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Methodenartikel

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

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DOI:

10.3791/51803

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19. August 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, Immunoregulation, University of Basel and University Hospital Basel

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Isolierung von Lymphknotenstromazellen ist ein mehrstufiges Verfahren, das enzymatische Verdauung und mechanische Disaggregation umfasst, um fibroblastische retikuläre Zellen, lymphatische und Blutendothelzellen zu erhalten. Bei dem beschriebenen Verfahren wird ein kurzer Verdau mit einer automatisierten mechanischen Disaggregation kombiniert, um den Oberflächenmarkerabbau lebensfähiger Lymphknotenstromazellen zu minimieren.

Zusammenfassung

Sekundäre lymphatische Organe einschließlich Lymphknoten bestehen aus Stromazellen, die eine strukturelle Umgebung für die Homöostase, Aktivierung und Differenzierung von Lymphozyten bieten. Verschiedene Untergruppen von Stromazellen wurden durch die Expression des Adhäsionsmoleküls CD31 und des Glykoproteins Podoplanin (gp38), retikuläre Zellen der T-Zone oder fibroblastische retikuläre Zellen, lymphatische Endothelzellen, Blutendothelzellen und FRC-ähnliche Perizyten innerhalb der doppelt negativen Zellpopulation identifiziert. Für alle Populationen werden unterschiedliche Funktionen beschrieben, darunter die Trennung und Auskleidung verschiedener Kompartimente, die Anziehung und Interaktion mit verschiedenen Zelltypen, die Filtration der drainierenden Fluidik und die Kontraktion der Lymphgefäße. In den letzten Jahren haben verschiedene Gruppen eine zusätzliche Rolle von Stromazellen bei der Orchestrierung und Regulierung zytotoxischer T-Zell-Antworten beschrieben, die für den Wirt potenziell gefährlich sind.

Lymphknoten sind komplexe Strukturen mit vielen verschiedenen Zelltypen und erfordern daher ein geeignetes Verfahren zur Isolierung der gewünschten Zellpopulationen. Derzeit beruhen Protokolle für die Isolierung von Lymphknotenstromazellen auf enzymatischer Verdauung mit unterschiedlichen Inkubationszeiten; Stromazellen und ihre Oberflächenmoleküle reagieren jedoch empfindlich auf diese Enzyme, was zu einem Verlust der Oberflächenmarkerexpression und zum Zelltod führt. Hier wird ein kurzes enzymatisches Verdauungsprotokoll in Kombination mit einer automatisierten mechanischen Unterbrechung vorgeschlagen, um lebensfähige Einzelzellsuspensionen von Lymphknotenstromazellen unter Beibehaltung ihrer Oberflächenmolekülexpression zu erhalten.

Einleitung

Lymphknoten sind spezialisierte Fächer, wo adaptiven Immunantwort gegen fremde und Selbst-Antigene initiiert und koordiniert. Das hier vorgestellte Verfahren beschreibt eine kurze enzymatische Verdauung kombiniert mit automatisierten mechanischen Pipettieren Lymphknoten Einzelzellsuspension zu erhalten und Zugang zu lebensfähigen Lymphknoten Stromazellen, die die Oberflächenexpression von mehreren Molekülen zu erhalten.

Lymphknoten Stromazellen bilden das Gerüst des Lymphknotens und erfüllen drei wichtige Funktionen: sie filtern ersten Körperflüssigkeiten, Antigene, Krankheitserreger und ihre Erregermuster (PAMPs) sowie Zytokine und Gefahr assoziierte molekulare Muster zu probieren (gedämpft) vorhanden im Körper. Zweitens, sie ziehen und weisen Antigen-präsentierenden Zellen (APC) und Lymphozyten zu interagieren und zu initiieren adaptive Immunantworten; und die dritte, bieten sie eine strukturelle Umgebung für die Homöostase und Differenzierung von Lymphozyten 1-3. Während der Entzündung Lymphknoten Stromazellen produzieren Wachstumsfaktoren, Zytokine und Chemokine, die Anpassung an Schwellungen damit die Organisation der Interaktion zwischen dendritischen Zellen (DCs), T-und B-Zellen. Die Instrumentation von Immunantworten ist aufgrund der komplexen Strukturarchitektur von unterschiedlichen stromalen Zellpopulationen gebildet möglich.

Lymphknoten Stromazellen CD45-negativen Zellen und kann durch die Expression von CD31 und gp38 in Fibroblasten und Endothelzellen 1 -6 unterscheiden. Gp38 + CD31 - T-Zone definiert Retikulumzellen (TRC, die auch als FRC bekannt: fibroblastischen Retikulumzellen), gp38 + CD31 + definiert lymphatischen Endothelzellen (LEC), gp38 - CD31 + definiert Blut Endothelzellen (BEC). Weitere Charakterisierung von Subpopulationen zeigte die Existenz von anderen Lymphknoten Stromazellen. In der Tat wurde eine kleine pericyte artigen Zellpopulation innerhalb der gekennzeichnetgp38 - CD31 - Population 7. Daher ist die Anpassung des Isolationsverfahren zur Identifizierung und Charakterisierung der funktionellen Eigenschaften von verschiedenen Lymphknoten Stromazellen vorteilhaft.

