Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Calcium ist in vielen physiologischen und pathophysiologischen Signalwegen beteiligt sind. Live Cell Imaging erfordert spezielle Geräte und kann zeitaufwendig sein. Eine schnelle, einfache Methode mit einem Durchflusszytometer, um relative Veränderungen in zytosolischen Kalzium in adhärenten Epithelzellen in Suspension gebracht bestimmen optimiert.

Zusammenfassung

Eine Vielzahl von zellulären Prozessen, sowohl physiologisch als auch pathophysiologisch, benötigen oder werden von Kalzium gesteuert, einschließlich Exozytose, mitochondriale Funktion, Zelltod, Zellstoffwechsel und Zellmigration, um nur einige zu nennen. Zytosolisches Calcium wird normalerweise in niedrigen nanomolaren Konzentrationen gehalten; Vielmehr kommt es in hohen mikromolaren bis millimolaren Konzentrationen im endoplasmatischen Retikulum, in der mitochondrialen Matrix und im extrazellulären Kompartiment vor. Nach der Stimulation dient ein vorübergehender Anstieg des zytosolischen Kalziums dazu, nachgelagerte Ereignisse zu signalisieren. Der Nachweis von Veränderungen des zytosolischen Kalziums erfolgt normalerweise unter Verwendung einer Lebendzellbildgebung, die mit Kalziumbindungsfarbstoffen aufgebaut ist, die entweder eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität oder eine Verschiebung der Emissionswellenlänge bei der Kalziumbindung aufweisen. Allerdings ist ein Aufbau zur Bildgebung lebender Zellen nicht für alle Forschenden frei zugänglich. Alternative Nachweismethoden wurden für immunologische Zellen mit Durchflusszytometrie und für nicht-immunologisch adhärente Zellen mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader optimiert. Hier beschreiben wir eine optimierte, einfache Methode zum Nachweis von Veränderungen in Epithelzellen mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines einwelligen Calciumbindungsfarbstoffs. Adhärente proximale Tubulus-Epithelzellen, die normalerweise schwer mit Farbstoffen zu beladen sind, wurden in Gegenwart von Probenecid mit einem fluoreszierenden zellpermeablen Calciumbindungsfarbstoff geladen, in Suspension gebracht und Calciumsignale vor und nach der Zugabe von Thapsigargin, Tunicamycin und Ionomycin überwacht.

Einleitung

Calcium ist ein wichtiger sekundärer Botenstoff für die Übertragung von zellulären physiologischen und pathophysiologischen Signale ¹ verantwortlich. Cytosolischen Calciumkonzentrationen werden durch die Aktivität der Calciumpumpen und Calciumtauscher gering gehalten. Das Sarkoplasma / Endoplasmatischen Retikulum Kalzium-ATPase (SERCA) füllt das endoplasmatischen Retikulum (ER) Calciumspeicher als Teil einer "Pumpe Leck" System, während die Plasmamembran Calcium ATPase (PMCA) extrudiert Calcium an den extrazellulären Raum, sowohl im ATP-abhängigen Weise ^2. Physiologischen Botenstoffe, wie Hormone oder Neurotransmitter, übertragen ihre Signale über G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die Aktivierung von Phospholipase C, die Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in der Plasmamembran hydrolysiert zu Diacylglycerol und Inositoltriphosphat (IP3) ³ zu erzeugen. Während Diacylglycerin in der Plasmamembran bleibt diffundiert IP3 in das Cytosol und bindet an IP3-Rezeptors (IP3Rs), die Liganden-aktivierten Calciumkanäle, in die ER-Membran und Calcium ist von dem ER luminalen Speicher die mit einer Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration ⁴ gelöst. Eine alternative Route für Calcium in das Cytosol zu erreichen, ist durch Calciumkanäle und Wärmetauscher in der Plasmamembran vorhanden sind. Übersprechen zwischen diesen beiden Fächern wurden beschrieben: Calcium induzierte Calciumfreisetzung (CICR), wo extrazelluläres Calcium induziert Calcium-Freisetzung aus ER speichert ⁵ und Speicher betrieben Calcium Eintrag (SOCE), wo Entleerung der ER speichert durch STIM erfasst und bewirkt Öffnung Orai Calcium-Kanäle in der Plasmamembran zu fördern Nachfüllen der ER speichert ^6.

