Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Der Prozess der Clathrin-vermittelte Endozytose (CME) ist abhängig von der rechtzeitigen Ankunft der vielen Komponenten der Clathrin-vermittelten endozytischen Maschinen, um Fracht in die Vesikel ^1-3 sammeln und die Plasmamembran zu manipulieren. CME ist durch Membran Verformung und Fracht-Adapterproteine, die an werdende Stellen der Endozytose ¹ zusammen kommen eingeleitet. Diese Proteine ​​rekrutieren das Hüllprotein Clathrin, die in eine käfigartige Struktur, die die Clathrin-beschichteten Nadel (KPCh) ⁴ bildet versammelt. Nachdem die KPCh ist vollständig in eine Kugelform, Membranspaltung, vor allem durch Maßnahmen der großen GTPase, Dynamin montiert, erzeugt freie Clathrin-umhüllten Vesikeln (CCV) ^5,6. Diese Internalisierung triggert schnelle Demontage der Clathrin-Mantel, so dass für mehrere Runden von CME Komponenten wiederverwendet werden.

Die Entdeckung und Charakterisierung der Proteine ​​in CME beteiligt wurde in der traditionellen Bioch verwurzeltemical, genetischen und mikroskopischen Techniken ^4-6,8. Diese Tests haben die Rollen und Interaktionspunkte dieser endozytischen Komponenten erläutert. Obwohl sehr nützlich zur Definition von wesentlichen Komponenten Handel Maschinen sind diese Tests sehr bei der Erfassung des dynamischen Verhaltens von CME Komponenten oder Ladungskonzentration begrenzt. Dies ist eine kritische Einschränkung, da CME wird durch die Anordnung choreographiert von Sätzen von Protein-Module in definierten Schritten angetrieben wird, und da kleine Veränderungen in der Dynamik der einzelnen endocytic Ereignisse große kumulativen Auswirkungen auf die Endozytose haben. Ferner bisherigen Daten zeigen, dass einzelne CCP kann sowohl in ihrer Zusammensetzung und in ihrem Verhalten unterscheiden, was darauf hindeutet, dass die physiologische Regulation dieses Verfahren ist sehr räumlich und zeitlich eingeschränkt ^9-14. Visualisierung einzelner endozytischen Ereignisse ist daher wichtig zu verstehen, warum es mehrere redundante Proteine ​​in CME beteiligt und wie diese Proteine ​​könnte gesteuert werden by physiologische Signale, um Fracht Internalisierung regulieren.

Hier beschreiben wir den Einsatz von Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) CME auf der Ebene der Dynamik der einzelnen CCPs in lebenden Zellen zu beobachten. TIRFM beruht auf dem Unterschied im Brechungsindex zwischen dem Deckglas und der Fluidumgebung der Zellen ^15,16. Wenn das Anregungslicht auf die Zellen zu mehr als dem kritischen Winkel gerichtet ist, wird intern reflektiert, wodurch eine abklingende Welle, die einen dünnen Bereich der Beleuchtung, der sich ungefähr 100 nm oberhalb des Deckglases beibehält. Dies stellt sicher, dass nur die Fluoreszenzmoleküle in diesem engen Bereich angeregt werden. Praktisch kann dies die Anregung von Fluoreszenzmolekülen auf oder in der Nähe der Plasmamembran, und minimiert die Fluoreszenz von den inneren Teilen der Zelle. Dies stellt einen wesentlich höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnis und z-Achsenauflösung auf Ereignisse in der Plasmamembran, CO visualisierenzu häufig verwendeten Modi wie herkömmliche Epifluoreszenz oder konfokaler Fluoreszenzmikroskopie mpared. Wir beschreiben auch, zu einem Einführungs und praktischen Ebene, um die Verwendung einer gängigen Bildanalyse-Plattform zu analysieren und zu quantifizieren einfache morphologische Merkmale und Dynamik der einzelnen Lade endozytischen Veranstaltungen.

1. Expression von fluoreszenzmarkierten CME-Komponenten in kultivierten Zellen

HEK293-Zellen sind Zellen, die nützliches Modell ausgiebig genutzt wurden, um GPCR Biologie und Endozytose zu untersuchen, und sind daher als Modelle in diesem Protokoll verwendet. Verwenden Sie eine beliebige Transfektionsprotokolls eine gleichmäßige Ausdruck ohne Überexpression und geringe Zytotoxizität.

