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Methodenartikel

Verbesserte In-Gel-reduktive β-Elimination für umfassende O-gebundene und Sulfo-Glykomik durch Massenspektrometrie

11K Aufrufe

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DOI:

10.3791/51840

⸱

20. November 2014

 ,  ,  ,  , 
1Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 3Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um die Vielfalt von O-verknüpften Glykanen umfassend zu erforschen, wird ein neues Verfahren zur reduktiven In-Gel-β-Eliminierung, kombiniert mit Permethylierung und einer schnellen Phasenteilungsmethode, auf die Analyse von O-verknüpften Glykanen angewendet, die direkt von Glykoproteinen freigesetzt werden, die durch SDS-PAGE aufgelöst wurden und für eine anschließende glykomische Analyse mittels Massenspektrometrie zugänglich sind.

Zusammenfassung

Die Trennung von Proteinen durch SDS-PAGE gefolgt von einem proteolytischen In-Gel-Verdau aufgelöster Proteinbanden hat zu einer hochauflösenden proteomischen Analyse biologischer Proben geführt. Ähnliche Ansätze, die eine eingehende Analyse der Glykane ermöglichen würden, die von Glykoproteinen getragen werden, die durch SDS-PAGE aufgelöst werden, erfordern besondere Überlegungen, um die Wiederfindung und Sensitivität bei der Verwendung der Massenspektrometrie (MS) als Nachweismethode zu maximieren. Eine große Hürde, die es zu überwinden gilt, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten, ist die Entfernung von aus Gel gewonnenen Verunreinigungen, die die MS-Analyse beeinträchtigen. Der hier vorgestellte Probenablauf ist robust, effizient und macht eine Inline-HPLC-Reinigung vor der MS überflüssig. Gelstücke, die Zielproteine enthalten, werden in Acetonitril, Wasser und Ethylacetat gewaschen, um Verunreinigungen, einschließlich polymerer Acrylamidfragmente, zu entfernen. O-verknüpfte Glykane werden durch reduktive β-Elimination im Gel aus den Zielproteinen freigesetzt und durch robuste, einfache Reinigungsverfahren zurückgewonnen. Ein Vorteil dieses Workflows besteht darin, dass er die Empfindlichkeit für den Nachweis und die Charakterisierung sulfatierter Glykane verbessert. Diese Verfahren ermöglichen eine effiziente Trennung von sulfatierten permethylierten Glykanen von nicht-sulfatierten (sialylierten und neutralen) permethylierten Glykanen durch eine schnelle Phasenteilung vor der MS-Analyse und verbessern dadurch die glykomische und sulfoglykomische Analyse von Glykoproteinen, die durch SDS-PAGE aufgelöst werden.

Einleitung

Glykosylierung ist eine wesentliche Protein posttranslationale Modifikation, einen Beitrag zu organismal Physiologie, Gewebepathologie und zelluläre Erkennungs 1-3. Trotz großer Fortschritte in der analytischen Glycoscience, Charakterisierung der komplette Vielfalt der Glykane auf ein spezifisches Protein bleibt eine äußerst schwierige Aufgabe, vor allem auf Proteine ​​aus primären biologischen Quellen isoliert. Dennoch ist die Mikroheterogenität von Glycoprotein Glykane betrifft häufig funktionelle Wechselwirkungen mit anderen Proteinen. Daher ist die Charakterisierung von Glykan Vielfalt für das Verständnis der physiologischen Bedeutung der Zell- und Gewebe Glykosylierung 4,5. Um den Beitrag der Glykoprotein Glykosylierung an Gewebe Physiologie und Pathophysiologie, robust, sensibel, und umfassende glycomic Analysetechniken verstehen immer wichtiger geworden. In Proteomanalyse werden Proteinidentifikationen im Allgemeinen durch LC-MS erreicht/ MS-Analyse der tryptischen Peptide 6. Proteinverdauung kann mit einem gereinigten Protein oder Proteine ​​durch SDS-PAGE aufgelöst folgenden in-Gel-Verdau mit Proteasen, wie Trypsin 7-9 durchgeführt werden. Voranreicherung des Proteingemisches durch SDS-PAGE erhöht die Tiefe und die Genauigkeit der Protein ID. Die Entwicklung analoger Strategien für glycomic Analyse Glykoprotein Glykosylierung liegt an der Spitze der Glycoscience.

