Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

Organoytpic Schnittkulturen des zentralen Nervensystems haben sich als sehr nützlich für das Studium Neuron und Glia Zellbiologie in semiintact System ^{1 - 4.} Diese Kulturen sind relativ einfach zu übernehmen und behalten viele Vorteile der primären dissoziierten Zellkulturen, wie Manipulationen der die extrazelluläre Umgebung und einfachen Zugang für wiederholte langfristige Live Cell Imaging und elektrophysiologischen Ableitungen ^5-9. Außerdem Schnittkulturen pflegen 3-dimensionalen Gewebe Zellarchitektur, regionalen neuronalen Konnektivität, und die meisten großen Zelltypen in dem System vorhanden sind. Diese Eigenschaften machen diese Kulturen ein einzigartiges und bequemes System zur Einzelzellverhalten und Physiologie mit zellulären und Umweltwechselwirkungen zu untersuchen.

NG2 Zellen eine Population von Gliazellen im Zentralnervensystem von Säugetieren, die zur Proliferation und erzeugen weiterhin myelinating Oligodendrozyten während der embryonalen und postnatalen Entwicklung ^10. Sie sind ausführlich in dissoziierten primären Zellkulturen untersucht, und die jüngsten Entwicklung transgener Mauslinien mit NG2 zellspezifische Expression von fluoreszierenden Proteinen in vivo Schicksal Mapping und elektrophysiologische Ableitungen im spitzen Schnittpräparate erleichtert. Auch bei diesen Studien ist wenig über die zeitliche Dynamik der NG2 Zellproliferation und Differenzierung Oligodendrozyten bekannt. Obwohl dissoziierten Zellkultur in großem Umfang zur relativen Anlage in pharmakologischen und genetischen Manipulationen verwendet werden, ist es nicht geeignet für die Abfragefunktionsunterschiede dieser Zellen in verschiedenen Hirnregionen insbesondere wenn es wünschenswert ist, den Rahmen der zellulären Mikroumgebung aufrechtzuerhalten. Schnittkulturen bieten eine einfache Alternative, die zugänglich für pharmakologische Manipulationen ist und verwendet worden, um Oligodendrozyten Myelinisierung ^11,12 untersuchen, Zelldere Reaktion nach Lysolecithin (LPC) oder Antikörper-induzierte Demyelinisierung ^13,14, und die Induktion von Remyelinisierung über pharmakologische Behandlung ^15.

Ein Verfahren zur Untersuchung und Analyse von NG2 führen Zellproliferation und Differenzierung in Oligodendrozyten organotypischen Schnittkulturen sowohl aus dem Vorderhirn und Kleinhirn getroffen wird beschrieben Live-Bildgebung und fixiertem Gewebe (oder Nachfixierung). Dies ist eine leistungsfähige Methode, die verwendet werden können, um die Zelle Schicksal der einzelnen Zellen nach NG2 Abteilung ¹⁶ zu studieren und regionale und altersabhängige Unterschiede in der Wachstumsfaktor induzierte Proliferation NG2 ¹⁷ entdecken. Diese relativ einfache Technik ist allgemein zugänglich, weiter zu untersuchen Zelle intrinsischen und / oder Umweltregulierungsmechanismen die Physiologie dieser Gliazellen und ihre Reaktion auf die neuronale Aktivität oder Myelinschäden.

HINWEIS: Alle Tierverfahren werden nach den Richtlinien und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Universität von Connecticut genehmigt worden.

HINWEIS: Für diese Experimente konstitutive NG2cre ¹⁸ (JAX # 008533) und induzierbare NG2creER ¹⁶ (JAX # 008538) transgenen Mäusen gekreuzt, um Z / EG ¹⁹ (JAX # 003920) oder gtRosa26: YFP Reporter ²⁰ (JAX # 006148) Leitungen, die jeweils verwendet wurden Bild zu NG2 Zellen und deren Nachkommen. Um das Bild zu reifen Oligodendrozyten wurden PLPDsRed transgenen Mäusen ²¹ verwendet. Für eine konsistente Überlebens, können Scheiben von Mäusen bis zu postnatalen Tag 10 sowohl aus dem Vorderhirn und Kleinhirn isoliert werden.