1. Behandeln Sie alle Zellkultur in einem sterilen Laminarströmungshaube. Füllen 4 Vertiefungen einer Platte mit 12 Vertiefungen mit 1 ml Dulbeccos modifiziertem essentiellen Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Einer konfluenten T25-Flasche von HEK293 Zellen 1:50 1:25 1:16 1:10 jeweils in jeder der 4 Vertiefungen.
   1. Alternativ Saatgutzellen zu einer Multi-Well-Platte der gewünschten Größe, nach den Herstelleranweisungen. Saatgut 0,4-2 x 10 ⁴ Zellen in eine 12-Well-Platte. Wachsen die Zellen über Nacht in einem sterilen 37 ° C mit 5% CO ₂ und 95% Luftfeuchtigkeit.
      HINWEIS: In Anbetracht, dass das Wachstum rAtes variieren je nach den Bedingungen und Zelllinien abhängig, es vorzuziehen, mehrere Brunnen der Aussaat bis zur Konfluenz ideal für die Transfektion sicherzustellen, den nächsten Tag oder die Möglichkeit der Durchführung Transfektionen in doppelter sein könnten.
2. Am nächsten Morgen, wählen Sie eine, die gut ist ~ 70% konfluent für die Transfektion (siehe Abbildung 1B). Wenn kein gut, diesen Zustand erreicht hat, noch einen Tag warten.
   HINWEIS: 70% Konfluenz ist ideal für HEK293-Zellen. Transfizieren von Zellen, die spärlicher Zelltod führt und Toxizität sind. Transfektion über konfluenten Zellen führt zu einer schlechten Ausdruck.
3. Es werden 60 ul Puffer EC (von Transfektion kit), 400 ng des markierten Plasmide GPCRs und / oder Komponenten der Clathrin-Maschinen, und 2,4 ul der Enhancer in 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen, wie in dem Protokoll des Herstellers beschrieben. Wirbel für 2 Sekunden, um eine ausreichende Vermischung sicherzustellen, und dreht in einer Mikrozentrifuge bei 2.000 · g für 2 Sekunden, um die Flüssigkeit am Boden zu sammeln.
4. Hinzufügen6 ul Effectene nach dem Protokoll des Herstellers beschrieben. Für 2 Sekunden vortexen und Schleudern bei 2.000 × g für 2 Sekunden in einer Mikrozentrifuge, um die Flüssigkeit am Boden zu sammeln. Warten Sie 20 min, um die Bildung von Mizellen Transfektionskomplexes ermöglichen.
5. Absaugen Medien aus dem gut transfiziert werden. Vorsichtig mit 10% FBS hinzufügen 0,8 ml DMEM auf die Transfektionsreagenz Mischung zugeben und durch Auf-und Abpipettieren langsam zu reduzieren brechen die Mizellen. Hinzufügen der Medien und Transfektionsgemisch zu der auch sehr langsam von der Seite. Fügen Sie alle verbleibenden Transfektion Mischung aus dem Mikrozentrifugenröhrchen, um die gut mit einer Mikropipette.
   HINWEIS: Fügen Sie optional eine zusätzliche 0,5 ml DMEM mit 10% FBS auf die transfizierten gut zu den Zellen geben zusätzliche Nahrung, was zu sanfteren Transfektion und unteren transiente Expression.
6. Rückkehr der Zellen an die 37 ° C-Inkubator für 5 Stunden.
7. Absaugen Medien, die die Transfektion Mischung. Ersetzen mit 1 ml DMEM mit 10% FBS. Erlaubendie Zellen über Nacht wachsen.
8. Am nächsten Tag passieren die Zellen zu unbeschichteten Deckgläschen, die zuvor durch Autoklavieren sterilisiert.
   1. 0,5 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) mit 1 mM EDTA zu jeder Vertiefung. Alternativ können Sie 0,5 ml 0,05% Trypsin-EDTA. Lassen Sie in den Brutschrank für 1 min.
   2. Platz 3 rund, sterile 25 mm Deckgläschen in separate Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Füllen Sie jede Vertiefung mit 2 ml Medium. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas auf dem Boden des Brunnens, um Zellen aus wachsen auf der Unterseite des Deckglases zu verhindern.
   3. Manuell bewegen die gut abheben, die Zellen vom Boden des Brunnens. 1 ml DMEM mit 10% FBS zu resuspendieren. Verteilen Sie die angehoben Zellen aus 1 Well einer 12-Well-Platte gleichmäßig unter den 3 Deckgläser. Alternativ Platte Zellen auf 3 Glasboden Gerichte.
9. Damit sich die Zellen an den Deckgläsern für mindestens 48 h vor der Bildgebung zu wachsen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen aus und flach ausgebreitet.