Die zwei Hauptklassen von Glycanen auf Proteingerüste entweder durch N-Bindung oder O-Verknüpfung gebunden ist. N-verknüpfte Glykane an Asparagin gebunden (Asn) -Reste als Teil einer Sequon definiert als Asn-X-Ser / Thr / Cys gefunden (X ist eine beliebige Aminosäure außer Prolin), und kann durch enzymatischen Verdau mit Peptid-N veröffentlicht -glycanase (PNGaseF oder A), entweder in Lösung, in-Gel oder auf dem Blot 10-12. O-Glycane werden hauptsächlich zu Serin (Ser) oder Threonin (Thr) Reste gebunden. Jedoch nur ein Enzym ist idenziert, die fähig sind zum Frei O-verknüpften Glykanen von Glykoprotein, und es hat eine extrem begrenzte Glykan Spezifität Lösen nur die einfachsten O-verknüpften Glykanen. Chemische Freigabestrategien bleiben die Methode der Wahl für die umfassende Veröffentlichung von O-verknüpften Glykane von Glykoproteinen. Reduzierenden oder nicht-reduzierenden β-Eliminierung oder Hydrazinolyse gut charakterisiert sind chemische Trenntechniken und sind derzeit die am häufigsten verwendeten Ansätze zum Lösen O-verknüpften Glykanen von Glykoproteinen 13,14. Obwohl die reduktive β-Eliminierung wurde verwendet, um O-verknüpften Glykanen von Glykoproteinen durch SDS-PAGE getrennt lösen, benötigt früheren Ansätzen HPLC-Trennung für die anschließende Analyse 15-17.

Mehrdimensionale MS (MS n) Analyse liefert derzeit die reichste Quelle von Strukturdaten zur Charakterisierung Glykane von Glykoproteinen isoliert in den von den meisten biologischen Quellen erwarteten Mengen freigesetzt. Die Tiefe der MS-basierte strukturelle Charakterisierung wird stark durch permethylating die frei Glykane vor ihrer Analyse erleichtert. Permethylierung verbessert Ionisation und neigt dazu, molare Signalantworten in einem breiten Spektrum von Glykanstrukturen 18,19 auszugleichen. Darüber hinaus Permethylierung eindeutig Tags Terminal und substituierte Monosaccharideinheiten mit unverwechselbaren Massen, wodurch Strukturaufklärung 20-23. Beispielsweise sind saure Glykane im allgemeinen schwierig, nicht-permethyliertes Arten von MS zu erfassen. Obwohl saure Glycane können in negativen Ionenmodus durch MS nachgewiesen werden kann, ist es unmöglich, beide sauren und neutralen Glykanen in der gleichen Ionenmodus zu detektieren. Ein Hauptvorteil der Glycan Permethylierung ist, dass alle freien Hydroxylgruppen (OH) an Monosaccharid Substituenten ein Glykan mit einer Methylgruppe (OCH 3 oder OMe), wodurch eine sialylierte Glycane der Ladungen neutralisiert werden verschlossen werden, so dass sie als detektierbare als permethyliertem neutral (asialo) Glykane. Jedoch sind die Hydroxylgruppen des Sulfateinheiten auf sulfoglycans beständig Permethylierung, was Retention anionischer Ladung, die Ionisation unterdrückt und die Empfindlichkeit verringert. Diese Unterdrückung verhindert derzeit umfangreiche glycomic Analyse von sehr komplexen Glykoproteine ​​wie Mucinen, die eine hohe Häufigkeit von sulfatierten Glycanen 24-26 tragen.

Jüngste Berichte über Reinigungs sulfatierte Glykane Verwendung geladen, Reverse-Phase-Chromatographie zu reinigen und zu separaten permethylierten Glykane vor MALDI-Analyse. Dieses Verfahren beruht auf der vollständigen Trennung von sulfatierten und nicht-sulfatierten Glycanen mit verschiedenen mobilen Phasen zur Elution, die wir gefunden haben, die weniger streng als organische Phasentrennung zu sein. Daher sind neue Methoden zur Detektion und Anreicherung sulfoglycans hier vorgestellt. Diese Techniken erlauben die quantitative Rückgewinnung von sulfatierter Glycane in der wässrigen Phase nach der Wasser: DCM (Dichlormethan)Extraktion, die regelmäßig am Ende des Glycan Permethylierung Reaktionen 27 durchgeführt wird. Wichtig ist, dass diese robuste Trennung von permethyliertes sulfoglycans aus einer Mischung von permethyliertes nicht-sulfatierte Glykane gleichzeitig bereichert für geladene Spezies gleichzeitig vereinfacht MS2 Fragmentierungsmuster. Eine umfassende Protokoll für verbesserte in-Gel-O-gebundene Glycan-Analyse wird ebenfalls vorgestellt. Das verbesserte Protokoll verbessert glycan Recovery, erhöht die strukturelle Informationen erhältlich durch MS n Analyse permethyliertes Glykane und verbessert die Empfindlichkeit um wesentliche Glykoproteine ​​aus biologischen Quellen isoliert angewendet sulfoglycomic Analysen.