Unter pathophysiologischen Bedingungen ist die zelluläre Kalziumantwort deregulierten und cytosolischen Calciumerhöhungen in Abwesenheit von physiologischen Stimulatoren ^1. Die Calcium-Reaktion kann in einer Anzahl von Weisen beeinflusst werden: verlängerte CalciumSignal, verzögerte Calciumentfernung aus dem Cytosol, Erschöpfung der Kalziumspeichern oder lokalisierte Veränderungen der Kalzium. Darüber hinaus sind die Mitochondrien nehmen eine zentrale Rolle bei der Pufferung und der Freisetzung von Kalzium ^7. Längerer und / oder supra zytosolischen Kalziumanstieg führt zum Zelltod. In der Tat ist Calcium öfter als nicht in der zellularen pathophysiologischen Antwort beteiligt und ist ein Schlüsselereignis in einer Vielzahl von Erkrankungen, wie von neurodegenerativen Erkrankungen, Herzerkrankungen, Krebs, Knochenerkrankungen und Nierenerkrankungen, die hauptsächlich mit Zelltod verbunden sind, und Verlust oder die Veränderung von Organ- oder Gewebefunktion ^8-10. Darüber hinaus hat der Störungscalciumsignale an zellulären Anpassung und Veränderungen der zellulären Funktionen und Antworten verknüpft.

Traditionell werden Calcium-Signale mit einem negativ geladenen fluoreszierenden Calcium-Indikator, der in einer Zelle durchlässigen Acetoxymethyl (AM) in Esterform in die Zellen geladen werden, wird gemessen. Einmal durch zelluläre Esteras gespaltenes bleiben die Fluoreszenzindikatoren innerhalb des intrazellulären Kompartiment und Erhöhung der Fluoreszenzintensität, wenn Kalzium gebunden ist. Die bekannteste und verwendet Calciumindikator ist die ratiometrische Fura-2 von Roger Tsien und Kollegen ¹¹ entwickelt. Calcium-Indikatoren mit unterschiedlichen Affinitäten für Calcium erlauben verschiedene Calcium-Pools zu überwachen. Nachweismethoden umfassen Live Cell Imaging, Fluoreszenz Mikroplatten-Reader und Durchflusszytometrie. Die relativ schnelle Kinetik der Calciumsignale (in der Regel innerhalb von ein paar Sekunden bis Minuten) macht das Live Cell Imaging, die beste Methode für die Gewinnung die meisten Informationen über Eigenschaften des Calciumsignals. Abgesehen von der schnellen Kinetik der Kalzium-Signale (in Millisekunden), ist Live Cell Imaging eine bessere Methode zur Untersuchung von zellulären Kompartimentierung von Kalzium Signalisierung innerhalb einer einzelnen Zelle ^12. Absolute Calciumkonzentrationen kann durch Bestimmung der minimalen und maximalen Fluoreszenz des Calcium ind berechnet werdenicator durch Zugabe eines Calcium-Chelators und Permeabilisierung der Zellen, die jeweils in der durch die Grynkiewicz et al. ¹¹ beschrieben.

Die Verwendung von Durchflusszytometrie zur Calcium-Signale zu messen wurde zuerst in den 1980er Jahren in der immunologischen Zellen entwickelt, bei denen die Möglichkeit, mehrere Parameter, wie die Membranintegrität und die Trennung der Zellpopulation, und dem Erfordernis der Zellen in Suspension in Verbindung mit der Entwicklung der einzelnen Wellenlänge zu messen Calcium Indikatoren Durchflusszytometrie einer idealen und convenientdetection Verfahren ^13-15. In adhärenten Zellen, bietet Live Cell Imaging die meisten Informationen über Calcium-Signal, was am wichtigsten ist die Kinetik, erfordert jedoch ein kompliziertes Setup bestehend aus einem Fluoreszenzmikroskop, ein Perfusionssystem, Aufrechterhaltung der Zellumgebung, wie Temperatur, und spezialisierte Mikroskop-Software für den Erwerb und Analysieren von Daten. Alternative Verfahren, wie ein Fluoreszenzmikroplattenlesegerät oder Pharmacollogischen Mittel, durch Verwendung von Calciumchelatoren sind in Bezug auf die gewonnenen Informationen unvergleichlich. Durchflusszytometrie wird immer häufiger verwendet, um cytosolische Calcium in adhärenten Zellen, obwohl zu überwachen, in den meisten Studien nur Endpunktmessungen durchgeführt. Verwendung des Verfahrens zunächst von Gergely et al. In immunologischen B-Zellen ^16, Änderungen in der cytosolischen freien Kalziumkonzentration mittels Durchflusscytometrie mit Echtzeit-Kinetik und die Überwachung der Fluoreszenzintensität in einzelnen Zellen aus einer Probenpopulation wurden erfolgreich bei Krebs epithelialen Zellen gemessen und Krebsstammzellhybriden ^17. Dieses Verfahren wurde für die Verwendung in adhärenten Epithelzellen, die schwierig mit Calcium-Indikatoren ¹⁸ zu laden sind, angepasst.