Vor der Entwicklung von Lymphknoten Stromazellen Verdauung Protokolle die Untersuchung von Lymphknoten Stromazellen wurde in situ Beobachtungen mit Gewebeabschnitt und Mikroskopie beschränkt. Dennoch zeigte strukturelle und funktionelle Untersuchungen wichtige Eigenschaften von Lymphknoten Stromazellen. Lymphknoten Stromazellen mit podoplanin, Kollagen und extrazellulärer Matrix (ECM) Proteinen verbunden, um eine komplexe dreidimensionale Struktur 3 genannte Leitungssystem, die Lymphe und assoziierten-niedermolekulare Proteine ​​auf die hohe endotheliale Transporte vom subkapsuläre Sinus des Lymphknotens bilden Venolen in der T-Zellen-Zone 8. DCs sind in engem Kontakt mit Stroma-Zellen und in das rohrförmige con vorstehenden beachtenDuit Struktur zu Probenflüssigkeit und erkennen Antigene 8. Die Wechselwirkung von Lymphknoten Stromazellen (TRCs und LECs) mit DCs ist durch die Freisetzung und Präsentation von Chemokinen CCL21 und CCL19 9,10 vermittelt. CCL19 und CCL21 werden von der CCR7 Rezeptor erleichtert DCs und T-Zellen zu den Lymphknoten T-Zell-Zone 4,11 migrieren anerkannt. Trotz Verwendung ähnlicher Chemokine DCs und T-Zellen haben unterschiedliche Wanderungs in die Lymphknoten 12. Später mittels enzymatischer Verdauung der Lymphknoten und Isolierung von reinem Lymphknoten Stromazellen, funktionelle Studien über die Rolle der verschiedenen Lymphknoten Stromazellen und ihre Fähigkeit, mit DCs und T / B-Zellen interagieren 6,13 durchgeführt. Zuerst wird das Übersprechen zwischen IFN-γ produzierenden T-Effektorzellen und Lymphknoten Stromazellen induziert die Produktion der gezeigten T-Zell-Antworten und die Proliferation in den sekundären lymphoiden Organen 14-16 dämpfen Metaboliten Stickoxid. Zweiten, Lymphe node Stromazellen wurde berichtet, dass die Differenzierung der DC regulatorischen Untergruppen über die Produktion von IL-10-17 zu unterstützen und naiven T-Zell-Homöostase durch die Produktion von IL-7 6,18 modulieren. Drittens TLR-Expression in Lymphknoten stromalen Zellen legt nahe, dass Stromazellen sind anfällig für eine Infektion oder selbst Moleküle während Gewebeverletzung freigesetzt abgeleiteten Signals. Tatsächlich ist die Behandlung von Lymphknoten Stromazellen mit dem Liganden von TLR3 Poly (I: C) induziert eine geringe Hochregulation von Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-I-Expression und die Hochregulation von Co-inhibitorische Molekül PD-L1, jedoch nicht von kostimulatorischen Molekülen, was zu dramatische Veränderungen im peripheren Gewebe-Antigene Ausdruck 19. Mehrere Gruppen haben gezeigt, Lymphknoten Stromazellen exprimieren peripheren Gewebe-Antigene und induzieren Toleranz von selbstreaktiven T-Zellen 19,21-27. Daher, das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Lymphknoten Stromazellen und die andere Zugvögel und Wiedersident Lymphknotenzellen werden dabei helfen, neue Zielmoleküle zur Aktivierung oder Unterdrückung von Immunreaktionen während der Entzündung ermöglichen zu finden. Daher wird die Umsetzung der veröffentlichten enzymatische Trennung des Lymphknotens erforderlich.

Zuvor veröffentlichten Protokolle verwenden verschiedene Kombinationen von Kollagenase-basierte enzymatische Verdauung mit geringer mechanischer Belastung 6,19,20. Allerdings könnte lange Inkubationen mit Verdauungsenzymen oder andere Kombination von verschiedenen Enzym die Verdauung benötigt, um den Aktivierungsstatus zu analysieren und neue Lymphknoten Stromazellen identifizieren Oberflächenmoleküle abzubauen. Abhängig von der Art der stromalen Zellanalyse, kann die Link-Protocol-Protokoll oder Fletcher besser geeignet sein. Bei dem beschriebenen Verfahren wird eine etwas kürzere enzymatischen Verdau mit automatisierten mechanischen Disaggregation kombiniert, um Oberflächenmarker Abbau von lebensfähigen Lymphknoten Stromazellen minimieren. Diese Vorgehensweise ermöglicht hoch reproduzierbare Isolation undUnterscheidung von Lymphknoten Stroma-Zellpopulationen mit geringer Variabilität und mehr als 95% Lebensfähigkeit. Die frisch isolierten Lymphknoten Stromazellen können direkt für Oberflächenmarker-Expression, Proteinanalyse und Transkriptionsstudien sowie Errichtung Stromazellen Leitungen verwendet, um funktionelle Assays in vitro durchzuführen.