Dieses Protokoll wird für O-gebundene Glycan Analyse ganzer Glykoprotein Extrakte oder eines bestimmten Glykoproteins von Interesse durch SDS-PAGE bestimmt, und ist aus drei Versuchsverfahren besteht; A) Gel-clean-up, B) In-Gel reduktive β-Eliminierung und C) Glycan permethynung. Das Ziel ist es, umfassende O-verknüpften glycomic Daten für Glykoproteine ​​aus Primärquellen von biologischem Interesse (Abbildung 1) geerntet erhalten. Glycoproteine ​​durch SDS-PAGE getrennt werden durch Färben und interessante Banden werden herausgeschnitten und das resultierende Gel Band wird in kleine Stücke geschnitten visualisiert. Die Gelstücke werden entfärbt und Ethylacetat Waschungen unterworfen, um Verunreinigungen Gel (2A) zu entfernen. Glycan Freisetzung wird durch In-Gel reduktive β-Eliminierung (2B) erreicht, und die Freigabe Glycane permethyliert werden. Wässrig-organischen Extraktions folgenden Permethylierung quantitativ Partitionen Die anionische sulfatierte Glykane vom nicht-sulfatierten neutrale Glykane (2C). In-Gel reduktive β-Eliminierung zu wässrig-organischen Extraktions gekoppelt ermöglicht die Charakterisierung von O-verknüpften Glykanen und sulfoglycans von kleinen Mengen von Glykoprotein durch SDS-PAGE getrennt freigegeben. Die strategischen Überblick ist summarized in Figur 1 und die Einzelheiten sind in Figur 2 gezeigt. Zusätzlich kann ein Teil der entfärbt und gewaschen Gelstücke Protein ID durch Standard LC-MS / MS Proteomiktechniken verwendet werden.

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Protokoll

HINWEIS: Lab Sicherheitsbedenken

Im Einklang mit Standard-Labor Best Practices, beachten Sie Folgendes. Bewahren Sie alle organischen Lösemittel in geeigneten Standorten. Bewahren Sie alle Abfallstoffe in der chemischen Abfallbehälter mit klarer Kennzeichnung von chemischen Zusammensetzungen. Da mehrere Reagenzien in diesen Protokollen sind potenziell karzinogen oder erzeugen flüchtige brennbare Gase, behandeln alle Reagenzien in einer Abzugshaube mit Belüftung. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe, Kittel und Schutzbrille beim Arbeiten mit organischen Lösungsmitteln.

figure-protocol-1
Abbildung 1. Verfahren zur In-Gel-O-Glykomik. (A) Die Proteine ​​von Interesse werden durch SDS-PAGE aufgetrennt, durch entsprechende Färbeverfahren (Coomassie oder Silber) erfaßt und ausgeschnitten. Ausgeschnitten Gelstücke werden in Scheiben geschnittenin kleine Würfel, entfärbt und mit Ethylacetat gewaschen, um Verunreinigungen, mit anschließender MS Analyse stören reduzieren. Ein Teil des Gels Scheibe für in-Gel-Trypsin-Verdauung und anschließende proteomic Charakterisierung mittels LC-MS / MS reserviert werden. (B) O-verknüpften Glykane aus gelöst Glykoproteine ​​durch In-Gel reduktive β-Eliminierung freigesetzt. Wesentliche Schritte sind: Entsalzung und Borat Entfernung durch Azeotrop mit Methanol. (C) O-verknüpften Glykanen durch reduktive β-Eliminierung freigesetzt permethylierten und anschließend in wässrige und organische Phasen aufgetrennt. Sulfoglycans quantitativ in der oberen (wässrigen) Phase gewonnen, während neutrale und sialyliert Glykane Partition in die untere (DCM) Schicht.

figure-protocol-2
Abbildung 2. Ausschnitt Flussdiagramm zum In-Gel Glykomik. Jede experimental in Figur 1 dargestellten Schritt wird einzeln erläutert. (A) Gel Entfärben und EtOAc Extraktion, (B) direkt in-Gel-reduktive β-Eliminierung für O-gebundene Glykan Release, und (C) Permethylierung und Phase-Partition. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Figur zu sehen.