Hier mit einem verewigt adhärenten Zelllinie aus dem S1-Segment der Rattenniere proximalen Tubulus (WKPT-0293 Cl.2) ¹⁹ abgeleitet, beschreiben wir eine optimierte vereinfachte methode zur Messung von Änderungen in der cytosolischen Calciumkonzentration durch Durchflusszytometrie. Da viele Epithelzellen eine Reihe von organischen Transporter für anionische Verbindungen besitzen, können Beladung von Zellen mit einem Calcium-Indikator als eine Herausforderung sein. Um das Ausströmen von Kalzium-Indikatoren, Probenecid, der prototypischen Inhibitor der organisches Anion Transporter und ursprünglich entwickelt, um die renale Ausscheidung von Penicillin ²⁰ verringern zu verhindern, wird gleichzeitig im Inkubationsmedium aufgetragen. Die Zellen werden in Monokalziumindikator geladen gehalten, in Suspension gebracht und Calciumsignale unmittelbar nach Zugabe der Verbindung detektiert werden.

Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen

1. Bereiten Sie einen modifizierten Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) (in mm: 136,9 NaCl, 5,37 KCl, 0,34 Na ₂ HPO _4, 0,44 KH ₂ PO _4, 4,17 NaHCO _3, pH 7,2, kein Phenol rot). Lagerung bei 4 ° C.
2. Machen 1,5 M CaCl ₂ und ₂ M 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) (pH 7,2) Stammlösung unter Verwendung von destilliertem Wasser.
3. Bereiten Sie eine 250 mM Stammlösung von Probenecid. Für die Form der freien Säure (oft als wasserunlöslich), aufzulösen Probenecid Pulver in 1 N NaOH, zu füllen, um drei Viertel der endgültige Volumen mit destilliertem Wasser und langsam titriert auf pH 7,4 mit 1 N HCl. Lagerung bei 4 ° C.
4. Aufzulösen Fluoreszenzlässige Membran Calcium bindenden Farbstoff in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Vorratskonzentration von 1 mM. Lagerung bei -20 ° C im Dunkeln.
5. Vor jedem Experiment frisch herzustellen Probenecid enthaltenden HBSS Fluss (PHF) Puffer durch Kombinieren modifizierter HBSS mit (Endkonzentrationen) 1,5 mM CaCl _2, 10 mM HEPES, pH 7,2, 5% fötales Rinderserum, 2 mM Probenecid und 5,55 mM Glucose. Warm bis 37 ° C.

2. Zellkultur

1. Platte 2,5 x 10 ⁵ Zellen des proximalen Tubulus der Niere (WKPT-0293 Cl.2) pro Well einer 6-Well-Platte oder 35 mm-Schale in Standardkulturmedium wachsen und für 2 Tage Erreichen einer Konfluenz von etwa 70%.

3. Calcium Dye Loading

1. Für jede Vertiefung oder Schale, Mischungs 1 ml Kulturmedium, enthaltend 5% fötales Rinderserum, 4 uM zellpermeabel Calcium bindenden Farbstoff und 2 mM Probenecid.
2. Ersetzen des Kulturmediums mit 1 ml Ladepuffer Mischung in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 30 min in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2. Die Platte mit Aluminiumfolie, um ein Ausbleichen der Fluoreszenzindikator verhindern.

4. Herstellung von Cells für die Durchflusszytometrie

1. Warm 0,05% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung auf 37 ° C.
2. Saugen Calcium Ladefarbstofflösung aus jeder Vertiefung und 1 ml Trypsin entlang der Wand des Bohrlochs.
3. Inkubieren bei 37 ° C, bis alle Zellen abgelöst werden.
4. Übertragungszellen in ein 1,5-ml-Röhrchen und Pellets durch Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 g für 1 min.
5. Den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
6. Wash-Zellen durch Zugabe von 1 ml PHF Puffer und resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren.
7. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 g für 1 min.
8. Wiederholen Sie die Schritte 4.6. und 4.7. zwei weitere Male.
9. Zellen in einem Endvolumen von 500 ul Puffer PHF und mit den Zellen für die Experimente innerhalb 1 Std.
10. Optional: count Zellen die Zellkonzentration zu bestimmen und 5 × 10 ⁴ - 1x 10 ⁵ Zellen pro Messung.