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Protokoll

In diesem Video-Veröffentlichung und Protokoll wurden alle Tierverfahren in Übereinstimmung mit der von der kantonalen Behörde Basel-Stadt, Schweiz zugelassen Tier-Protokoll durchgeführt.

1. Lymphknoten Vorbereitung und Verdauung

  1. Pre-Wärme-Wasser in einem Becher auf 37 ° C auf einem Magnetrührer mit Heizplatte.
  2. Bereiten Basis Medium wie folgt: DMEM-Medium (ohne Pyruvat) mit 2% FCS, 1,2 mM CaCl 2 und Pen / Strep (100 Einheiten Penicillin, 100 ug Streptomycin).
  3. Sterilisieren alle Dissektionsinstrumente vor dem Gebrauch.
  4. Einschläfern Lymphknoten Spendermäusen pro CO 2 Ersticken und aseptisch sezieren die Lymphknoten. Sezieren nicht die umgebende Fett. HINWEIS: Dieses Protokoll wird für periphere Haut-Lymphknoten (Leisten, brachial, Achsel) optimiert.
  5. Platzieren Lymphknoten in einer sterilen Petrischale mit 2 ml eiskaltem basischen Medium.
  6. Stören den Lymphknoten capsule mit zwei 25-G-Nadeln von 1-ml-Spritze befestigt.
  7. Übertragen des unterbrochenen Lymphknotengewebe in einem 5 ml-Polypropylen-Rundboden-Röhrchen mit 750 ul basischen Medium mit 1 mg / ml Collagenase IV und 40 ug / ml DNAse I ergänzt
  8. Fügen Sie einen sterilen Magnetrührer in jeder Röhre.
  9. Das Röhrchen in das Becherglas mit 37 ° C vorgewärmt Wasser und rühren die Rohre mit einer langsamen Geschwindigkeit (1 Runde / sec) für 30 min.
  10. Entfernen Sie den Schlauch vom Magnetrührer mit Heizplatte und lassen Lymphknotenfragmente zu begleichen.
  11. Den Überstand in "nicht-Stromazellen" angereichert vorsichtig entfernen. HINWEIS: Wenn die Analyse der T, B, dendritischen Zellen und CD45 - gp38 - CD31 - vorgesehen ist, speichern Sie die "nicht-Stromazellen" Fraktion.
  12. Wasch übrigen Lymphknotengewebe einmal mit 750 ul Basismedium. Hinweis: Dieser Schritt nur erforderlich, wenn die Arbeit mit immunkompetenten Mäusen.
  13. Lassen Lymphknotenfragmente zu begleichen.
  14. Entfernen Sie dieNicht-Stromazellen-Schwimmfraktion.
  15. In den Lymphknoten-Fragmente 750 ul basischen Medium mit 3,5 mg ergänzt / ml Collagenase D und 40 ug / ml DNase I
  16. Ort Rohr zurück in den Becher mit dem 37 ° C vorgewärmt Wasser.
  17. Verdauen Lymphknotengewebe für 5 min, während langsam umrühren.
  18. Disaggregierten Lymphknotengewebefragmente durch Pipettieren und Mischen 700 ul für 10 Zyklen bei maximaler Geschwindigkeit mit Hilfe eines automatisierten Mehrkanalpipette. HINWEIS: Dies stört Lymphknotengewebe, um die Verdauung zu verbessern.
  19. Das Röhrchen zurück in das Becherglas mit 37 ° C vorgewärmte Wasser.
  20. Digest Lymphknotengewebefragmente für weitere 10 min unter langsamem Rühren.
  21. Disaggregate Lymphknotengewebefragmente durch Pipettieren und Mischen für 99 Zyklen bei maximaler Geschwindigkeit mit Hilfe eines automatisierten Mehrkanalpipette.
  22. Fügen 7,5 ul 0,5 M EDTA zur Aufrechterhaltung Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
  23. Disaggregierten Lymphknotengewebefragmente von RohrArmatur und Mischen für 99 Zyklen bei maximaler Geschwindigkeit unter Verwendung eines automatisierten Mehrkanalpipette.
  24. Fügen Sie 750 ul Basismedium und übergeben Zellen durch eine 70 um Nylon-Mesh.
  25. Zentrifuge Zellsuspension 5 min bei 1.500 × g, 4 ° C beträgt.
  26. Stromazellen können nun für die weitere Analyse verwendet werden.