1. Gel Ausschneiden und Entfernen von Gel-abgeleiteten Schadstoffe

  1. Vor dem Start des Verfahrens vorzubereiten Chemikalien und Reagenzien in der Materialliste aufgeführt.
  2. Lösen Proteins auf SDS-PAGE-Gel unter Verwendung von Standard-Tris-Glycin-Puffer-Systeme. Stain trennten Proteine ​​entweder mit Coomassie Brilliant Blue oder Silberfärbung. Im allgemeinen ist die Wiedergewinnung von O-verknüpften Glykanen von silbergefärbten Gelen etwa 80-90% der von Coomassie-gefärbten Gelen erreicht Erholung.
  3. Nach der Elektrophorese, legen Sie das Gel auf einer Glasplatte und der Verbrauch ter Region von Interesse mit einem sauberen Skalpell oder einer Rasierklinge.
  4. Um die Ausbeute der O-Glykane zu erhöhen, das Gel Band von Interesse Übertragung auf ein anderes Glasplatte und schneiden Sie die ausgeschnittenen Gel Stück in ca. 2 mm Würfel schneiden. Vermeiden Sie Gelstückchen kleiner als 1 mm Würfel, weil glycan Erholung verringert. Übertragen die kleine Gelstücke in ein Schraubenglasröhrchen (13 x 100 mm) mit einer Edelstahlmikros.
  5. 1 ml 25 mM Ammoniumbicarbonat (AMBIC, NH 4 HCO 3) in das Probenröhrchen, die Kappe der Glasröhre mit einem Teflon-ausgekleidete Schraubdeckel verschließen und vorsichtig mischen durch Schwenken des Rohres vor dem Stehenlassen für 10 min. Kräftigem Rühren beschäftigen Sie nicht, um zu vermeiden Ripping die Gelstücke.
  6. Entfernen Sie vorsichtig AMBIC aus dem Glasrohr entweder mit einer Pasteur Glaspipette oder einer Pipette mit einem extra langen Kunststoffspitze ausgestattet. Vermeiden Zerschlagung und Übertragen der kleine Gelstücke beim Entfernen der AMBIC Lösung.
  7. 1 ml Acetonitril (ACN), um dasGlasrohr, Kappe, und vorsichtig mischen durch Schwenken Rohr lassen, bevor Ständer für 10 min. Sicherzustellen, dass die Gelstücke werden vollständig mit dem Lösungsmittel bedeckt ist. Falls erforderlich, drücken Gelstückchen off von Rohrwand und in Lösungsmittel mit Pipettenspitze.
  8. Abpipettieren ACN aus dem Glasrohr und wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.7, bis die blaue Farbe wird eliminiert. Wiederholen mindestens fünf aufeinander AMBIC / ACN Wäschen falls erforderlich. Für Silber gefärbten Gelen, verwenden Sie ein destain Kit. Gehen Sie zum nächsten Schritt, wenn das Gel Stück dreht gleichmäßig weiß, während in ACN.
  9. Pipettieren Sie die Flüssigkeit aus dem Glasrohr, rekapitulieren das Rohr, 1 ml AMBIC und lassen Sie stehen für 5 min.
  10. Entfernen AMBIC und mit 2 ml Ethylacetat (EtOAc), um das Glasrohr. Recap Rohr mit Teflon ausgekleideten Deckel und bei 4 ° C über Nacht mit end-over-end Agitation oder alternativ durchführen drei EtOAc Wäschen bei Raumtemperatur für jeweils 30 min. Je länger die EtOAc waschen, desto effizienter ist die Entfernung von Verunreinigungen.
  11. Entfernendie endgültige EtOAc waschen und führen jeweils drei Waschungen mit 2 ml H 2 O. Die vollständige Entfernung der EtOAc wird dafür sorgen, eine robuste reduktive β-Eliminierungsreaktion.
  12. Abpipettieren H 2 O und entwässern das Gel durch einmaliges Waschen mit 1 ml ACN.
    HINWEIS: Nach dem Trocknen werden die dehydratisierten Gels bereit für in-Gel-β-Eliminierung. Dehydratisiert Gelstücke bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
  13. Stoppen Sie den Waschvorgang bei jedem Schritt und die Gelstücke bei 4 ° C lagern über Nacht, unabhängig von der Puffer oder Lösung auf das Gel aufgetragen wird (AMBIC, ACN, H 2 O). Starten Probenvorbereitung jederzeit innerhalb der nächsten 2 Tage.
  14. Verwenden Sie einen Teil der entfärbten und dehydrierte Gelstücke für Protein-ID durch Standardproteomische Ansätze.

