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Methodenartikel

In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden

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⸱

DOI:

10.3791/51802

⸱

23. August 2014

 ,  , 
1Institute of Reproductive Biology, Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Mikroinjektion und Elektroporation von Maus Hoden in vivo als Transfektionstechnik für Hodenzellen der Maus, um einzigartige Prozesse der Spermatogenese zu untersuchen. Das vorgestellte Protokoll beinhaltet Schritte Glaskapillare Vorbereitung, die Mikroinjektion über den Ausführungsgang und Transfektion durch Elektroporation.

Zusammenfassung

Dieses Video und Artikel Beitrag gibt eine umfassende Beschreibung der Mikroinjektion und Elektroporation von Maus Hoden in vivo. Diese besondere Technik für die Transfektion Hodenzellen der Maus ermöglicht die Untersuchung von einzigartigen Prozesse in der Spermatogenese.

Das folgende Protokoll konzentriert sich auf die Transfektion von Zellen mit der Maus Hoden Plasmid-Konstrukte. Insbesondere verwendeten wir die Reportervektor pEGFP-C1, das verstärkt grün fluoreszierendes Protein (eGFP) und die pDsRed2-N1-Vektor exprimiert, rot fluoreszierendes Protein (DsRed2) exprimieren. Beide Reportergene codiert wurden unter der Kontrolle des humanen Cytomegalovirus Immediate-early-Promotor (CMV).

Für die Durchführung Gentransfer in Mäusehoden werden die Reporter-Plasmid-Konstrukte in Hoden von lebenden Mäusen injiziert. Zu diesem Zweck ist der Hoden eines betäubten Tieres ausgesetzt und die Seite der Mikroinjektion hergestellt wird. Unsere bevorzugten Ort derInjektion ist der Ausführungsgang, mit dem letztlich verbunden Rete testis als anatomische Transportweg der Spermien zwischen Hoden und Nebenhoden. Auf diese Weise wird die Befüllung der Samenleiter nach der Mikroinjektion sehr gut verwaltet und gesteuert durch die Verwendung von gefärbten DNA-Lösungen. Nach der Feststellung einer ausreichenden Füllung des Hodens von seinen gefärbten Tubulus Struktur wird das Organ elektroporiert. Dies ermöglicht die Übertragung der DNA-Lösung in den Hodenzellen. Nach 3-tägiger Inkubation wird die Hoden entfernt und unter dem Mikroskop für die grüne oder rote Fluoreszenz untersucht, veranschaulicht die Transfektion Erfolg.

Generell kann dieses Protokoll für die Bereitstellung von DNA-oder RNA-Konstrukte eingesetzt werden in lebenden Maus Hoden, um (über) ausdrückliche oder knock down Gene, die Erleichterung in vivo Analyse der Genfunktion. Darüber hinaus eignet sich für das Studium Reporterkonstrukte oder vermeintlichen Gen Regula ist esTory-Elemente. So sind die Hauptvorteile der Elektroporation Technik sind schnelle Performance in Kombination mit geringem Aufwand als auch die moderate technische Ausrüstung und Fähigkeiten im Vergleich zu alternativen Techniken.

Einleitung

Säugetier Spermatogenese wird als eine anspruchsvolle Prozess der Selbst-Erneuerung Stammzellen nacheinander Mitose, Meiose und Differenzierung, um zu reifen Spermien haploid entwickeln. Diese morphologischen Veränderungen sind durch unterschiedliche Zelltypen orchestriert und trotz tiefen Versuche ist es immer noch unmöglich, diese Verfahren in Zellkultur 1,2 imitieren. Daher Forschung auf die Spermatogenese bisher beruht auf lebende Organismen in vivo-Modellen. Im allgemeinen werden die Genfunktion Untersuchungen üblicherweise auf transgene Tiere basiert. Jedoch erzeugendes und aufrechterhalt diese Art von Tiermodell ist zeitaufwendig, kostenintensiv und sehr aufwendig. Dies wird auf die erforderliche lange Züchtungsprozess zum Erzeugen und Aufrechterhalten des Transgens über die Generationen zurückzuführen. Zusätzlich ist die genetische Manipulation des gesamten Organismus oder die transgene Knockout-Ansatz anfällig für physiologische Beeinträchtigungen führen, wenn Targeting genen mit essentiellen Funktionen in mehreren Regionen, beispielsweise außerhalb der Hoden oder systemisch.