5. Fluss Cytometer-Setup

1. Starten Sie das Durchflusszytometer, öffnen Sie die Fluidik Schublade und Flip das Entlüftungsventil Kippschalter um den Luftdruck der Hülle Fluidtank erhöhen.
2. "Prime" das Instrument, um potenzielle Wohnsitz Luftblasen aus dem Inneren der inneren Rohre und der Durchflusskammer zu entfernen.
3. In der Durchflusszytometrie Software, Open zwei Dot-Plot-Fenster.
   1. Die erste Punktdiagramm erfordert vorwärts gestreuten Licht (FSC) für den X-Parameter und Seitwärtsstreulicht (SSC) für die Y-Parameter, um die Qualität der Zellen innerhalb der Probe durch ihre Größe und ihre Granularität zu steuern.
   2. Der zweite Punkt-Diagramm misst die Fluoreszenzintensität des Calcium-gebundene Farbstoff. Wählen Sie den entsprechenden Fluoreszenzdetektionskanal für den Parameter Y über eine logarithmische Skala und Zeit in Sekunden für den Parameter X auf einer linearen Skala.
4. Stellen Sie die Flussrate auf "hoch".

6. Durchflusszytometrie Messung

1. Führen die Messungen bei RT. In einer Durchflußcytometrieprobe Rohr (11,5 x 75 mm), fügen Sie 480 ul PHF Puffer.
2. In 20 ul Zellsuspension und kurz Vortex mischen.
3. Bewegen der Röhre Tragarm an der Seite und die Position der Probenröhre über dem Probeninjektionsrohr, bis eine dichte Abdichtung gebildet wird. Bringen Sie das Rohr Tragarm in seine ursprüngliche Mittelstellung.
4. Optimierung Messung durch Einstellen der Fluoreszenzkanal, so daß die mittlere Fluoreszenzintensität der Probe auf etwa 10 ² auf der y-Achse. Speichern und für spätere Experimente.
5. Um ein Experiment zu starten, wiederholen Sie die Schritte 6.1 bis 6.3.
6. Rekordfluoreszenzbasis für 50 sec.
7. Pause Messung, entfernen Sie das Probenröhrchen, fügen Verbindung von Interesse, kurz vortexen und zum Probeninjektionsrohr. Dieser Schritt sollte nicht länger als 15 sec.
8. Fortsetzen Messung und weiterhin für insgesamt 204,8 sec.
9. Verwenden Sie einen Kalzium ionophore wie Ionomycin (10 uM) und ein Calcium-Chelatbildner, wie beispielsweise Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA), MnCl ₂ oder CoCl ₂ (2 mM) für positive und negative Kontrollen.