2.Imaging CCP und Cargo-Dynamics Mit TIRFM

1. Konjugat M1 Anti-FLAG-Antikörper mit Alexa-Farbstoffe mit Alexa Fluor Protein Labeling Kit nach dem Protokoll des Herstellers. Alternativ kann vor-konjugierte Antikörper erworben werden.
2. Pre-Inkubation die Zellen mit den Antikörpern in einer 1: 1000-Verdünnung in 1 ml vorgewärmtes Leibovitz-Medium mit 10% FBS, oder Opti-MEM, das mit 50 mM HEPES pH 7.4 und 10% FBS für 10 min bei 37 ° C (Abbildungs mittel), FLAG-getaggte GPCRs an der Zelloberfläche zu markieren. Überspringen Sie diese Schritte, wenn genetisch kodierte Fluoreszenzproteine, wie GFP, werden als Tags verwendet (siehe Diskussion für Details).
3. Übertragen Sie das Deckglas zu einem Live-Cell-Imaging Kammer. Alternativ für Glasbodenplatten, absaugen Antikörper-Kennzeichnung Medien und fügen Sie 700 ul vorgewärmtes Abbildungsmedium.
   1. Verwenden Sie eine Pinzette und biegen Sie die Spitze einer 25-Gauge-Nadel in einen Haken.
   2. Halten Sie eine Pinzette in der dominanten Hand. Halten Sie die gebogene Nadel in der OTHäh. Drehen Sie die Nadel bis in die Haken Kurven nach unten in Richtung des Glases. Ziehen Sie vorsichtig die Nadel, Haken nach unten, über den Boden einer 6-Well-Platte, bis sie auf dem Deckglas Haken. Achten Sie darauf, nicht die Oberfläche des Deckglases zu kratzen, wie es Zellen zu lösen. Heben Sie die Deckglas vom Boden des Brunnens. Gleichgewicht der Deckglas gegen die Wand des Brunnens für die Unterstützung.
   3. Verwenden Sie die Pinzette in der Nähe der Kante des Deckglases zu erfassen und bewegen Sie die Deckzellseite bis zu der bildgebenden Kammer und die Kammer zusammenzubauen. Fügen Sie 700 ul (oder entsprechende Menge) des vorgewärmten Abbildungsmedium. Behandeln Sie die Deckgläser vorsichtig, ohne Druck knacken oder zu brechen zu verhindern.
4. Übertragen der Kammer auf das Mikroskop und die Temperatur der Zellen bei 37 ° C unter Verwendung einer Heizer oder einen geschlossenen Inkubator.
5. Zellen in den Fokus zu bringen mit einem 100X oder 60X TIRF Öl-Immersionsobjektiv (NA 1.45 oder höher). Bild die Zellen in herkömmlichen Epi-Fluoreszenz oder conBrennbeleuchtungsarten (dh nicht TIRFM), um Zellen, die die entsprechende Konstrukte zu identifizieren. Out-of-focus-Zellen sind fast unsichtbar in der dünnen Tiefe von TIRF-Beleuchtung macht es schwierig, die Brennebene und Zellen zu finden.
   HINWEIS: Einige Systeme verwenden die gleichen Laser für TIRFM für Bild in herkömmlichen Epi-Fluoreszenz, indem Sie den Einfallswinkel des Lasers über dem kritischen Winkel. Als eine wichtige Vorsichtsmaßnahme, immer über den Winkel des Laserstrahls ist, und immer direkt das vom Beobachter weg.
6. Konzentrieren sich auf die Bodenfläche einer exprimierenden Zelle, bis der Umriß des Plasmamembran in der Zelle verschwindet und der Mitte der Zelle angezeigt wird. Dies ist am deutlichsten mit einer Plasmamembran lokalisierte Ladung Protein wie die μ-Opioid-Rezeptor (siehe Abbildung 2A).
7. Wechseln Sie zu TIRF-Bildgebung.
   1. Wenn unter Verwendung der gleichen Laser zur Bilderzeugung in herkömmlicher Epifluoreszenz, erhöhen die Einfallswinkel derLaser bis Out-of-focus-Fluoreszenz im Innern der Zelle verschwindet, und keine Kontur Plasmamembran in der Umgebung der Zelle zu sehen ist. (Vergleiche Figur 2C auf die 2A und 2B)
      HINWEIS: In TIRFM, Bewegen der Brennebene wird das Bild komplett unscharf und / oder dim gehen, und die Gesamtfluoreszenzniveaus aufgrund der geringeren Tiefe der Beleuchtung abnimmt. Daher ist eine alternative Methode, um TIRFM Beleuchtung wechseln, ist zunächst auf die Mitte der Zelle in der konfokalen / herkömmlichen Epi-Fluoreszenz, dann erhöhen Sie den Einfallswinkel, bis Sie die meisten der Fluoreszenz zu verlieren, und dann konzentrieren auf der Plasmamembran.
   2. Einmal in TIRFM sicher, dass der Anregungs-Laser zurück reflektiert und durch die Objektiv nicht über das Ziel angezeigt. Bestätigen Sie dies, indem Sie, wenn der Laserpunkt sichtbar ist.
      HINWEIS: Bei herkömmlichen konfokalen Epifluoreszenz oder Modi, die Laserbeleuchtung über dem Ziel angezeigt wird,wie an der Decke.
   3. Verfeinern Sie den Fokus auf ein scharfes Bild zu bekommen. Die Hauptkomponenten des endozytischen Maschinen, wie Clathrin, werden in Pünktchen sichtbar sein. Stellen Sie den Fokus auf feine, so dass die Tränenpünktchen sind so rund wie möglich.
      HINWEIS: Für die Membran-lokalisierten Ladung, passen Sie die Feinfokus, bis die Filopodien deutliche erscheinen.
   4. Verwenden Sie ein Akquisitionsprogramm, um alle Bildparameter wie Spiegel und TIRF Winkel zu speichern. Tun Sie dies für alle notwendigen Wellenlängen.
8. Scannen auf der Deck zu Zellen, alle gewünschten endocytic Marker zu finden: die μ-Opioid-Rezeptor und den Adapter β-Arrestin in dem in 3A gezeigten Beispiel. Markieren Sie die Zellen, die zum Ausdruck bringt, aber nicht über-exprimierenden. Siehe Diskussion für Details.
9. Sobald Zellen identifiziert werden, Bilder alle 3 Sekunden zu erwerben für 10 min. Dies ist ausreichend, um die Lebensdauer eines CCP zu erfassen, da die mittlere Lebenszeit einer CCP in HEK293-Zellen unter diesen Bedingungen abgebildet ist around 40 sec ^10-11. Dies ermöglicht etwa 12-14 Frames, aus der KPCh zu beobachten. Siehe zum Beispiel Film-1. Wiederholen Sie alle Schritte, um zusätzliche Bildzellen.