Ferner werden einige transiente Transfektion Verfahren mit einigen entscheidenden Nachteilen verbunden. Beispielsweise typische Nachteile von virusvermittelten Gentransfer sind die möglichen Provokation der Immunreaktionen und weitere Sicherheitsbestimmungen, während Lipofektion 3 und 4 Mikropartikelbeschuss kann das Gewebe beschädigt werden und auf einen bestimmten Zelltiefe ausreichend Transfektionseffizienz beschränkt.

Im Gegensatz dazu Elektroporation (EP) als eine weitere gemeinsame Weg von transienter Transfektion, scheint eine vielversprechende Technik zur Aktivierung in vivo Transfektion und konsequent in vivo Gen-Analyse darstellen. Im allgemeinen wird EP als dynamisches Phänomen, das auf der lokalen Membranspannung folglich vermittelte Poren in Nanosekunden abhängig bezeichnet. Diese Lücken können für Millisekunden gehalten werden, ausreichend to Zugriff gewähren, um DNA, RNA oder kleinen Molekülen 5. Wenn die angelegte Spannung zu hoch ist, wird das in der Regel vorübergehend Charakter des EP durch die Wärmeproduktion und die Induktion von zu umfassend Permeabilisierung mit der Folge einer irreversiblen Schädigung der Zelle 5 entgegengewirkt.

Hier zeigen wir, dass die Elektroporation ist eine effektive und kostengünstige Transfektion System, das in der Lage ist für die genetische Transformation Hoden, um Hoden Gen Eigenschaften in vivo aufzuklären genutzt wird. Dieser Artikel behandelt Plasmid-Präparation, die Mikroinjektion über den Ausführungsgang und die anschließende Elektroporation von Maus Hoden. Dieses Verfahren kann das Mittel der Wahl, um schnelle, spezifische und effiziente Transfektion von Samenleiter der Maus-Hoden in vivo, um die Prozesse der Spermatogenese zu untersuchen erreichen.

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Protokoll

Alle Tierversuche durchgeführt wurden von der Ethikkommission (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Deutschland) genehmigt worden.

1. Plasmid-Präparation

  1. Zur Plasmidpräparation, verwenden Plasmid-Reinigungskits (siehe Materialien Tabelle) oder ähnliche Verfahren mit Endotoxin Entfernung Puffer, so dass Immunreaktionen des Tieres zu vermeiden. Folgen Sie den Anweisungen des Handbuchs. Beschäftigen ddH2O, um das Plasmid-Lösung zu verdünnen.
  2. Trümmer zu beseitigen durch Spinnen der DNA-Lösung mit maximaler Geschwindigkeit (20.000 × g). Dann sammeln Sie den Überstand.
  3. Bestimmen Plasmid-Konzentration mit einem Spektralphotometer (siehe Materialien).
  4. Passen Plasmid-Konzentration mit ddH2O auf 1-3 pg (DNA) / ul. Hinweis: Niedrigere Konzentrationen werden Transfektionseffizienz zu reduzieren, während höhere Konzentrationen könnte ein zu viskos Injektionslösung führen. Neben derTransfektionseffizienz hängt von der Größe des Plasmids und muss individuell getestet werden.
  5. Vor der Injektion wird eine Lösung Mischung mit etwa 40 ul Plasmid wurden mit 5 ul PBS (10x) und 5 ul Fast Green (0,5%). Fast Green ist zum Verfolgen der Einspritzvorgang benötigt wird. Vorzugsweise verwenden dünnwandigen PCR-Röhrchen oder Parafilm. Hinweis: Je nach der Größe der Hoden, der ein Volumen von 20-50 ul für jede Hoden benötigt.

2. Herstellung der Mikroinjektion Pipette

  1. Verwenden Borosilikatglas Kapillaren (siehe Materialien Tabelle) für die Herstellung der Mikroinjektion Pipetten.
  2. Ziehen Glaskapillaren mit einer vertikalen Kapillare Abzieher (siehe Materialien Tabelle).
  3. Brechen die Kapillare Spitze mit einer Pinzette von sanft Streifenbildung. Die Spitze ist gewöhnlich 50-80 um im Durchmesser und etwa 1 cm lang. Versuchen Sie Tipps, die zu lang, da diese nicht steif genug, um das Gewebe zu durchdringen sind, zu vermeiden.
  4. Endlich sharpen die Spitze in einem 30 ° bis 45 ° unter Verwendung einer Mikropipette seinveler (siehe Materialien Tabelle).
  5. Laden Sie die Mikroinjektion Pipette mit der Injektionslösung-Mischung (siehe Plasmid-Präparation). Tragen Sie die Lösung in die Rückseite der Glas Kapillare mit einer kleinen Spritze. Hinweis: Versuchen Sie, um Luftblasen zu vermeiden, während Laden, da diese sonst in den Samenkanälchen zusammen mit der Plasmid-Lösung eingespritzt werden und damit die Leitfähigkeit zu verringern sowie eventuell Gewebeschäden verursachen.