2. In-Gel-O-Glykan Freigabe durch reduktive β-Elimination

  1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 M Natronlauge (NaOH) mit 50% NaOH oder NaOH fest und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.
      Nehmen Sie 5,2 ml 50% NaOH (oder 4 g festes NaOH) und stellen Sie die Lautstärke auf 100 ml bis 1 M NaOH-Lösung zu machen. Verdünnt das 1 M NaOH Stammlösung 100 mM NaOH, die bei 4 ° C bis zu 6 Monate ohne Wirkungsverlust in reduktive β-Eliminierungsreaktionen gespeichert werden können.
  • Stellen 2 M Natriumborhydrid (NaBH 4) in 100 mM NaOH. Auflösen von 38 mg NaBH 4 in 0,5 ml von 100 mM NaOH. Im Allgemeinen verwenden 0,5-1,0 ml der Borhydrid-Lösung für jede Probe. Variiert das Volumen der Reaktionslösung auf die Menge des getrockneten Gelstücke in Schritt 1 hergestellt erwarten, 0,5 ml Natriumborhydrid-Lösung für 1-2 geschnitten Gelstücke (Schritt 1,3) zu verwenden.
  • In 500 ul 100 mM NaOH zu den dehydrierten Gelstücke und stehen lassen für 3-5 min auf Eis, um das Gel auf die Grundbedingungen, die Glykan Erholung verbessern Gleichgewicht.
  • In 500 ul 2 M NaBH 4 in 100 mM NaOH, was zu Endkonzentrationen von 1 M NaBH
  • Während der ersten Stunde der Inkubation vorsichtig mischen das Röhrchen alle 15 min. Vermeiden Sie starke Unruhe, denn es kann die Gelstücke fragmentieren. Führen Sie die Reaktion in einem gut äquilibriert Inkubator / Ofen oder im Thermoblock. Stellen Sie sicher, dass die Gel-Stücke werden mit Reaktionslösung abgedeckt.
  • Die Reaktion durch Entfernen der Probenröhrchen aus dem Inkubator oder Wärmeblock und stellen Sie es auf Eis.
    HINWEIS: Nachdem die β-Eliminierungsreaktion für 18 Stunden ablaufen, muss der Entsalzungsverfahren am selben Tag durchgeführt werden.

    • 3. Entsalzung auf Kationenaustauschchromatographie

    1. Während die Probenröhrchen auf Eis, um übermäßige Wärmeentwicklung zu vermeiden, langsam 10% Essigsäure (AcOH) tropfenweise zu der Base zu neutralisieren. Vortexen Sie vorsichtig den Probenröhrchen zwischen den Zugaben von AcOH. Seien Sie vorsichtig, um Säure langsam und tropfenweise als zusätzauf der Säure ein "Vulkan" von Blasen zu erzeugen. Zentrifugieren, um Blasen zu beseitigen und zu verhindern Übergreifen, falls erforderlich.
      1. Um die große Menge an Natrium in dem Reaktionsgemisch zu entfernen, muss das Reaktionsgemisch durch eine kleine Kationenaustauschsäule (Dowex oder AG-50W-X8-Harz, H + Form).
      2. Waschen des Kationenaustauscherharzes mit 1 M NaOH und 1 M HCl vor einzusetzen, um Verunreinigungen, die mit MS-Analyse stören, selbst wenn das Harz von analytischer Qualität zu entfernen.
      3. Weichen Sie das Harz in 1 M NaOH und entfernen Lösung durch Dekantieren. In de-ionisiertes Wasser, entfernen Wasser, dann 1 M HCl.
    2. Wiederholen Sie diese Schritte, bis die Lösung über dem Harz ist farblos. Waschen Sie die gereinigte Harz mit entsalztem Wasser und lagern in 5% AcOH bei 4 ° C.
    3. Um eine kleine Glassäule, kratz machen und brechen Sie die Spitze eines Pasteur Glaspipette mit einer Keramikschneider, so dass die Verjüngung der Pipettenspitze ist ca. 1 cm lang. Necken neben einen Stopfen aus Glaswolle und drücken gegen die Spitze bildet einen Träger für das Harzbett. Sichern Sie die Pipettensäule mit einer Klammer oder Wäscheklammer und kann über einen Reagenzglas.
    4. Mit 1 ml Methanol (MeOH) und 3 ml 5% AcOH Waschen Sie die leere Pipette. Swirl H + Dowex oder AG50 Kationenaustauscherharz Schlamm in 5% AcOH gespeichert und übertragen der Slurry genug, um eine 1 ml Bettvolumen in der Pipette Spalte Pasteur zu produzieren.
    5. Spülen der Säule mit fünf Bänden von 5% AcOH. Check durchströmt für das Auftreten von Harzpartikeln und nicht mit der Säule, wenn Harzes festgestellt wird.
    6. Zeigen Spalte über einen neuen Schraubverschluss Glasrohr (16 x 125 mm) und Lastprobe. Sammeln des Durchflusses durch und eluierte Glycane mit mindestens 3 Volumina 5% AcOH in derselben Röhre.
    7. Decken Sie die Röhrchen mit Parafilm und machen kleine Löcher mit einer Nadel. Legen Sie das Probenröhrchen bei -80 ° C oder auf Trockeneis. Einmal eingefroren, trocknen Sie die Probe durch Gefriertrocknung. Bewahren Sie das getrocknete Material bei -20 °C bis zur Verwendung.

