Verbesserte In-Gel-reduktive β-Elimination für umfassende O-gebundene und Sulfo-Glykomik durch Massenspektrometrie

Zusammenfassung

Um die Vielfalt von O-verknüpften Glykanen umfassend zu erforschen, wird ein neues Verfahren zur reduktiven In-Gel-β-Eliminierung, kombiniert mit Permethylierung und einer schnellen Phasenteilungsmethode, auf die Analyse von O-verknüpften Glykanen angewendet, die direkt von Glykoproteinen freigesetzt werden, die durch SDS-PAGE aufgelöst wurden und für eine anschließende glykomische Analyse mittels Massenspektrometrie zugänglich sind.

Zusammenfassung

Die Trennung von Proteinen durch SDS-PAGE gefolgt von einem proteolytischen In-Gel-Verdau aufgelöster Proteinbanden hat zu einer hochauflösenden proteomischen Analyse biologischer Proben geführt. Ähnliche Ansätze, die eine eingehende Analyse der Glykane ermöglichen würden, die von Glykoproteinen getragen werden, die durch SDS-PAGE aufgelöst werden, erfordern besondere Überlegungen, um die Wiederfindung und Sensitivität bei der Verwendung der Massenspektrometrie (MS) als Nachweismethode zu maximieren. Eine große Hürde, die es zu überwinden gilt, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten, ist die Entfernung von aus Gel gewonnenen Verunreinigungen, die die MS-Analyse beeinträchtigen. Der hier vorgestellte Probenablauf ist robust, effizient und macht eine Inline-HPLC-Reinigung vor der MS überflüssig. Gelstücke, die Zielproteine enthalten, werden in Acetonitril, Wasser und Ethylacetat gewaschen, um Verunreinigungen, einschließlich polymerer Acrylamidfragmente, zu entfernen. O-verknüpfte Glykane werden durch reduktive β-Elimination im Gel aus den Zielproteinen freigesetzt und durch robuste, einfache Reinigungsverfahren zurückgewonnen. Ein Vorteil dieses Workflows besteht darin, dass er die Empfindlichkeit für den Nachweis und die Charakterisierung sulfatierter Glykane verbessert. Diese Verfahren ermöglichen eine effiziente Trennung von sulfatierten permethylierten Glykanen von nicht-sulfatierten (sialylierten und neutralen) permethylierten Glykanen durch eine schnelle Phasenteilung vor der MS-Analyse und verbessern dadurch die glykomische und sulfoglykomische Analyse von Glykoproteinen, die durch SDS-PAGE aufgelöst werden.

Einleitung

Glykosylierung ist eine wesentliche Protein posttranslationale Modifikation, einen Beitrag zu organismal Physiologie, Gewebepathologie und zelluläre Erkennungs ^1-3. Trotz großer Fortschritte in der analytischen Glycoscience, Charakterisierung der komplette Vielfalt der Glykane auf ein spezifisches Protein bleibt eine äußerst schwierige Aufgabe, vor allem auf Proteine ​​aus primären biologischen Quellen isoliert. Dennoch ist die Mikroheterogenität von Glycoprotein Glykane betrifft häufig funktionelle Wechselwirkungen mit anderen Proteinen. Daher ist die Charakterisierung von Glykan Vielfalt für das Verständnis der physiologischen Bedeutung der Zell- und Gew....

Protokoll

HINWEIS: Lab Sicherheitsbedenken

Im Einklang mit Standard-Labor Best Practices, beachten Sie Folgendes. Bewahren Sie alle organischen Lösemittel in geeigneten Standorten. Bewahren Sie alle Abfallstoffe in der chemischen Abfallbehälter mit klarer Kennzeichnung von chemischen Zusammensetzungen. Da mehrere Reagenzien in diesen Protokollen sind potenziell karzinogen oder erzeugen flüchtige brennbare Gase, behandeln alle Reagenzien in einer Abzugshaube mit Belüftung. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe, Kittel und Schutzbrille beim Arbeiten mit organischen Lösungsmitteln.

Ergebnisse

Effect Ethylacetat Behandlung Vor In-Gel-reduktive β-Elimination

Ein repräsentatives Massenspektrum permethylierter O-gebundene Glycan Proben von Rinder Mucin Verwendung im Gel reduktive β-Eliminierung freigesetzt wird in 3 gezeigt. Die EtOAc-Wasch der Gelstücke SDS Polyacrylamid und Verunreinigungen, mit anschließender MS-Analyse ²⁷ stören effektiv entfernt.