3. Anästhesie und Chirurgie

  1. Führen Sie den Vorgang unter aseptischen Bedingungen durch Verwendung von sterilem Material (dh Spritze, Nadel, chirurgische Instrumente, etc.). Dies wird eine Infektion des Tieres zu reduzieren und sorgen für eine gute Überlebensraten.
  2. Verwenden Sie für die Elektroporation männlichen Mäusen im Alter von 6-8 Wochen.
  3. Um postoperative analgetische Behandlung zu initialisieren, bieten die Maus mit Analgetika hinzugefügt Trinkwasser am Tag vor der Operation. Dieser EselUres einen Präventiv Analgesie bei sehr wahrscheinlich postoperativen hypodipsia (verminderte Wasseraufnahme). Hierzu aussetzen Trinkwasser beispielsweise einer pädiatrischen Ibuprofensuspension (20 mg / ml). Die heil Trinkwasser sollte auch am Tag eins und zwei der Erholung in identischer Konzentration zugeführt werden. Das bedeutet, eine tägliche Dosis von 7,5 mg / kg, gültig für 5 ml / d Trinkwasser und Körpergewicht von 25 g für 8 Wochen im Alter von C57BL / 6J. Diese schmerzstillende Therapie gewährleistet eine grundlegende Schmerzlinderung und eine beschleunigte Genesung zusammen mit hohen Tierschutz 26.
  4. Zur Herstellung der Arbeitslösung Anästhesie am Tag der Operation, mischen Sie 10% Ketamin und Xylazin 2% in einem Verhältnis 1: 1 (siehe Materialien Tabelle).
  5. , Um das Tier zu betäuben, gelten 0,25 ml / 100 mg Körpergewicht von Anästhesielösung subkutan (= 0,125 g Ketamin / kg; Xylazin = 0,025 g / kg). Verwenden Sie eine Injektionsstelle zwischen Becken und Gliedmaßen, um Organschäden und Verletzungen der Mäuse zu verhindern. Regel 10 min benötigt werdenbis die Maus tief anästhesiert.
  6. Decken Sie die Augen mit der Maus Tierarzt Salbe zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
  7. Testen tiefe Narkose Festnahme, die von einem völligen Mangel an Reaktion bemerkbar macht. Zu diesem Zweck, nur eine Prise der Spitze des Tieres.
  8. Um die Operation zu starten, zu entfernen Bauchhaar mit einem elektrischen Rasierer oder ähnliche und desinfizieren den Arbeitsbereich mit Sterilium oder ähnliches.
  9. Machen Sie eine ventrale Inzision direkt über den Vorhautdrüsen in der Mitte der Bauchbereich. An dieser Stelle zunächst die Haut ziehen weg und führen einen kleinen Querschnitt der Haut von etwa 8-14 mm. Dann weiter auf der Bauchmuskelschicht.
    Anmerkung: Die Läsion sollte so klein wie möglich sein, um Schaden von dem Tier zu verringern.
  10. Ziehen Sie die Bauchfettpolster sorgfältig, um die Hoden befestigt aussetzen und auf eine vorherige bereit wasserdichte Einweg-Papiertuch gleich neben der Einschnittstelle (Abbildung 2a).
  11. Mit einem Fernglas zu find den Ausführungsgang als Einspritz Ziel. Der Ductus ableitenden als feine Gefäß Verbindung zwischen Hoden und Nebenhoden identifiziert. Es befindet sich neben dem prominenten Hodenarterie. Der Ductus verläuft fast unter einem Winkel von 45 ° zu der Arterie und in den Nebenhoden Caput sichtbar. Hinweis: Je nach der Maus die Alter, wird der Ductus meist im Fettgewebe begraben.
  12. Verwenden feinen Pinzette, um den Ausführungsgang des Fettgewebes zu löschen. Danach legen Sie die Freigabe Ductus auf einer sterilen Papierstreifen, um die klare Sicht auf den Kanal erfolgt Umgebung beeinträchtigen gewährleisten.