2. Die Färbung der Lymphknoten Stromazellen

  1. Verwenden Sie eine Kombination von Anti-CD45, Anti-podoplanin (gp38), Anti-CD31-Antikörper gegen TRC, LEC, BEC und DN Zellen erfolgreich zu erkennen.
  2. Inkubieren der verdauten Lymphknotengewebe mit Live / Dead-Tracker, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), Anti-CD31-APC (1: 200) in 100 ul HBSS, enthaltend 2 % FCS für mindestens 20 min, 4 ° C im Dunkeln.
  3. Waschen Sie die Zellen, indem 500 l HBSS, enthaltend 2% FCS
  4. Zentrifuge Zellsuspension 3 Minuten bei 1500 × g, 4 ° C beträgt.
  5. Resuspendieren in 100 ul HBSS, enthaltend 2% FCS.
  6. Führen Sie die gefärbten Zellen in einem Durchflusszytometer equipped mit folgenden Optik: Anregungsquelle mit bis zu drei Laser: blau (488 nm, luftgekühlt, 20 mW Festkörper), Rot (633 nm, 17 mW HeNe) und Violett (405 nm, 30 mW Festkörper) .
  7. Tor CD45 - Zellen, die blutbildenden Zellen aus.
  8. Tor Slips (FSC-W) und lebenden Zellen (LIVE / DEAD-Tracker), um Dubletten und tote Zellen auszuschließen.
  9. , LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) und DN (gp38 - CD31 - Zellen) (siehe Abbildung 1) - Inhalts gp38 gegen CD31 zu TRC (gp38 + CD31) zu visualisieren.

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Ergebnisse

Das vorliegende Protokoll ist ein von Link-et al., 2007 6 mit einer kürzeren Kochzeit (45 min maximal) durch mechanische Disaggregation mit einem automatisierten Mehrkanalpipette veröffentlicht modifizierten Verdauung Protokoll. Darüber hinaus ist das Verfahren eher standardisierte minimiert Abbau von Oberflächenmarkern auf verschiedenen Lymphknoten Stromazellen und ermöglicht die Behandlung von mehr als einer Probe gleichzeitig.

Kollagenase IV und Collagenase D Links-Pro...

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Diskussion

Die Studie von Lymphknoten Stromazellen vor kurzem wurde ein Forschungsschwerpunkt auf die Entwicklung von zwei Protokolle veröffentlicht Verdauung 6,13. Beide Protokolle angemessen sind, um einzelne Lymphknoten Stromazellen zu erhalten, unterscheiden sich jedoch in der Verwendung von Verdauungsenzymen und dem Zeitpunkt der Verdauung. Da Stromazellen und ihre Oberflächenmarker empfindlich enzymatischen Verdau und mechanischer Belastung sind, wird ein optimiertes Protokoll erforderlich.

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Sanjiv Luther und Kollegen für hilfreiche Diskussionen bei der Erstellung des aktuellen Lymphknotenverdauungsprotokolls. Diese Arbeit wurde durch SNF-Zuschüsse PPOOA-_119204 und PPOOP3_144918 an S.W.R. unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMLifeTechnologies-Gibco41965-039
FCSEndkonzentration 2%
CaCl2Sigma499609Endkonzentration 1,2 mM
Kollagenase IVWorthington Biochemical Corporation>160 Einheiten pro mg Trockengewicht, bei einer Endkonzentration von 1 mg/ml
verwenden Kollagenase DRoche11088882001Anwendung mit 3,5 mg/ml
DNAse IRoche 11284932001Einsatz bei 40 & Mikro; g/ml
RührmagneteFAUST5 mm lang-2 mm ø
Polystyrol Rundbodenröhrchen 5 mlFalcon-BD Bioscience
Magnetrührer mit HeizfunktionIKA-RCT-Standard9720250
Petrischalen 100 mm, sterilTPP6223201
25 G NadelnTerumo
Anti Maus CD45 AbBiolegendClone 30-F11
Anti Maus CD11c AbBiolegendClone N418
Anti Maus Podoplanin AbBiolegendClone 8.1.1
Anti Maus CD31 AbBiolegendClone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel		Eppendorf4861 000.821/8301.250 µ l max. Volumen
Anti-Maus CD140aBiolegendClone APA5
Anti-Maus CD80BiolegendClone 16-10A1
Anti-Maus CD40BiolegendClone 1C10
Anti-Maus I-AbBiolegendClone AF6-120.1
Anti-Maus CD274 (PD-L1)BiolegendClone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Nah-IR-Färbeset für tote ZellenInvitrogenL10119

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