    4. Borat Removal

    1. Bereiten Sie 10% AcOH in MeOH. Nehmen Sie 10 ml Eisessig und die Lautstärke anpassen, um 100 ml mit Methanol. Dieses Reagenz in einer Glasflasche mit Teflon ausgekleideten Deckel für bis zu 6 Monate.
    2. In 300 ul 10% AcOH in MeOH auf die getrocknete, gefriergetrockneten Probenröhrchen und Wirbel. Entfernen des resultierenden Trimethylborat durch Verdampfen unter einem N 2 -Strom.
      HINWEIS: Mischen Boratsalze mit Methanol unter sauren Bedingungen produziert Borsäuretrimethylester die eine flüchtige Verbindung ist.
    3. Trocken unter N 2 -Strom bei 37 ° C. Nach dem Trocknen einen weiteren Aliquot AcOH in MeOH wie in Schritt 4.2 beschrieben. Trocknen der Flüssigkeit für 5 min unter Stickstoff (N 2) Strom bei 37 ° C.
      1. Wiederholen Resuspension und Trocknen mindestens 3 mal. Bewahren Sie das getrocknete Material bei -20 ° C bis zur Verwendung.

    5. C18 Aufräum

    1. Gleichgewicht kommen eine C18-Kartusche Spalte(Größe 1 ml, 100 mg Harz) mit drei Volumina ACN und fünf Bände von 5% AcOH. Beschleunigen Sie den Durchgang der Gleichgewichtslösungen durch Anwendung von milden Luftüberdruck.
    2. In 500 ul 5% AcOH zum entsalzt und Borat freies Probenglas und lösen durch Wirbel.
    3. Laden resuspendiert Probe auf die äquilibrierte Säule C18 und sammeln die Durchströmung in eine Glas Schraubkappe Rohr (13 x 100 mm). O-Glycane eluieren mit 3 ml 5% AcOH in derselben Röhre.
    4. Parafilm den Schlauch, stellen kleine Löcher mit einer kleinen Nadel oder verwenden lose verschlossenen PTFE ausgekleideten Deckel, um das Rohr zu decken, und frieren Sie die Probe bei -80 ° C oder auf Trockeneis. Entfernung des Lösungsmittels durch Lyophilisation. Bewahren Sie die getrocknete Probe bei -20 ° C bis zur Verwendung.

    6. Grundvorbereitung Permethylierung

    HINWEIS: Um robuste Permethylierung erzielen, bereiten NaOH Schlamm frisch. Alle Glaswaren für Permethylierung Reaktionen verwendet werden, sollten ausgiebig gereinigt werden.

    1. Um die Basis Reagenz für Permethylierung vorzubereiten, fügen Sie 400 ul 50% NaOH auf eine saubere Glasschraubenoberrohr (13 x 100 mm). In 800 ul wasserfreiem MeOH und Wirbel.
    2. 4 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) und Wirbel, um einen weißen Niederschlag zu erzeugen.
    3. Zentrifuge bei 600 × g für 1 min, um das Präzipitat zu pelletieren. Abpipettieren Überstand entfernen und entsorgen. Fügen zusätzliche 4 ml wasserfreiem DMSO zu dem Pellet. Vortex.
    4. Wiederholen Sie Schritt 6.2 und 6.3 mindestens drei Mal oder bis kein weißer Niederschlag bildet.
    5. Löse das pelle Basis in 3 ml wasserfreiem DMSO und vorsichtig mischen durch Pipettieren up-and-down mit einem sauberen Pasteurpipette.
    6. Verwenden Sie die Basis sofort für die folgenden Permethylierung Reaktion als sie nicht gespeichert werden kann.