3. Analyse der endozytischen Dynamics durch manuelle Überprüfung

Obwohl manuelle Überprüfung von CCP Lebensdauer ist stark von der Anzahl der CCPs, die detektiert werden kann beschränkt, bleibt es immer noch eine genaue Mittel zur Erkennung unbeeindruckt von globalen Veränderungen in den Bilderkennung und Artefakte. Siehe Diskussion für Details.

1. Öffnen Sie die Datei in ImageJ. Bilder werden als einzelne Stapel von TIFF-Dateien mit verschachtelten Kanäle gespeichert. Konvertieren von Bildern in hyperstacks. Zum Bild> Hyperstacks>, um Hyperstack stapeln. Geben Sie die Anzahl der Kanäle erworben (dh wenn die Bildgebung β-Arrestin und die μ-Opioid-Rezeptor, geben Sie 2) Geben Sie 1 für Z-Stapel (TIRFM ist eine einzige Ebene), und die Anzahl der Frames des Films (dh 10 Minuten Film im 1 Bild alle 3 Sekunden iS 200) in dem Pop-up-Fenster.
2. Die Hyperstack-Format ergibt sich ein Fenster mit zwei Bildlaufleisten. Verwenden Sie die obere Leiste, um durch die Kanäle und die untere bewegen, um durch die Zeit zu bewegen. Blättern Sie zu dem Kanal des Protein, dessen Lebenszeiten wird untersucht werden.
3. Gehen Sie zu Bild 10 oder 15 des Films, um die Einbeziehung von bereits bestehenden CCP, deren gesamte Dauer nicht sichtbar reduzieren. Zeichnen Sie eine ROI-Box um einen zufällig ausgewählten Ort.
4. Zählen Sie die Anzahl der Frames ein Punkt sichtbar ist.
   HINWEIS: Siehe Abbildung 3B und 3C Beispiele für drei Kategorien von morphologischen endozytischen Veranstaltungen ^10,11,16-19.