1. Scheibe Vorbereitung

1. In einer Kultur, Haube, legen Gewebekulturplatten in sechs Well-Platten und 1 ml Scheibe Kulturmedium (Rezept in Reagenzien Abschnitt). Platzieren Sie die Platten in Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C mit 5% CO ₂ bei mindestens 2 h vor der Sektion.
2. Sterilisieren alle Werkzeuge und Gewebe Chopper mit 70% Ethanol.
3. Blasen Dissektion Puffer (Rezept Reagenzien Schnitt) mit 95% O _2, 5% CO ₂ auf Eis für mindestens 15 Minuten vor dem Beginn der Präparation.
4. Betäuben Maus Welpen, indem sie auf Eis für 5-10 min nach anerkannten Tier Protokolle. Ermitteln Sie die geeignete Narkosetiefe durch die Bestätigung, dass die Mäuse nicht bis zum Schwanz und Zehen Kneifen reagieren.
5. Enthaupten Tiere mit einer scharfen Schere folgenden Tier Protokolle. Entfernen Sie schnell den Schädel über dem Vorderhirn und Kleinhirn, indem zuerst eine sagittale Schnitt, gefolgt von seitlichen Schnitt, mit sterilisierten Werkzeugen. Geschnitten Hirnnerven von der ventralen Oberfläche des Gehirns und des Kleinhirns durch vorsichtiges Aufrollen des Gewebes an der Seite.
6. Zeigen Gewebe in einem sterilen 35 mm Schale mit eiskaltem sauerstoffhaltigen Dissektion Puffer.
7. Mit einer Rasierklinge, trennen das Kleinhirn und Vorderhirn. Dann machen Sie eine Mitte-Sagittalschnitt through das Vorderhirn und Kleinhirn, die Trennung der Hemisphären.
8. Schneiden Sie 300 um dicke koronale und sagittale Abschnitte des Vorderhirns und des Kleinhirns mit einem manuellen Gewebe Chopper. HINWEIS: Ein Handbuch Gewebe Chopper ermöglicht die schnelle Verarbeitung von Präparation zu Kultur Inkubation ohne die Notwendigkeit für Agarose-Einbettung. Ein Vibratom kann auch eingesetzt werden, wie zuvor ⁹ beschrieben.
9. Übertragen getrennt Scheiben in frisch sprudelte kalte Dissektion Puffer auf Eis.
10. Verwenden Sie kleine Sezieren oder einem Gewicht von Spachteln, einzelne Teile zu trennen und sie auf sechs und Gerichte mit Kultureinsätze vorinkubiert.
11. Überschüssiges Dissektion Puffer von der Oberfläche des Kultureinsatz mit einer Einwegübertragungspipette oder eine P 200 Pipettenspitze. Zwei bis drei Vorderhirn oder drei Kleinhirnscheiben können auf einem Kultureinsatz platziert werden.
    HINWEIS: Für die konsistente Ergebnisse mit Vorderhirn Kulturen, ist es ideal, um Scheiben nehmen überspannt den vorderen Drittel des Corpus callosum(1A), um die beiden grauen und weißen Substanz Regionen in der gleichen Schicht zu untersuchen. Jedes Tier erhält man in der Regel 6 Scheiben Vorderhirn und Kleinhirn 6 Scheiben schneiden.
12. Legen Sie die sechs Well-Platten im Brutschrank und mit 1 ml Medium Scheibe 1 Tag nach Schnittpräparat und dann jeden zweiten Tag, bis Scheibe Fixierung ersetzen Sie die Scheibe Medium.
13. Je nach Experiment, verwenden Scheiben nach 5-7 Tagen in Kultur. Verwenden Sie nur Scheiben, die transparent nach den ersten paar Tagen geworden, und entsorgen Sie die, die unebenen opaken Bereichen haben. HINWEIS: Opaque Regionen innerhalb Scheiben sind mit dem Auge sichtbar und erscheinen als ein Klumpen von dunklen Zellen unter Phasenkontrast. Nachdem die Technik bewältigt wurde, auftreten tot undurchsichtigen Scheiben selten, in weniger als 1-5% der Scheiben.

