Die Isolierung von Lymphknotenstromazellen ist ein mehrstufiges Verfahren, das enzymatische Verdauung und mechanische Disaggregation umfasst, um fibroblastische retikuläre Zellen, lymphatische und Blutendothelzellen zu erhalten. Bei dem beschriebenen Verfahren wird ein kurzer Verdau mit einer automatisierten mechanischen Disaggregation kombiniert, um den Oberflächenmarkerabbau lebensfähiger Lymphknotenstromazellen zu minimieren.
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Methodenartikel
Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Sekundäre lymphatische Organe einschließlich Lymphknoten bestehen aus Stromazellen, die eine strukturelle Umgebung für die Homöostase, Aktivierung und Differenzierung von Lymphozyten bieten. Verschiedene Untergruppen von Stromazellen wurden durch die Expression des Adhäsionsmoleküls CD31 und des Glykoproteins Podoplanin (gp38), retikuläre Zellen der T-Zone oder fibroblastische retikuläre Zellen, lymphatische Endothelzellen, Blutendothelzellen und FRC-ähnliche Perizyten innerhalb der doppelt negativen Zellpopulation identifiziert. Für alle Populationen werden unterschiedliche Funktionen beschrieben, darunter die Trennung und Auskleidung verschiedener Kompartimente, die Anziehung und Interaktion mit verschiedenen Zelltypen, die Filtration der drainierenden Fluidik und die Kontraktion der Lymphgefäße. In den letzten Jahren haben verschiedene Gruppen eine zusätzliche Rolle von Stromazellen bei der Orchestrierung und Regulierung zytotoxischer T-Zell-Antworten beschrieben, die für den Wirt potenziell gefährlich sind.
Lymphknoten sind komplexe Strukturen mit vielen verschiedenen Zelltypen und erfordern daher ein geeignetes Verfahren zur Isolierung der gewünschten Zellpopulationen. Derzeit beruhen Protokolle für die Isolierung von Lymphknotenstromazellen auf enzymatischer Verdauung mit unterschiedlichen Inkubationszeiten; Stromazellen und ihre Oberflächenmoleküle reagieren jedoch empfindlich auf diese Enzyme, was zu einem Verlust der Oberflächenmarkerexpression und zum Zelltod führt. Hier wird ein kurzes enzymatisches Verdauungsprotokoll in Kombination mit einer automatisierten mechanischen Unterbrechung vorgeschlagen, um lebensfähige Einzelzellsuspensionen von Lymphknotenstromazellen unter Beibehaltung ihrer Oberflächenmolekülexpression zu erhalten.
Einleitung
Lymphknoten sind spezialisierte Fächer, wo adaptiven Immunantwort gegen fremde und Selbst-Antigene initiiert und koordiniert. Das hier vorgestellte Verfahren beschreibt eine kurze enzymatische Verdauung kombiniert mit automatisierten mechanischen Pipettieren Lymphknoten Einzelzellsuspension zu erhalten und Zugang zu lebensfähigen Lymphknoten Stromazellen, die die Oberflächenexpression von mehreren Molekülen zu erhalten.
Lymphknoten Stromazellen bilden das Gerüst des Lymphknotens und erfüllen drei wichtige Funktionen: sie filtern ersten Körperflüssigkeiten, Antigene, Krankheitserreger und ihre Erregermuster (PAMPs) sowie Zytokine und Gefah....
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Protokoll
In diesem Video-Veröffentlichung und Protokoll wurden alle Tierverfahren in Übereinstimmung mit der von der kantonalen Behörde Basel-Stadt, Schweiz zugelassen Tier-Protokoll durchgeführt.
1. Lymphknoten Vorbereitung und Verdauung
- Pre-Wärme-Wasser in einem Becher auf 37 ° C auf einem Magnetrührer mit Heizplatte.
- Bereiten Basis Medium wie folgt: DMEM-Medium (ohne Pyruvat) mit 2% FCS, 1,2 mM CaCl 2 und Pen / Strep (100 Einheiten Penicillin, 100 ug Streptomycin).
- Sterilisieren alle Dissektionsinstrumente vor dem Gebrauch.
- Einschläfern Lymphknoten Spendermäusen pro CO 2 Ersticken u....
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Ergebnisse
Das vorliegende Protokoll ist ein von Link-et al., 2007 6 mit einer kürzeren Kochzeit (45 min maximal) durch mechanische Disaggregation mit einem automatisierten Mehrkanalpipette veröffentlicht modifizierten Verdauung Protokoll. Darüber hinaus ist das Verfahren eher standardisierte minimiert Abbau von Oberflächenmarkern auf verschiedenen Lymphknoten Stromazellen und ermöglicht die Behandlung von mehr als einer Probe gleichzeitig.
Kollagenase IV und Collagenase D Links-Pro.......
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Diskussion
Die Studie von Lymphknoten Stromazellen vor kurzem wurde ein Forschungsschwerpunkt auf die Entwicklung von zwei Protokolle veröffentlicht Verdauung 6,13. Beide Protokolle angemessen sind, um einzelne Lymphknoten Stromazellen zu erhalten, unterscheiden sich jedoch in der Verwendung von Verdauungsenzymen und dem Zeitpunkt der Verdauung. Da Stromazellen und ihre Oberflächenmarker empfindlich enzymatischen Verdau und mechanischer Belastung sind, wird ein optimiertes Protokoll erforderlich.
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Autoren danken Sanjiv Luther und Kollegen für hilfreiche Diskussionen bei der Erstellung des aktuellen Lymphknotenverdauungsprotokolls. Diese Arbeit wurde durch SNF-Zuschüsse PPOOA-_119204 und PPOOP3_144918 an S.W.R. unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Endkonzentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Endkonzentration 1,2 mM |
| Kollagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 Einheiten pro mg Trockengewicht, bei einer Endkonzentration von 1 mg/ml | |
| verwenden Kollagenase D | Roche | 11088882001 | Anwendung mit 3,5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | Einsatz bei 40 & Mikro; g/ml |
| Rührmagnete | FAUST | 5 mm lang-2 mm ø | |
| Polystyrol Rundbodenröhrchen 5 ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetrührer mit Heizfunktion | IKA-RCT-Standard | 9720250 | |
| Petrischalen 100 mm, steril | TPP | 6223201 | |
| 25 G Nadeln | Terumo | ||
| Anti Maus CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| Anti Maus CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| Anti Maus Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| Anti Maus CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel | Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µ l max. Volumen |
| Anti-Maus CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| Anti-Maus CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| Anti-Maus CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| Anti-Maus I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| Anti-Maus CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Nah-IR-Färbeset für tote Zellen | Invitrogen | L10119 |
Referenzen
- Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