4. Analyse der endozytischen Dynamics Ziel Anerkennung

Ziel Erkennung ermöglicht den Nachweis von praktisch allen abgebildeten CCP in einer Zelle, kann aber anfällig für Fehler aufgrund von falschen Detektion von fehlerhaften Strukturen. Siehe Diskussion für Details Abwägung der Vor-und Nachteile von EACH-Verfahren. Mehrere Programme, einschließlich kundenspezifische Algorithmen verwendet werden, um objektiv CCPs zu erkennen. Dieses Protokoll beschreibt objektive Anerkennung von CCPs mit Imaris, eine Bildanalyse-Software (siehe Materialien).

1. Um zu beginnen, öffnen Sie die RAW-Bilddatei in der Bildanalyse-Software. Standardmäßig wird eine zusammengeführte Farbbild. Verwenden Sie das Fenster "Display-Einstellung", um die Helligkeit eines Kanals einzustellen. Klicken Sie auf den Namen eines Kanals, um die angezeigte Farbe zu ändern. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen neben dem Kanal, um seine Anzeige zu verhindern (siehe Abbildung 4A).
2. Erstellen "Spots", indem Sie auf das Symbol mit orange Flecken. Siehe Abbildung 4B. Wählen Sie eine Region of Interest (ROI) in der Zelle. Siehe Abbildung 4C. Verwenden Sie eine ROI um Bereiche, die falsch hellen Vorderkanten und Plaketten erkennen wird ausgeschlossen. Analysieren Sie mehrere Zellen mit unterschiedlichen Expressionsniveaus getrennt.
3. Messen Sie den Durchmesser eines Spot to provide ersten Schätzungen für den Algorithmus. Schalten Sie in den Modus "Slice", und klicken Sie auf polaren Enden einer Stelle, um seinen Durchmesser zu messen. Siehe Abbildung 4E. Tun Sie dies für 4 oder 5 runden Flecken weisen auf eine CCP Blick auf die Höhe seiner Stabilität, nach der Bildung und Spaltung vor. Mit diesen Messungen auf einen durchschnittlichen Durchmesser auf die nächste Zehntel Mikrometer zu berechnen.
4. Spots zu erkennen. Zurück zu "übertreffen"-Modus. Wählen Sie den entsprechenden Kanal für die Erkennung. Geben Sie den durchschnittlichen gemessenen Durchmesser, in der Regel 0,3 oder 0,4 um. Klicken Sie auf den blauen Pfeil nach vorne, um die Spots zu quantifizieren. Siehe Abbildung 4E. Wenn der Durchmesser des Spots unterschätzt wird, wird unechten Punkten der Fluoreszenz als Spots identifiziert werden. Wenn der Durchmesser zu groß ist, wird es wahr Spots ignoriert. Wenn Sie unsicher sind, schätzen ein wenig niedriger, und filtern die falsche Erkennungen später.
5. Spots filtern, indem Qualität. Passen Sie die Filter, um so viele wie möglich zu erfassen Spots ohne RückenBoden. Das Qualitäts Filter ist standardmäßig ²⁰ ausgewählt. Siehe Abbildung 4F.
   1. Verwenden Sie die Kurve "Qualität" als Leitfaden für eine entsprechende Schwelle. Bewegen Sie die untere Schwelle des Filters mit der linken Maustaste auf diese erste Sprung in der Kurve. Dies ist ein guter Ausgangspunkt für den Filter, da diese Position in der Regel verfeinert Erkennung, um nur sichtbar Spots. Siehe Abbildung 4F.
   2. Erkannt Flecken auf dem Film als Kugeln oder Zentrum Pixel. Auf der Registerkarte "Farben", passen Sie die Farbe der Spots zu einer Kontrastfarbe, um es einfacher, sie zu sehen. Blättern Sie durch den Film, um die Spots in jedem Frame zu überprüfen. Das Ziel ist es, möglichst viele Spots wie möglich für die Gesamtheit ihrer Lebenszeit zu erfassen.
   3. Beseitigen Dimmer Spots oder manuell verbinden sie in kontinuierlichen Spuren später, als sie nicht gut durch den Kurs ihres Lebens erkannt.
   4. Entfernen Sie helle Plaques mit einem "Intensity" filter, falls erforderlich. Klicken Sie auf das grüne Pluszeichen, um einen neuen Filter hinzuzufügen. Siehe Abbildung 4F. Neues Intensity Filter, um in oder aus einer bestimmten Spots Fluoreszenzsignale zu filtern. Verwenden Sie den erzeugten Intensitätskurve, (analog zu Qualitäts Kurve in 4,5 erörtert), die Schwelle gesetzt. Mit der linken Maustaste auf den äußersten linken Ende der Kurve, die die hellsten Spots stellt entfernen.