2. Time-Lapse-Imaging von NG2 Zellteilung und Differenzierung der Oligodendrozyten

HINWEIS: Um Zeitraffer Bildgebung von NG2 Zellproliferation und Differenzierung führen wir verwenden NG2cre: ZEG-Mäusen ¹⁶die EGFP exprimieren in NG2 Zellen und deren Nachkommen (1C-E). Reporterexpression in dieser Zeile ist ausreichend robust, um Live-Bilder der GFP +-Zellen in Scheiben unmittelbar nach Schneiden für einen Zeitraum von mindestens vier Wochen erhalten. Die deutlichsten Bilder werden nach der ersten Durchforstung Zeit der Scheibe, die sich in den ersten 3-5 Tagen in Kultur anfällt.

1. Während des Experiments halten die Scheiben in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C, und entfernen Sie nur für kurze Zeit (weniger als 15 min pro Scheibe), halten den Deckel auf die sechs Well-Platte, während Bildgebung.
2. Mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einer Digitalkamera ausgerüstet ist, zu erfassen Bilder von dem ersten Zeitpunkt mit einem 10X-Objektiv. HINWEIS: Zum ersten Mal Punkte werden durch das Experiment variieren und können den Tag, wenn die Scheiben hergestellt wurden oder einen Zeitpunkt nach sein.
3. Machen Sie Bilder von mehreren Regionen zum Zeitpunkt einer in beiden grauen und weißen Substanz Bereiche der Scheibe. Hinweis the Region durch spezifische Sehenswürdigkeiten innerhalb der Scheibe und durch die Abbildung die Lage des Bildes auf einem Schema, das für nachfolgende Imaging-Sitzungen verwendet werden können, abgebildet. Nützlich Sehenswürdigkeiten können Kanten der Scheiben und / oder Orientierung von der weißen Substanz enthalten. Bild vier Minuten vor acht Stellen auf jeder Scheibe zu jedem Zeitpunkt.
4. Erfassung nachfolgender Bilder in einem Intervall von 4-6 Stunden, wenn die Prüfung NG2 Zellteilung und Differenzierung Oligodendrozyten, idealerweise über 5-7 Tage.
5. Nehmen Sie ein endgültiges Bild von allen Regionen und fixieren die Scheiben sofort. 1 ml der Fixierlösung (4% PFA mit 0,1 M L-Lysin 0,01 M Natriummetaperiodat), um den Boden des Kultureinsatz, dann fügen Sie eine weitere 1 ml oben auf den Scheiben. Achten Sie darauf, die direkt auf dem Fixiermittel Scheibe spritzen, wie es aus der Membran zu lösen. Befestigen Sie das Gewebe für 30 Minuten und fahren Sie mit der Immunhistochemie mit Entwicklungsstadium spezifische Marker, wie in Kapitel 4 beschrieben.
6. Wasch Scheiben mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer 3 x 10 m. Wenn nötig, speichern Scheiben bei 4 ° C in 0,2 M Natriumphosphat-Puffer für 1-3 Tage vor Immunfärbung durchzuführen, sondern im Idealfall innerhalb von 24 Stunden. Fahren Sie mit der Immunhistochemie, wie unten in Abschnitt 4 beschrieben, den Anteil der Zellen, die in Oligodendrozyten (2D-F) differenziert sind, zu bestimmen.

3. Fate Mapping von NG2 Zelle Nachkommen Mit induzierbare Reporter transgenen Mäusen in Schnittkulturen

HINWEIS: Um das Schicksal von NG2 Zellen aus einem bestimmten Zeitpunkt in der Kultur zu verfolgen, induzierbare NG2creER: kann YFP transgenen Mäusen verwendet werden.

1. Cre die Rekombination zu induzieren und Reporter-Expression durch Zugabe von 100 nM 4OHT in Ethanol zu dem Kulturmedium gelöst. HINWEIS: Reporter-positiven Zellen sollte innerhalb von 1-2 Tagen bei einem Induktionseffizienz von ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 +-Zellen und zu diesem Zeitpunkt erscheinen alle Zellen an der NG2-Zell-Stadium (Abbildung 2a-c)
2. Fix und waschen Sie die Scheibeen zu verschiedenen Zeitpunkten nach unterschiedlichen Manipulationen (in den Abschnitten 2.5 und 2.6 beschrieben).