    7. Permethylierung Veröffentlicht Glykane

    1. In 200 ul wasserfreiem DMSO auf die C18-gereinigten Probe und Wirbel oder beschallen zu suspendieren.
    2. In 300 ul der resuspended Grundschlicker zur Probe und sofort 100 l Iodmethan (MEI). Dichtungsrohr mit Teflon ausgekleideten Deckel und kräftig für 5 min mit dem Wirbel.
    3. Um die Reaktion zu stoppen Permethylierung, 2 ml 5% AcOH auf Eis und Wirbel. Pipettenlösung nach oben und unten 5 Mal, um das verbleibende Volumen von MeI durch Verdunstung zu reduzieren.
      HINWEIS: Die AcOH neutralisiert die Lösung und Entfernung von MeI erhöht die Extraktionseffizienz sulfatierter Glycane in die Wasserphase während der Phase-Partition.
    4. 2 ml Dichlormethan (DCM) und Wirbel. Zentrifuge bei 600 × g für 1 min bei Raumtemperatur, um die wässrige und organische Phase zu trennen.
    5. Übertragen die obere Schicht (wässrige Phase, die den Großteil der permethylierten sulfatierte Glycane enthält) in eine neue Glasröhrchen (13 x 100 mm).
    6. 2 ml H 2 O zu der organischen Phase und Wirbel. Zentrifuge bei 600 xg für 1 min, die wässrigen und organischen Phasen trennen und verbinden diese zweite wässrige Phase mit der Tannest wässrige Phase (Schritt 7.5).
    7. Wiederholen Sie Schritt 7.6 und 7.5 noch dreimal, aber es gibt keine Notwendigkeit, die wässrigen Phasen aus den nachfolgenden Partitionen resultierende speichern.
    8. Entfernen Sie die endgültige Deckschicht (wässrige Phase) so viel wie möglich von der Bodenschicht (organische Phase) und übertragen Sie die untere Schicht (organische Phase) in eine separate neue Glasrohr mit sauberen Pasteurpipette.
    9. Trocknet die organische Phase unter N 2 -Strom bei 42 ° C.
    10. Decken Sie die Röhrchen mit Parafilm und bei -20 ° C bis zur Verwendung.

    8. C18 Aufräum permethylierter Sulfated O-Glykane von der wässrigen Phase

    1. Äquilibrieren eine C18 Kartusche-Säule mit drei Volumina ACN und fünf Volumina 5% AcOH.
    2. Laden die wässrigen Phasen gesammelt und aus den Schritten 7.5 und 7.6 auf die Säule kombiniert.
    3. Mit 10 ml H 2 O zum Entsalzen Waschen der Säule.
    4. Eluieren die permethylierten sulfatierten O-Glykane in eine neue Glasrohr mit 2 mlvon 50% ACN. Verwenden Sie eine zusätzliche Elution mit 85% ACN, auf die Einziehung permethylierten sulfatierten O-Glykane auf größeren Oligosaccharide verbessern.
    5. Trocken Eluate unter einem Stickstoffstrom auf 42 ° C.
    6. Bewahren Sie das getrocknete Material bei -20 ° C bis zu 6 Monate vor MS-Analyse.

    9. Massenspektrometrie von permethylierten O-Glykane

    1. Analyse permethylierte O-Glykane durch direkte Infusion in eine geeignete Massenspektrometer unter Verwendung einer Nanoelektroquelle an einem Spritzenflussrate von 0,40-0,60 & mgr; l / min bei 210 ° C Kapillare Temperatur. Für Fragmentierung durch CID in MS / MS und MS n einer Ionenfalle Instrument gelten 30-40% Kollisionsenergie.
    2. Bei negativen Ionenmodus wiederherzustellen permethylierte sulfatierte O-Glycans in 50 ul Methanol / 2-Propanol / 1-Propanol / 13 mM wässrige Ammoniumacetatlösung (16: 3: 3: 2 nach Volumen). Bei positiven Ionenmodus, rekonstruieren permethyliertes neutral / sialyliert O-Glykane in 50 ul 1 mM Natriumhydroxid in Methanol / Wasser (1: 1).
    3. Verwenden Sie die Gesamtionen Mapping (TIM) und Neutralverlust-Scan (NL-Scan) Funktionalität des Xcalibur Softwarepaket Version 2.0 für MSN Analyse auf einzelne O-Glykanstrukturen 13,19 charakterisieren.

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    Ergebnisse

    Effect Ethylacetat Behandlung Vor In-Gel-reduktive β-Elimination

    Ein repräsentatives Massenspektrum permethylierter O-gebundene Glycan Proben von Rinder Mucin Verwendung im Gel reduktive β-Eliminierung freigesetzt wird in 3 gezeigt. Die EtOAc-Wasch der Gelstücke SDS Polyacrylamid und Verunreinigungen, mit anschließender MS-Analyse 27 stören effektiv entfernt.

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    Diskussion

    Die Kombination von reduktiver β-Eliminierung im Gel mit wässrig-organischer Extraktion verbessert die Sensitivität und Tiefe der strukturellen Daten, die für die Charakterisierung von sulfatierten und nicht-sulfatierten O-verknüpften Glykanen gewonnen werden können, die aus kleinen Mengen von Mucin-Glykoproteinen gewonnen wurden, die durch SDS-PAGE von anderen Proteinen aufgelöst wurden. Die wesentlichen Fortschritte der in dieser Studie vorgestellten technischen Ansätze sind: (a) einfache Entfernung von aus Gel gewonne...