4. Mikroinjektion und DNA-Anwendung

  1. Verbinden des Mikroinjektionspipette, die mit dem Plasmid-Lösung zu den Mikromanipulator / Injektor-Einheit geladen wird.
  2. Legen Sie die Mikroinjektionsnadel parallel zum Ausführungsgang mit der Spitze in Richtung des Rete testis (2B).
  3. Verwenden feinen Pinzette undStreifen der Kanal über die Mikroinjektion Pipette. Stellen Sie sicher, dass die Kapillare parallel zu der Leitung gehalten, und ziehen Sie es um.
    Hinweis: Dieses Verfahren ist bequemer als die Durchdringung des Behälters durch Bewegen der Nadel mit dem Mikromanipulator.
  4. Richten Sie die Nadel vorsichtig in Richtung Hoden und stoppen so wie es das Rete testis dringt direkt unterhalb der Tunica albuginea (2C).
    Hinweis: Im Fall der Übervorteilung des Rete testis, wird die Plasmid-Lösung in den interstitiellen Raum austreten. Dies führt häufig zu einem Versagen der Transfektion der Hodenkanälchen.
  5. Für die Injektion der Plasmid-Lösung nutzen die Mikroinjektor mit folgenden Einstellungen: pi: 100 hPa, ti: 0,2 sec, und pc: 0 hPa (2D).
  6. Überwachen Sie die gesamte Einspritzvorgang durch die Beobachtung der Hoden Füllen Status mit Hilfe der grünen Farbe. Achten Sie darauf, dass die Hoden nur bis zu zwei Drittel ihres Volumens mit der pl gefülltasmid Lösung (Abbildung 2E).
    Hinweis: Wenn das Injektionsvolumen überschritten, wird der Hodengewebe geschädigt werden könnte.

5. Elektroporation von Hoden

  1. Um wirksam Elektroporation zu ermöglichen, genießen die Pinzette Elektroden in PBS (1x). Dies gewährleistet eine ausreichende Leitfähigkeit.
  2. Reibungslos drücken Sie die Hoden zwischen den nassen Elektroden (2F). Messen den elektrischen Widerstand mit der Elektroporator.
  3. Bewerben Strom an die Hoden. Führen acht Rechteckimpulse von 40 V an 4 verschiedenen Standorten Hoden mit einem konstanten Dauer von 50 ms Pulszeit und 950 ms Intervallzeit.

6. Wundverschluss und Post-Chirurgie

  1. Wenn Elektroporation beendet ist, legen Sie die Hoden wieder in die ursprüngliche Position.
  2. Nähen Sie die innere Muskelschicht mit chirurgischem Naht (siehe Materialien).
  3. Schließen Sie die Haut durch den Einsatz von Wundklammern (siehe Materialien Tabelle). Ziehen Sie die Haut bis with Pinzette. Achten Sie auf die Muskelschicht auszuschließen. Zeigen die Clips, die jeweils in einem Abstand von nicht mehr als 5 mm.
    Hinweis: Da chirurgisches Nahtmaterial kann mit der Maus verschluckt werden, sind Wundklammern zum Verschließen der Hautläsionen begünstigt.
  4. Lassen Sie die Maus, um aus der Narkose auf sterilen Papierhandtücher in einem sterilen leeren Käfig Maus, die auf einem 37 ° C warmen Unterlage aus gehärtetem platziert erholen. Das Kissen sollte die Erwärmung der einen Hälfte des Käfigs Schaffung eines Wärmegradienten zu gewährleisten. Für das Tier macht es möglich, für die einzelnen, am bequemsten Bereich aufgrund der Temperatur Vielzahl in den Käfig suchen. Darüber hinaus umfassen die Maus mit einem Blatt sterilen Papiertuch so dass Stress kann weiter reduziert werden. Hinweis: Da der Körperoberfläche des Maus in Bezug ungewöhnlich hoch, um Körpermasse ist, wenn sie mit größeren Tieren verglichen wird, ist der für die erfolgreiche Wiederherstellung von Nagetieren besonderer Bedeutung die thermische Unterstützung.
  5. Wenn das Tier betrieben voll erwacht ist, übertragen it für eine weitere Erholung auf eine komplett ausgestattete neue Maus Käfig. Legen Sie das Tier wieder zu seiner alten Käfig oder an eine Gruppe von Mäusen. Sicherzustellen, dass der Käfig so sauber und steril wie möglich zu Wundinfektionen zu verhindern. Überwachen den gesamten Recovery-Prozess. Um die Maus zurück in die Tierstation zu übertragen, warten Sie, bis es vollständig erholt und scheint normal zu verhalten.
    Hinweis: Weitere per- und post-operative Strategien werden von Pritchett-Corning KR et al 6 diskutiert.