4. Scheibe Immunhistochemie

1. Schneiden Sie die Membranen mit den Scheiben aus den Einsätzen mit einem Skalpell angebracht.
2. Übertragen Scheiben auf einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte, die Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einem Satz von Pinzetten, kümmert sich nicht um die Zusammensetzung der Scheibe stören bei der Abholung der Membran.
3. Transfer der Scheiben zu einer Platte mit 24 Vertiefungen mit Blockierungslösung, die 5% normales Ziegenserum (NGS) und 0,1% Triton-X100 in PBS für 1 Stunde.
4. Die Scheiben in primären Antikörper inkubieren O / N in 5% NGS in PBS bei 4 ° C ist. Zur Identifizierung von Zellen in der Zellstadium NG2, verwenden Sie Antikörper gegen NG2 und PDGFRα. Zur Identifizierung von differenzierten Oligodendrozyten, verwenden Sie ein Antikörpers an die adenomatöse Polyposis coli-Antigen (APC; Klon CC1).
5. Am zweiten Tag waschen Scheiben in PBS 3 x15 min, dann im Sekundär Antibo inkubierenstirbt in 5% NGS in PBS für 1 h bei RT. Scheiben waschen in PBS 3 x15 min und montieren auf Folien. Halterung mit Scheiben und Membran mit Blick auf den Objektträger, so dass die Membran nicht zwischen dem Ziel und dem Gewebe sein.

Beispiele für repräsentative Daten sind unten angegeben, die mit Schnittkulturen sowohl aus dem Vorderhirn und Kleinhirn der P8 NG2cre erhalten worden sind: ZEG, NG2creER: YFP und PLPDsRed transgenen Mauslinien. NG2 Zellen über Tage in Vorderhirn und Kleinhirn Scheiben (1B-D, Video 1) und der Phänotyp dieser Zellen abgebildet werden kann, nach der Fixierung bestimmt und Immunfärbung mit NG2 und CC1 Antikörper (1E). Neben der Echtzeit-Bildgebung kann die Zellproliferation auch mit immunhistochemischen Färbung für die Zellproliferationsmarker wie Ki67 (1F) beurteilt werden. Diese Daten ermöglichen eine detaillierte Analyse der zeitlichen Dynamik der Oligodendrozyten-Differenzierung nach NG2 Zellteilung auf Einzelzellbasis. YFP Mäusen (Abbildung 2): Schicksal Kartierung NG2 Zellen kann nach Induktion der Cre Rekombination in Scheiben mit 4OHT in NG2creER geführt werden. YFP-exprimierenden Reporter NG2 +-Zellen waren found in den Kulturen zwei Tage nach Zugabe von 4OHT zu dem Kulturmedium (2A). Sechs Tage nach 4OHT Induktion war ein Teil der YFP + Zellen in CC1 + Oligodendrozyten (2B) unterscheiden. Diese Daten zeigen die Machbarkeit des Durchführens Schicksal Kartierung NG2 Zellen in Scheiben, wo die extrazelluläre Umgebung können manipuliert werden, um die Wirkungen von pharmakologischen Mitteln oder verschiedenen Beleidigungen über das Schicksal NG2-Zellen zu testen. Unterschiedliche Konzentrationen von 4OHT können verschiedene Grade der Cre Rekombination zu erreichen. Zum Beispiel, die Exposition gegen 100 nM 4OHT für 2 Tage verursacht Reporterexpression in ca. 20-25% aller NG2-exprimierenden Zellen, während 1 uM 4OHT führt zu etwa 60-70% Rekombination Effizienz. Schließlich ist umfang Myelin in diesen Kulturen vorhanden und myelinisierenden Oligodendrozyten in lebenden und fixierten Scheiben mit PLPDsRed transgenen Mäusen (3, Video 2) abgebildet werden.

