ist der Hoden eines betäubten Tieres ausgesetzt und die Seite der Mikroinjektion hergestellt wird. Unsere bevorzugten Ort derInjektion ist der Ausführungsgang, mit dem letztlich verbunden Rete testis als anatomische Transportweg der Spermien zwischen Hoden und Nebenhoden. Auf diese Weise wird die Befüllung der Samenleiter nach der Mikroinjektion sehr gut verwaltet und gesteuert durch die Verwendung von gefärbten DNA-Lösungen. Nach der Feststellung einer ausreichenden Füllung des Hodens von seinen gefärbten Tubulus Struktur wird das Organ elektroporiert. Dies ermöglicht die Übertragung der DNA-Lösung in den Hodenzellen. Nach 3-tägiger Inkubation wird die Hoden entfernt und unter dem Mikroskop für die grüne oder rote Fluoreszenz untersucht, veranschaulicht die Transfektion Erfolg.
Generell kann dieses Protokoll für die Bereitstellung von DNA-oder RNA-Konstrukte eingesetzt werden in lebenden Maus Hoden, um (über) ausdrückliche oder knock down Gene, die Erleichterung in vivo Analyse der Genfunktion. Darüber hinaus eignet sich für das Studium Reporterkonstrukte oder vermeintlichen Gen Regula ist esTory-Elemente. So sind die Hauptvorteile der Elektroporation Technik sind schnelle Performance in Kombination mit geringem Aufwand als auch die moderate technische Ausrüstung und Fähigkeiten im Vergleich zu alternativen Techniken.
Einleitung
Säugetier Spermatogenese wird als eine anspruchsvolle Prozess der Selbst-Erneuerung Stammzellen nacheinander Mitose, Meiose und Differenzierung, um zu reifen Spermien haploid entwickeln. Diese morphologischen Veränderungen sind durch unterschiedliche Zelltypen orchestriert und trotz tiefen Versuche ist es immer noch unmöglich, diese Verfahren in Zellkultur 1,2 imitieren. Daher Forschung auf die Spermatogenese bisher beruht auf lebende Organismen in vivo-Modellen. Im allgemeinen werden die Genfunktion Untersuchungen üblicherweise auf transgene Tiere basiert. Jedoch erzeugendes und aufrechterhalt diese Art von Tiermodell ist zeitaufwendig, kostenint....
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Protokoll
Alle Tierversuche durchgeführt wurden von der Ethikkommission (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Deutschland) genehmigt worden.
1. Plasmid-Präparation
- Zur Plasmidpräparation, verwenden Plasmid-Reinigungskits (siehe Materialien Tabelle) oder ähnliche Verfahren mit Endotoxin Entfernung Puffer, so dass Immunreaktionen des Tieres zu vermeiden. Folgen Sie den Anweisungen des Handbuchs. Beschäftigen ddH2O, um das Plasmid-Lösung zu verdünnen.
- Trümmer zu beseitigen durch Spinnen der DNA-Lösung mit maximaler Geschwindigkeit (20.000 × g). Dann sammeln Sie den ....
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Ergebnisse
Die Versuchsanordnung für die Durchführung der Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden in vivo, wie es verwendet wird, gemäß dem Protokoll ist in 1 dargestellt. Obwohl es möglich ist, industriell hergestellten Mikro erwerben, bevorzugt man, indem (1A unseren eigenen Pipetten erzeugen ) und Anfasen (Abbildung 1B) Glaskapillaren montiert, so dass sie unsere Bedürfnisse. Die Ausrüstung für die Mikroinjektion und Elektroporation in 1C dar.......
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Diskussion
Die Forschung im Bereich der Reproduktionsbiologie, insbesondere im Bereich der männlichen Fruchtbarkeit und Spermatogenese zwangsläufig beruht auf Lebewesen. Um Hodenfunktion zu untersuchen, hat keine ausreichende Zellkultur / in vitro-System wurde reflektieren kann alle entscheidenden morphologischen Veränderungen von einer diploiden Spermatogonie zu einem haploiden Spermium reifen 1,2 etabliert. Somit ist die Erzeugung von gentechnisch veränderten Tieren oft eine notwendige und al.......
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Offenlegungen
Marten Michaelis, Alexander Sobczak, und Joachim M. Weitzel beschäftigt am Institut für Reproduktionsbiologie, Leibniz-Institut für Nutztierbiologie (FBN), Dummerstorf, Deutschland, erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Wir danken Birgit Westernstroeer des Zentrums für Reproduktionsmedizin und Andrologie an der Universität Münster für die Lehre des Hodenmikroinjektion. Außerdem sind wir dankbar, Ursula und Petra Antkewitz Reckling für die technische Unterstützung. Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Unterstützung dieser Arbeit (WE2458 / 10-1).
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Materialien
10x PBS, pH 7,4
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Zentrifuge | Sigma | 1-15 PK | |
| Spektralphotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Mikropipettenabzieher | Narishige | PC-10 | vertikaler Kapillarabzieher |
| Mikroinjektionskapillaren | Clark | GC100-10 | Borosilikat-Standardwand |
| Mikropipetten-Anfaser | Bachofer | Typ 462 | rotierende Scheibe Anfas-Elektroporator |
| Nepagene | CUY 21EDIT | Rechteck-Elektroporator | |
| Pinzettenelektroden | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø Scheibenelektroden |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Kaltlichtquelle | Zeiss | KL 1500LCD | |
| Mikroinjektionspumpe | Eppendorf | Femtojet | |
| Mikromanipulator | hausgemacht | XYZ Kreuztisch | |
| Chirurgische Instrumente | FST | Schere, Pinzette, Nadelhalter | |
| Feine Pinzette | FST | Dumont #5, #7 | Vorbereitung der efferenten Kanäle |
| Michel-Clip zum Auftragen von Hefter | FST | Michel, 12029-12 | |
| Michel-Nahtclips | FST | Michel, 12040-01 | 7,5 x 1,75 mm |
| Chirurgisches Nahtmaterial | Catgut, Markneukirchen, Deutschland | Catgut 00 | |
| Spritze mit 30 G Nadel | B. Braun | Omnican 40 | zum Laden der Mikropipette und für die Anästhesie |
| Plasmid-Isolationskit | Promega | Cat. # A2495 | Plasmid Midiprep |
| Plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-Promotor + EGFP |
| Plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-Promotor + DsRed2 |
| Fast Green Farbstoff | Sigma | F7258-25G | zur Verdünnung in ddH2O |
| 10% Ketamin | Serum Werk, Bernburg, Deutschland | Urotamin | Mix im Verhältnis 1:1 mit Xylazin |
| 2% Xylazin | Serum Werk, Bernburg, Deutschland | Xylazin | Mix im Verhältnis 1:1 mit Ketamin |
| Sterilium | Bode Chemie | Sterillium-Desinfektion | |
| Tierarztsalbe | S& K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe Augensalbe | zur Vorbeugung von Augentrockenheit |
| To-Pro-3 iodid | Invitrogen | T3605< | |
| 1,37 M NaCl | Carl Roth | 3957,1 | |
| Ibuprofen, Dolormin | Johnson & Johnson Consumer Health Care Deutschland | 01094902 | analgetische pädiatrische Lösung (NSAID) zur postoperativen Schmerzlinderung |
| 27 mM KCl | Carl Roth | 6781.1 | |
| 100 mM Na2HPO4· 2H2O | Carl Roth | T106.2 | |
| 18 mM KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 |
Referenzen
- Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
- Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R. Models of in vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 32-43 (2012).
- Zizzi, A., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