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Ergebnisse

Die Versuchsanordnung für die Durchführung der Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden in vivo, wie es verwendet wird, gemäß dem Protokoll ist in 1 dargestellt. Obwohl es möglich ist, industriell hergestellten Mikro erwerben, bevorzugt man, indem (1A unseren eigenen Pipetten erzeugen ) und Anfasen (Abbildung 1B) Glaskapillaren montiert, so dass sie unsere Bedürfnisse. Die Ausrüstung für die Mikroinjektion und Elektroporation in 1C dar...

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Diskussion

Die Forschung im Bereich der Reproduktionsbiologie, insbesondere im Bereich der männlichen Fruchtbarkeit und Spermatogenese zwangsläufig beruht auf Lebewesen. Um Hodenfunktion zu untersuchen, hat keine ausreichende Zellkultur / in vitro-System wurde reflektieren kann alle entscheidenden morphologischen Veränderungen von einer diploiden Spermatogonie zu einem haploiden Spermium reifen 1,2 etabliert. Somit ist die Erzeugung von gentechnisch veränderten Tieren oft eine notwendige und al...

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Offenlegungen

Marten Michaelis, Alexander Sobczak, und Joachim M. Weitzel beschäftigt am Institut für Reproduktionsbiologie, Leibniz-Institut für Nutztierbiologie (FBN), Dummerstorf, Deutschland, erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Wir danken Birgit Westernstroeer des Zentrums für Reproduktionsmedizin und Andrologie an der Universität Münster für die Lehre des Hodenmikroinjektion. Außerdem sind wir dankbar, Ursula und Petra Antkewitz Reckling für die technische Unterstützung. Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Unterstützung dieser Arbeit (WE2458 / 10-1).  

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Materialien

10x PBS, pH 7,4
Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ZentrifugeSigma1-15 PK
SpektralphotometerNanodropND-1000
MikropipettenabzieherNarishigePC-10vertikaler Kapillarabzieher
MikroinjektionskapillarenClarkGC100-10Borosilikat-Standardwand
Mikropipetten-AnfaserBachoferTyp 462rotierende Scheibe Anfas-Elektroporator
NepageneCUY 21EDITRechteck-Elektroporator
PinzettenelektrodenNepageneCUY 650P55 mm Ø Scheibenelektroden
StereomikroskopZeissStemi 2000-C
KaltlichtquelleZeissKL 1500LCD
MikroinjektionspumpeEppendorfFemtojet
MikromanipulatorhausgemachtXYZ Kreuztisch
Chirurgische InstrumenteFSTSchere, Pinzette, Nadelhalter
Feine PinzetteFSTDumont #5, #7Vorbereitung der efferenten Kanäle
Michel-Clip zum Auftragen von HefterFSTMichel, 12029-12
Michel-NahtclipsFSTMichel, 12040-017,5 x 1,75 mm
Chirurgisches NahtmaterialCatgut, Markneukirchen, DeutschlandCatgut 00
Spritze mit 30 G NadelB. BraunOmnican 40zum Laden der Mikropipette und für die Anästhesie
Plasmid-IsolationskitPromegaCat. # A2495Plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1ClontechCat. #6084-1CMV-Promotor + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1ClontechCat. #6084-1CMV-Promotor + DsRed2
Fast Green FarbstoffSigmaF7258-25Gzur Verdünnung in ddH2O
10% KetaminSerum Werk, Bernburg, DeutschlandUrotaminMix im Verhältnis 1:1 mit Xylazin
2% XylazinSerum Werk, Bernburg, DeutschlandXylazinMix im Verhältnis 1:1 mit Ketamin
SteriliumBode ChemieSterillium-Desinfektion
TierarztsalbeS& K Pharma, GmbHKerato Biciron 5%, Augensalbe Augensalbezur Vorbeugung von Augentrockenheit
To-Pro-3 iodidInvitrogenT3605<
1,37 M NaClCarl Roth3957,1
Ibuprofen, DolorminJohnson & Johnson Consumer Health Care Deutschland01094902analgetische pädiatrische Lösung (NSAID) zur postoperativen Schmerzlinderung
27 mM KClCarl Roth6781.1
100 mM Na2HPO4· 2H2OCarl RothT106.2
18 mM KH2PO4Carl Roth3904.1
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Referenzen

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