      HINWEIS: Große Plaque-Strukturen sind in der Regel zu den hellsten Elemente in der Zelle, und sie sind einfach mit diesem Filter ausgeschlossen.
   5. Blättern Sie durch den Film, um zu gewährleisten, dass die CCPs werden als Spots erkannt und die hellsten Plaques werden nicht mehr erkannt. 3D zeigt eine Zelle, in der Erkennung von CCPs (durch weiße Kugeln bezeichnet) wurde mit dem Qualitätsfilter optimiert und Platten wurden mit der Qualität ausgeschlossen Filter.
   6. Reduzieren hellen Zelle Kanten mit der Qualitätsfilter. Helle Objekte können noch müssen manuell entfernt werden, bei dem nächsten Schritt. Fahren Sie mit dem blauPfeil.
   7. Entfernen abweichende Spots in der Spots Bildschirm bearbeiten. Wechseln Sie zu "Select"-Modus. Klicken Sie auf der Stelle. Es wird gelb. Klicken Sie auf "Löschen". Klicken Sie auf den blauen Pfeil, um die Erstellung des Algorithmus. Siehe Abbildung 4G.
6. Maßnahme Spuren. Stellen Tracks auf "Brownschen Bewegung." Die KPCh sollten keine gerichtete Bewegung, nur minimale Drift durch die Plasmamembran aufweisen. Dieser Algorithmus ist für die Bewegung am besten geeignet. Siehe Abbildung 4H.
   1. Stellen Sie die Max Entfernung auf einen kleinen Wert wie 0,7 um. Siehe Abbildung 4H.
      Hinweis: Wird eine kleine Strecke minimiert Verbindung benachbarter Spots und immer noch erlaubt für die weitere Verfolgung einer Zelle vor Ort über die CCP oder Zellbewegung.
   2. Satz Max Gap Größe auf 1. Dies ermöglicht eine Spur weiter, wenn es nur ein Rahmen fehlt in Folge. Klicken Sie auf den blauen Pfeil, um Spuren zu berechnen. Siehe Abbildung 4H.
      HINWEIS: Gap Größen von mehr als 3 Ursachen verschiedene Spuren falsch miteinander verknüpft werden.
   3. Schalter Spur betrachten zu "Drachenschwanz". Blättern Sie durch die Beobachtung der Film Erfassungsqualität. Wenn benachbarte Spots werden verbunden, verringern Sie die Max Entfernung unter 0,7 um. Wenn Spots werden bis zu leicht gebrochen, erhöhen Sie die Größe Max Gap. Klicken Sie auf den blauen Pfeil, um Tracks. Dies führt zu der Filterspuren Bildschirm. Siehe Abbildung 4H.
7. Filter Tracks und Export von Daten. Verwenden Sie einen "Intensity" Filter, um zusätzliche helle Plaques zu entfernen. Verwenden Sie eine "Verschiebung" Filter, um Endosomen, die die TIRF-Feld eingeben zu entfernen. Seien Sie vorsichtig, da mehr Spots wird länger Verschiebungen sowie zu haben. Klicken Sie auf die grüne Doppelpfeil, um das Protokoll zu vervollständigen. Siehe Abbildung 4E.
   1. Verwenden Sie die Registerkarte Tracks bearbeiten, mit dem Bleistift-Symbol, um falsch positive Erkennungen von Tracks, die nicht durch Filter entfernt werden können, zu entfernen. Überprüfen Sie discontinuities oder falsch-Verbindungen. Auf zwei Spuren zu verbinden, wählen Sie diese mit Strg-Linksklick, dann klicken Sie auf "Verbinden" Auf den Spuren Eingabefeld ein. Um Titel in separate Flecken zu trennen, wählen Sie einen Track und drücken Sie "Disconnect". Wählen Sie mehrere Spots mit Strg + Linksklick und klicken Sie auf "Verbinden", um eine neue Spur zu erstellen. Das Verfahren ist das gleiche für die Bearbeitung Spots, in 4.5.7 beschrieben. Siehe Abbildung 4J.
   2. Um Daten zu exportieren, gehen Sie auf die Registerkarte Statistik. Klicken Sie auf die einzelnen Disketten-Symbol, um die ausgewählte Statistik exportieren. Klicken Sie auf das Symbol, das wie eine Reihe von Disketten sieht, dass alle Statistiken zu exportieren. Der "Track Dauer"-Statistik enthält die Länge der endozytischen Spuren. Siehe Abbildung 4K.