7. Datenanalyse

1. Analysieren von Daten mit dedizierten Durchflusszytometrie Software für die Offline-Analyse, wie WinMDI (Windows Multiple Document Interface für die Durchflusszytometrie), einer freien Software-Paket von Joe Trotter am Scripps Institute, Durchflusszytometrie Core Facility entwickelt.
2. Öffnen Sie ein Punktdiagramm mit SSC und FSC-Parameter.
3. Wählen Sie die Region der Zellen für die Analyse mit Hilfe der "Regionen" Werkzeug (Rechtsklick auf das Bild), um abgestorbene Zellen oder Zelltrümmer in der linken unteren Ecke von der Datenanalyse (Abbildung 1) auszuschließen.
4. Quadrant-Analyse (Figur 2)
   1. Öffnen einer Dichteverteilung mit der Zeit auf der x-Achse und die Fluoreszenzintensität auf der y-Achse. Nutzen Sie alle Veranstaltungen.
   2. Unse die gleichen Gating Region wie in 7.3.
   3. Quantifizieren Sie die Daten mit Hilfe der "Quadrant" -Tool.
   4. Einstellen der Quadranten Separatoren, so daß die vertikale Linie zum Zeitpunkt der Zugabe der Verbindung gegeben, und die horizontale Linie in der Mitte des Grundfluoreszenz in den Kontrollen gegeben. Sicherzustellen, dass die Positionierung der Quadranten Separatoren in allen Proben gleich ist.
   5. Der Prozentsatz an Zellen in jedem Quadranten ist in jeder Ecke (2) angezeigt. Vergleichen des oberen rechten Quadranten (UR) zwischen den Proben.
5. Histogrammanalyse (Figur 3)
   1. Öffnet die Steuerdaten in einem Histogramm-Fenster mit der Fluoreszenzintensität auf der x-Achse und Ereignisse auf der y-Achse. Nutzen Sie alle Veranstaltungen.
   2. Für eine Bildübersicht, fügen die Testdaten, um zu der Kontrollparzelle als Overlay Parzellen (weiter zu → Öffnen Sie Datei → Datei auswählen → Overlay-Datei) verglichen werden.
   3. Für die quantitative Analyse einzelner Histogramm gewinnenster müssen verwendet werden. Tor der Zellpopulation mit der Region R1 aus Schritt 7.3.
   4. In der nicht-behandelten Kontrolle, mit dem Marker-Funktion ("Marker"), um den Bereich für die Analyse ausgehend von dem Mittelpunkt zwischen dem minimalen und maximalen Fluoreszenz des Steuer Spitze und endet bei der maximalen Fluoreszenzintensität zu kennzeichnen. Der Prozentsatz an Zellen in diesem Bereich berechnet.
   5. Abrufen von Daten aus dem Statistik-Fenster. Wiederholen Sie für verbleibende Datendateien mit dem gleichen markierten Bereich für die Analyse.
6. Fluoreszenzintensitätsanalyse (Figur 4)
   1. Öffnen einer Dot-Plot mit der Zeit auf der x-Achse und die Fluoreszenzintensität auf der y-Achse. Nutzen Sie alle Veranstaltungen.
   2. Enable "Kinetics Mode" und "Overlay Kinetics Line". Eine blaue Linie in der Dot-Plot der mittleren Fluoreszenzintensität repräsentiert erscheinen.
   3. Quantifizierung der relativen Calcium-Einstrom, indem Sie mehrere rechteckige Bereiche. Jede Region sollte awreite von etwa "50", die gleichbedeutend mit "10 sec" ist. Definieren Sie bis zu 15 rechteckige Bereiche.
   4. Abrufen Quantifizierung aus der Statistik-Fenster und kopieren Sie in eine Tabellenkalkulation.
   5. Verwenden Sie die y-Mittelwert Daten für die Analyse. Berechnet den Mittelwert der R2 bis R6, die gleich 20 bis 50 sec ist. Dies ist der Ausgangswert.
   6. Wählen eines geeigneten Zeitintervalls für Calcium-Einstrom-Analyse (abhängig von Beginn, Dauer und Intensität).
   7. Berechnen der Calciumsignale aus jeder Region innerhalb dieses Zeitintervalls relativ zu dem mittleren Grundlinienwert, das heißt, das Fluoreszenzsignal vor Zugabe der Verbindung, die auf 100% gesetzt. Bestimmen Sie den Mittelwert und Standardabweichung der Regionen veröffentlichen Verbindung hinaus; Das ist die Durchschnittscalciumsignal durch die Verbindung hervorgerufen wird.

Ergebnisse

Um cytosolischen Calcium zu erhöhen, wurden zwei pharmakologische Verbindungen zu Nieren proximalen Tubuluszellen (WKPT-0293 Cl.2) mit zellpermeablen Kalzium bindenden Farbstoff, Fluo-3-AM beladen angewendet. Unbehandelten Kontrollproben wurden mit Calcium bindenden Farbstoff in Gegenwart von Probenecid geladen und gemischt, aber ohne den Zusatz irgendwelcher Verbindungen. Thapsigargin (TG) ist ein klassisches Inhibitor der SERCA Pumpe führt, aus dem ER Leckage und zu erhöhten zytosolischen Calcium. Tunicamycin (TUN) Bl...

Diskussion

Calcium ist ein Schlüsselereignis in mehreren Zellprozesse als second messenger-Signalmoleküls als auch als ein Mittel, um zwischen dem ER und Mitochondrien vermitteln wirkt. Die Fähigkeit, Änderungen in der freien cytosolischen Calciumkonzentrationen zu messen, ist eine nützliche Technik, die in allen Bereichen der Zellbiologie gelten können. Es gibt verschiedene Methoden, um cytosolische Calcium-Signale zu detektieren. Klassisch, Signale von einer ratiometrischen Calciumindikator, wie Fura-2, werden in lebenden Zellen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fluo-3, AM	Invitrogen	F-1241	Zelldurchlässig
Probenecid	Sigma-Aldrich	P-8761	Wasser unlöslich, gelöst in 1 N NaOH
0,05% Trypsin-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765
FACSCalibur Durchflusszytometer + CELLQuest-Software	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Joe Trotter, The Scripps Institute		Bitte beachten Sie, dass es sich hierbei um eine ältere 16-Bit-Anwendung handelt, die FCS 2.0-kompatible Dateien liest, aber keine digitalen FCS 3.0-Daten erkennt.
WKPT-0293 Cl.2 Proximale Tubulus-Zelllinie			Zur Verfügung gestellt von Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysik, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)

der Rattenniere