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    Offenlegungen

    Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

    Danksagungen

    Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss P01HL107151 der NHLBI/NIH unterstützt. Die Autoren danken auch für die Unterstützung und den Zugang zu Instrumenten, die durch Zuschüsse P41GM103490 vom NIGMS/NIH bereitgestellt wurden.

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    Materialien

    Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
    NameUnternehmenKatalognummerKommentare
    Wasser, entionisiertes WasserSigma-Aldbsp;270733-4LCHROMASOLV, für HPLC
    Essigsäure, GlacialFisherA38-500zertifiziert ACS ≥ 99,7 Gew.-%
    MethanolSigma-Aldrich 34860-4L-RCHROMASOLV, für HPLC, ≥ 99,9%
    AmmoniumbicarbonatFluka09830-500GBioUltra, ≥ 99,5 % (T), Stufe 1
    AcetonitrilSigma-Aldbsp;34998-4LCHROMASOLV Plus, für HPLC, ≥ 99,9%, Schritt 1
    EthylacetatFluka34972-1L-RLC-MS CHROMASOLV, Schritt 1
    NatriumborhydridAldrich213462-25GReagenzPlus, 99%, Schritt 2
    JodmethanSigma-Aldrich 289566-100GReagentPlus, 99,5%,  Schritt 6.  Bei 4 Grad lagern; C bis zur Verwendung.  Vor Gebrauch bei Raumtemperatur hinsetzen.
    Natronlauge, 50 % w/wFisherSS254-1zertifiziert, Stufe 6
    Dimethylsulfoxid, wasserfreiSigma-Aldrich 276855-1Lwasserfrei, ≥ 99,9%, Stufe 6
    Methanol, wasserfreiesSigma-Aldbsp;322415-100MLwasserfrei, 99,8%, Stufe 6
    DichlormethanSigma-Aldrich 34856-4LCHROMASOL®, für HPLC, ≥ 99,8%, enthält Amylen als Stabilisator, Stufe 7
    Dowex 50WX8 WasserstoffformWasserstoff Form 100-200  NetzSigma-Aldrich 217506-500GStep 3
    AG 50W-X8 Harz Bio-Rad142-1441Step 3
    BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Festphasen-Extraktionssäule, PP, Octadecyl (C18) Reverse PhaseJT BakerJT-7020-01Step 5 und 8
    7,5% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBio-RadStep 1
    Bio-Safe Coomassie BeizeBio-Rad161-0786G-250, Schritt 1
    Silberflecken-Kit für die MassenspektrometriePierce24600Schritt 1
    Oligosaccharide Kit (Maltotriose, Dp3: R474140)Supelco 47265
    Oligosaccharide Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135)Supelco 47265
    Einweg-Pasteurpipetten, Glas, kurze SpitzeVWR14673-010Vor Gebrauch waschen
    PYREX 13 x 100 mm Einweg-Kulturröhrchen mit rundem BodenCorning99447-13Vor Gebrauch waschen
    PYREX 16 x 125 mm Einweg-Kulturröhrchen mit rundem Boden und GewindeCorning99447-16Vor Gebrauch waschen
    Phenolkappen/-verschlüsse mit PTFE-beschichteter GummiauskleidungKimble45066C-13Vor Gebrauch waschen
    Phenolkappen/-verschlüsse mit PTFE-beschichteter GummiauskleidungKimble45066C-15Vor Gebrauch waschen
    Hamilton HPLC-SpritzeHAMILTON81265Volumen 500  μ l, Nadelstärke 22 G
    Hamilton HPLC-SpritzeHAMILTON81165Volumen 250  μ l, Nadelstärke 22 G
    Hamilton HPLC-SpritzeHAMILTON81065Volumen 100  μ l, Nadelstärke 22s G
    Hamilton HPLC-SpritzeHAMILTON80965Volumen 50  μ l, Nadelstärke 22s G
    Hamilton Kalibrierte SpritzenHAMILTON80300Volumen 10  μ l, Nadelstärke 26s G
    Petrischalenglas 100 mm x 15mmGSC INTERNATIONAL INC1500-4Vor Gebrauch waschen, Schritt 1
    Bard-Parker Chirurgische KlingenFisher371310Schritt 1
    Reacti-Therm Heiz-/RührmodulPierce18870Schritt 1, 4 und 7
    Fisher125DSchritt 2
    Pyrex Faser Glaswolle Borosilikat-Porengröße 8  μ mAldrichCLS3950Schritt 3
    QuarzglasschneiderSchlauchschneideralltech3194Schritt 3
    Mehrrohr-Vortexer VWR444-7063Schritt 6
    Gefriertrockner 25EL FreezemobileVirtis25EL
    ZentrifugeVWRClinical 50
    LTQ Orbitrap DiscoveryThermo Fisher Scientific
    Heizblöcke

    Referenzen

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