Verwendung lebender Zellen TIRF Mikroskopie wir die endozytischen Dynamik des μ-Opioid-Rezeptor (MOR) aufgezeichnet ist, ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) und deren endocytic Adapterprotein β-Arrestin. Die β-Arrestin-Konstrukt wurde vorübergehend in einem stabil exprimieren MOR-Zelllinie unter Verwendung des Protokolls in Abbildung 1 skizziert transfiziert und 96 Stunden später abgebildet. Die MOR in der stabilen Zelllinie ist N-terminal mit einem pH-sensitive GFP markiert. Diese fluoreszierende Protein fluoresziert nur im neutralen extrazellulären Flüssigkeit. Auch die MOR nur einmal Endozytose durch einen Agonisten aktiviert, und bleibt sonst gleichmäßig über die Membran verteilt. Die Konzentration auf die anhaftenden Plasmamembran, die auf dem Deckglas in einer Zelle, die in mit einer schwachen Fluoreszenz gefüllt ist sitzt in der konfokalen Modus Ergebnisse. Dies unterscheidet sich von einem sich auf die Mitte der Zelle, wo die Plasmamembran wird nur als ein Ring von Fluoreszenz in der Zelle zu sehen. Vergleichen Sie die linkeund rechten Fenster in 2A. Umschalten auf herkömmliche Epifluoreszenz oder TIRF mit einem falschen Winkel bewirkt unscharf Fluoreszenz sichtbar werden in den gleichen Zellen wie in 2B gezeigt. Wenn die TIRF Winkel korrekt ist die Plasmamembran ist sehr knackig, klar und hell und unscharf Fluoreszenz nicht mehr stört das Bild. Vergleichen 2C auf die 2A und 2B.

Das Bild ist klar und scharf, weil die MOR ist auf der anhaftenden Plasmamembran, die weitgehend in der TIRF-Feld ist. Im Gegensatz dazu bleibt β-Arrestin in einer cytosolischen Pool, wenn noch nicht endozytischen Pünktchen rekrutiert und erscheint verschwommen und unscharf, weil es nicht in der TIRF-Feld. Sobald die MOR durch einen Agonisten aktiviert wird, wird β-Arrestin zur Plasmamembran rekrutiert, und beide β-Arrestin und dem Rezeptor zu verteilen, CCP (3A und Film 1 Ist β-Arrestin in grün, MOR in rot, Overlay-gelb).

Die Lebensdauern dieser Cluster kann manuell mit Hilfe der drei Parameter für abgeschlossene Endozytose quantifiziert werden, wie in 3B dargestellt. Die Spots bezeichnet CCPs kann entweder ganz verschwinden (siehe auch Abbildung 3C), "Blinken" ein-und ausschalten oder "kneifen Sie" eine größere Struktur. Die beiden letztgenannten Bedingungen stellen Ereignisse, die räumlich zu dicht zusammen als getrennte Ereignisse aufgelöst werden. Die Spot-Erfassungsalgorithmus in Imaris ist auch nützlich, CCP quantifizieren, wie in Figur 4 dargestellt. Figur 3D zeigt den CCP detektiert Verwendung Imaris, nach der Filterung, um nicht-dynamischen Plakette Strukturen zu entfernen. Überlagert weiße Kugeln bezeichnen erkannt Flecken. Dimmer-Spots, die für ihre ganze Lebenszeit nicht festgestellt werden konnten, wurden auch mit der "Qualität" Filter ausgeschlossen.