Diskussion

Die Kombination von reduktiver β-Eliminierung im Gel mit wässrig-organischer Extraktion verbessert die Sensitivität und Tiefe der strukturellen Daten, die für die Charakterisierung von sulfatierten und nicht-sulfatierten O-verknüpften Glykanen gewonnen werden können, die aus kleinen Mengen von Mucin-Glykoproteinen gewonnen wurden, die durch SDS-PAGE von anderen Proteinen aufgelöst wurden. Die wesentlichen Fortschritte der in dieser Studie vorgestellten technischen Ansätze sind: (a) einfache Entfernung von aus Gel gewonne.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Wasser, entionisiertes Wasser	Sigma-Aldbsp;	270733-4L	CHROMASOLV, für HPLC
Essigsäure, Glacial	Fisher	A38-500	zertifiziert ACS ≥ 99,7 Gew.-%
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-4L-R	CHROMASOLV, für HPLC, ≥ 99,9%
Ammoniumbicarbonat	Fluka	09830-500G	BioUltra, ≥ 99,5 % (T), Stufe 1
Acetonitril	Sigma-Aldbsp;	34998-4L	CHROMASOLV Plus, für HPLC, ≥ 99,9%, Schritt 1
Ethylacetat	Fluka	34972-1L-R	LC-MS CHROMASOLV, Schritt 1
Natriumborhydrid	Aldrich	213462-25G	ReagenzPlus, 99%, Schritt 2
Jodmethan	Sigma-Aldrich	289566-100G	ReagentPlus, 99,5%,  Schritt 6.  Bei 4 Grad lagern; C bis zur Verwendung.  Vor Gebrauch bei Raumtemperatur hinsetzen.
Natronlauge, 50 % w/w	Fisher	SS254-1	zertifiziert, Stufe 6
Dimethylsulfoxid, wasserfrei	Sigma-Aldrich	276855-1L	wasserfrei, ≥ 99,9%, Stufe 6
Methanol, wasserfreies	Sigma-Aldbsp;	322415-100ML	wasserfrei, 99,8%, Stufe 6
Dichlormethan	Sigma-Aldrich	34856-4L	CHROMASOL®, für HPLC, ≥ 99,8%, enthält Amylen als Stabilisator, Stufe 7
Dowex 50WX8 WasserstoffformWasserstoff Form 100-200  Netz	Sigma-Aldrich	217506-500G	Step 3
AG 50W-X8 Harz	Bio-Rad	142-1441	Step 3
BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Festphasen-Extraktionssäule, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase	JT Baker	JT-7020-01	Step 5 und 8
7,5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Bio-Rad		Step 1
Bio-Safe Coomassie Beize	Bio-Rad	161-0786	G-250, Schritt 1
Silberflecken-Kit für die Massenspektrometrie	Pierce	24600	Schritt 1
Oligosaccharide Kit (Maltotriose, Dp3: R474140)	Supelco	47265
Oligosaccharide Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135)	Supelco	47265
Einweg-Pasteurpipetten, Glas, kurze Spitze	VWR	14673-010	Vor Gebrauch waschen
PYREX 13 x 100 mm Einweg-Kulturröhrchen mit rundem Boden	Corning	99447-13	Vor Gebrauch waschen
PYREX 16 x 125 mm Einweg-Kulturröhrchen mit rundem Boden und Gewinde	Corning	99447-16	Vor Gebrauch waschen
Phenolkappen/-verschlüsse mit PTFE-beschichteter Gummiauskleidung	Kimble	45066C-13	Vor Gebrauch waschen
Phenolkappen/-verschlüsse mit PTFE-beschichteter Gummiauskleidung	Kimble	45066C-15	Vor Gebrauch waschen
Hamilton HPLC-Spritze	HAMILTON	81265	Volumen 500  μ l, Nadelstärke 22 G
Hamilton HPLC-Spritze	HAMILTON	81165	Volumen 250  μ l, Nadelstärke 22 G
Hamilton HPLC-Spritze	HAMILTON	81065	Volumen 100  μ l, Nadelstärke 22s G
Hamilton HPLC-Spritze	HAMILTON	80965	Volumen 50  μ l, Nadelstärke 22s G
Hamilton Kalibrierte Spritzen	HAMILTON	80300	Volumen 10  μ l, Nadelstärke 26s G
Petrischalenglas 100 mm x 15mm	GSC INTERNATIONAL INC	1500-4	Vor Gebrauch waschen, Schritt 1
Bard-Parker Chirurgische Klingen	Fisher	371310	Schritt 1
Reacti-Therm Heiz-/Rührmodul	Pierce	18870	Schritt 1, 4 und 7
	Fisher	125D	Schritt 2
Pyrex Faser Glaswolle Borosilikat-Porengröße 8  μ m	Aldrich	CLS3950	Schritt 3
QuarzglasschneiderSchlauchschneider	alltech	3194	Schritt 3
Mehrrohr-Vortexer	VWR	444-7063	Schritt 6
Gefriertrockner 25EL Freezemobile	Virtis	25EL
Zentrifuge	VWR	Clinical 50
LTQ Orbitrap Discovery	Thermo Fisher Scientific