Abbildung 1. Scheibe Kulturverfahren für langfristige Darstellung von NG2 Zellproliferation und Differenzierung (AB) Schematische Darstellung der Isolierung von Vorderhirn und Kleinhirn Scheiben (A) und anschließender Kultivierung und Zeitraffer-Bildgebung mit Schnittkultur-Einsätze (B). (C ) Darstellung NG2 Zellteilung und die anschließende Oligodendrozyten-Differenzierung umreißt in NG2cre:. ZEG transgenen Mäusen (D) Beispiel Bilder von kortikalen Regionen NG2cre erworben: ZEG-Mäusen, die einen einzelnen GFP + Zellen (Pfeile) Aufteilen zweimal über einen Zeitraum von 122 Stunden, die Zeit dargestellt in der oberen rechten Ecke, wie Stunden nach dem Beginn des Bilderzeugungsexperiment. (E) Fixierung und Immunfärbung mit Anti-NG2 und CC1 Antikörper der gleichen Schicht offenbart, dass das bebilderte DiViDing Zellen führte zu drei NG2 +-Zellen (Pfeile). (F) Beispiel Bild zeigt zwei Ki67 + NG2 +-Zellen in einer kortikalen Schnittkultur. (G) Bild Beispiel zeigt NG2 +-Zellen (Pfeilspitzen) und die Prozesse mit NeuN + neuronalen Kernen in einer kortikalen verflochten Schnittkultur. Maßstabsbalken 25 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Die Induktion von YFP-Expression um das Schicksal von NG2 Zellen in Vorderhirn Schnittkulturen (AB) Bilder des Corpus callosum Region Vorderhirn Schnittkulturen von NG2creER genommen zu verfolgen: YFP Mäusen mit 4OHT für 24 Stunden für 2 behandelt und dann in Kultur hinterlassen Tage (A) oder 6 Tage (B) (A) oder CC1 und YFP (B) zeigt die Differenzierung der Reporter positive NG2 Zellen zu Oligodendrozyten, während in der Kultur 6 Tage nach Cre Rekombination (Pfeil) immungefärbt. Maßstabsbalken 25 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Imaging Oligodendrozyten in Schnittkulturen von PLPDsRed transgenen Mäusen. (A) Schematische Darstellung der Isolation, Kultivierung und Bildgebung von Kleinhirn Scheiben von PLPDsRed transgenen Mäusen. (B) Bild von einer festen Kleinhirn Scheibe nach 5 Tagen in vitro zeigt Calbindin + genommen ( cyan) Purkinje-Nervenzellen mit markhaltigenMyelin-Basisprotein + (MBP) (grün) Axone in der weißen Substanz Regionen der Scheibe vorstehen. Maßstabsbalken 25 um. (C) geringer Vergrößerung Bilder aus der gleichen Region in den in Stunden in Kleinhirn Schnittkulturen von Mäusen PLPDsRed angegebenen Zeiten eingefangen jeden zweiten Tag. Skala Bar 100 um. (D) geringer Vergrößerung Bild von einer festen Scheibe PLPDsRed Kultur, die MBP-Expression in der weißen Substanz Regionen, in denen DsRed + Zellen konzentriert getroffen werden. Skala Bar 100 um. (E) Hohe Vergrößerung Bild von einem festen PLPDsRed Schnittkultur single DsRed + Oligodendrozyten mit MBP + Prozesse übernommen. Maßstabsbalken 20 um. (F) Zeitraffer-Sequenz aus einem PLPDsRed Kleinhirn Scheibe getroffen, die relativ stabile Zellkörper über die 48 Stunden Imaging-Sitzung, in der oberen rechten Zeit in Stunden angezeigt. Maßstabsbalken 25 um. Plädoyerse klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Video 1. Live-Imaging von NG2 Zellteilung in einer kortikalen Schnittkultur Vertreter Zeitraffer-Sequenz zeigt mehrere Zellteilungen in einer kortikalen Schnittkultur von einem NG2cre wurde:. ZEG transgenen Maus. Video angezeigt zu 5 Bildern pro Sekunde, Montage von Bildern in Abbildung 1 dargestellt. (Siehe "Video_1.mov" unter Downloads)

Video 2. Live-Imaging von Oligodendrozyten in Kleinhirn Schnittkulturen Vertreter Zeitraffer-Sequenz, welche kleine Änderungen in der Oligodendrozyten-Morphologie (Pfeil) über 48 h in einem Kleinhirn Scheibe aus einem transgenen Maus PLPDsRed genommen abgebildet. Video bei der 3 Bilder pro Sekunde, Montage von Bildern in Abbildung 3 dargestellt. (Siehe "Video_2.mov" unter Downloads)

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