Abbildung 2: Das Finden der TIRFM Feld. (A) Die Plasmamembran der konfokalen abgebildet. Die linke Tafel zeigt Zellen in der konfokalen mit einem Schwerpunkt auf der Mitte der Zelle. Die Plasmamembran wird nur als "Ring" um die Zelle zu sehen. Fokussieren auf die basale Plasmamembran, angrenzend an das Deckglas wird die Zelle mit einer schwachen Fluoreszenz gefüllt werden. Die Plasmamembran "Ring" nicht (B) Die basale Plasmamembran mit einem flacheren Winkel TIRF Herstellung herkömmlicher Epifluoreszenz Beleuchtung durch die Probe in der dünneren TIRF Feld sichtbar.. Dies beleuchtet die gesamte Zelle und viel unscharf Fluoreszenz von der Oberseite der Zelle vorhanden ist. (C) der Plasmamembran in TIRF. Die Konzentration auf Filopodien hilft, diese Ebene zu finden. Beachten Sie, dass eseine glatte einzigen Ebene. Maßstabsbalken sind 10 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Visualisierung und Quantifizierung endozytischen Ereignisse in TIRF. (A) Eine Zelle vor und nach der Zugabe eines Agonisten, der Endocytose induziert die μ-Opioid-Rezeptor (MOR) und β-Arrestin exprimieren. Der Agonist bewirkt Umverteilung der beiden Proteine ​​zu endozytischen Pünktchen. Maßstab ist 10 um. (B) Drei Arten von endozytischen Ereignisse, durch die Visualisierung Arrestin Dynamik, im Einklang mit den zuvor beschriebenen Morphologien gesehen. "Steady", ein Dauersignal, die schnell verschwindet. Dies ist der Haupttyp, was darauf hinweist, dass die KPCh Knospen und verließ den TIRF-Feld. "Blink", ein Signal, das blinkt zu einem niedrigeren Signal und erscheint wieder an der gleichen Stelle durch Montage einer zweiten CCP an der gleichen Stelle. "Pinch off", einen rohrförmigen Vorsprung löst einen Punkt, wenn zwei CCP zu nahe beieinander als getrennte Flecken gelöst werden sollen, und eine Endozytose wird. Die Box ist 2 x 2 um. (C) Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von MOR bei Einzelereignis-Auflösung. Zwei Beispiele, die den Hauptanteil des MOR endocytic Ereignisse repräsentieren, gezeigt. Rahmen sind alle 3 Sek. Die Box ist 2 x 2 um. (D) Nachweis der einzelnen Ereignisse mit endozytischen Imaris. Weiße Kugeln bezeichnen CCPs als Spots erkannt. Spot Detection optimiert mit Hilfe eines "Quality"-Filter. Dimmer Spots, die für die Gesamtheit der zu Lebzeiten nicht erkannt werden konnten, wurden auch mit der Qualität Filter ausgeschlossen. Große Plaque-Strukturen, die als unentdeckt gezeigt werden, wurden mit Hilfe eines "Intensity" Filter weggelassen.ig3large.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: objektive Anerkennung der Dynamik der Ereignisse mit endozytischen Imaris. (A) Die Anzeige Einstellung Fenster verwendet werden, um die Anzeige des Bildes anpassen, wie in Schritt 4.1 beschrieben. (B) Öffnen der "Spots"-Algorithmus Bauer. Der Bauherr wird im Fenster unten angezeigt. (C) Der erste Schritt des Algorithmus Spots Bauer. Überprüfen Sie, wenn nötig "Track Spots (über die Zeit)." Check "-Segment nur eine Region of Interest". (D) ROI Auswahl-Bildschirm. Siehe Schritt 4.2 für Details. (E) den mehreren Fenstern benötigt wird, um den Durchmesser eines Messbereichs bestimmen. Panels stellen: Umschalten von Surpass Slice-Modus mit der Navigation Bar an der Spitze, ein Klick auf die polaren Enden einer Stelle, wo die gemessene Durchmesser angezeigt, in der Regel auf der rechten Seite, wo man die gemessene Durchmesser eingeben. Siehe Schritte 4.3-4.4. (F) Die in 4.5-4.5.3 beschrieben Spot Qualität Filter. Flecken Fenster (G) bearbeiten in 4.5.7 beschrieben. (H) messen Spuren und Anzeigen von Tracks Fenster, in 4.6 beschrieben. (I) Filter Tracks Fenster in 4.7 beschrieben. (J) Edit-Tracks in 4.7.1 beschriebenen Fenster. 4.7.2 beschrieben in Datenbild (K) Speichern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Film 1 .

Die Autoren haben nichts offenzulegen.