Methodenartikel

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

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DOI:

10.3791/51860

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21. August 2014

 , 
1Molecular, Cellular and Developmental Biology Graduate Program, The Ohio State University, 2Center for Cardiovascular and Pulmonary Research, The Heart Center, The Research Institute at Nationwide Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, The Ohio State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, Herzklappen-Endothelzellen (VECs) zu isolieren, ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der Klappenentwicklung, -erhaltung und -erkrankung. Hier beschreiben wir die Isolierung von VECs aus embryonalen und adulten Tie2-GFP-Mäusen mittels FACS, die Studien zur Bestimmung des Beitrags von VECs zu Entwicklungs- und Krankheitsprozessen ermöglichen wird.

Zusammenfassung

Normale Klappenstrukturen bestehen aus geschichteten Schichten spezialisierter extrazellulärer Matrix (ECM), die mit interstitiellen Klappenzellen (VICs) durchsetzt und von einer Monoschicht aus Endothelzellen (VECs) umgeben sind. VECs spielen eine wesentliche Rolle bei der Etablierung der Klappenstrukturen während der Embryonalentwicklung und sind wichtig für die lebenslange Aufrechterhaltung der Integrität und Funktion der Klappen. Im Gegensatz zu einem kontinuierlichen Endothel über der Oberfläche gesunder Klappensegel wird eine VEC-Störung häufig bei Fehlfunktionen von Klappen beobachtet und ist mit pathologischen Prozessen verbunden, die Klappenerkrankungen und -funktionsstörungen begünstigen. Trotz der klinischen Relevanz gibt es nur wenige fokussierte Studien, die den Beitrag von VECs zu Entwicklungs- und Krankheitsprozessen bestimmen. Die Isolierung von VECs aus Tiermodellen würde zellspezifische Experimente ermöglichen. VECs wurden aus adulten Großtiermodellen isoliert, aber aufgrund ihrer geringen Populationsgröße, ihrer Fragilität und des Mangels an spezifischen Markern wurden keine Berichte über VEC-Isolationen in Embryonen oder adulten Kleintiermodellen berichtet. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die die direkte Isolierung von VECs aus Mäusen im embryonalen und adulten Stadium ermöglicht. Unter Verwendung des Tie2-GFP-Reportermodells, das alle Endothelzellen mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert, ist es uns gelungen, GFP-positive (und negative) Zellen aus den semilunaren und atrioventrikulären Klappenregionen mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) zu isolieren. Isolierte GFP-positive VECs sind mit Endothelmarkern, einschließlich CD31 und von-Willebrand-Faktor (vWF), angereichert und behalten die Endothelzellexpression bei, wenn sie kultiviert werden; während GFP-negative Zellen molekulare Profile und Zellformen aufweisen, die mit den VIC-Phänotypen übereinstimmen. Die Möglichkeit, embryonale und adulte murine VECs zu isolieren, ermöglicht es, bisher unerreichbare molekulare und funktionelle Studien an einer spezifischen Klappenzellpopulation durchzuführen, was unser Verständnis der Klappenentwicklung und der Krankheitsmechanismen erheblich verbessern wird.

Einleitung

Das reife Ventil aus drei geschichteten Lagen von spezialisierten extrazellulären Matrix (ECM) mit Ventilzwischenzellen (VIC) durchsetzt und eingekapselt durch eine einzige Schicht von Herzklappen Endothelzellen (VEC) 1 zusammengesetzt. Die Rolle der ECM ist, alle notwendigen biomechanischen Eigenschaften zu ständigen Änderungen der hämodynamischen Kraft während des Herzzyklus zu widerstehen. Umsatz des Ventil ECM im erwachsenen Ventil fest durch VICs weitgehend ruhenden Fibroblasten-ähnliche und in Abwesenheit von Krankheit geregelt. Neben dem VIC Bevölkerung Herzklappe Endothelzellen (VEC) einen ununterbrochenen Endothel über die Oberfläche der Klappensegel 2. Während die Bedeutung von ECM und VICs Ventil Struktur und Funktion sind von uns und anderen beschrieben wurde, ist die Rolle der VECs weniger bekannt. Jedoch ist dieser vergleichsweise kleinen Zellpopulation kritischen Ventilbildung im Embryo und als dysfunktional Ventil beschriebenKrankheit.

Herzklappenbildung im Embryo beginnt, wenn eine Teilmenge von Endothelzellen in den AV-Kanal und Ausflusstrakt Regionen unterziehen endotheliale mesenchymale Transformation (EMT) und Form wie Schwellungen Endokardkissen 1,3 bekannt. Die neu verwandelt mesenchymalen Zellen innerhalb dieser Strukturen später in VICs zu differenzieren und die reifen Ventile zu bilden. Sobald EMT abgeschlossen ist, Endothelzellen umgebenden die Kissen, genannt VECs, bilden eine ununterbrochene endothelialen Zellschicht, die die reifen Ventil vor Verletzungen schützt. Darüber hinaus erfassen die hämodynamische VECs Umwelt und haben gezeigt, dass molekular kommunizieren mit Basiswert VICs zu regulieren ECM Homöostase 1,3. In erkrankten Ventile wird die VEC-Monoschicht in Verbindung mit krankhaften Veränderungen in Organisation und ECM verändert Biomechanik 4,5 gestört. Darüber hinaus Studien in Mausmodellen zeigen, dass VEC Dysfunktion ist die zugrunde liegende Ursache der Ventil disease 1,6-9. Wie VECs spielen eine wichtige Rolle in der Ventil Entwicklung, Wartung und Krankheit, ist es wichtig, dass wir ihre zeitliche Phänotypen voll in Ordnung, um das Feld zu fördern und zu verstehen, Mechanismen der Krankheits definieren.

Frühere Arbeiten von mehreren Labors erfolgreich isoliert VECs aus Schweine und Schafen Modelle 10-12. Aufgrund der großen Grße dieser Ventile, Trennung durch Betupfen und / oder enzymatische Verdauung, gefolgt von einer Anzahl von verschiedenen Verfahren, einschließlich Isolierung magnetischen Kügelchen Zelltrennung und Einzelzell klonalen Expansion wirksam war, um reine Populationen 11-13 zu erzeugen. Allerdings können diese Modelle restriktiv sein aufgrund der unvollständigen Annotation von den Schweinen und Schafen Genome Einschränkung der Verfügbarkeit von molekularen Werkzeugen zusätzlich zu den hohen Kosten. Daher Experimente von Schweine-und Schaf VECs nach Isolierung können restriktiv sein. Mausmodelle sind bevorzugt wegen der vielen Möglichkeiten für die genetische Manipulationention und molekulare Werkzeuge in den Embryo und Erwachsenen, aber bis heute keine VEC-Isolationen in kleinen Tiermodellen berichtet worden. Dies ist aufgrund der Schwierigkeit bei der Arbeit mit kleinen Gewebeproben, die eine Minderheit Zellpopulation, die gegenwärtig nicht eindeutige Identität VEC-spezifischen Markern, wodurch Antikörper-basierten Isolationsverfahren umfassen wahrscheinlich verhindert.

In diesem Artikel, eine neue Methode zur direkten Isolierung von murinen VECs an embryonalen und adulten Stadien berichten wir. Dieses Protokoll nutzt Tie2-GFP Mäusen, die GFP in allen endothelialen Zelltypen zu äußern und wurden umfassend genutzt, um endotheliale Zellpopulationen 14 studieren. Jedoch ist die Neuheit dieser aktuellen Studie, dass diese Mäuse zum ersten Mal verwendet worden, um Endothelzellen von den Ventilen isolieren. Durch sorgfältige Dissektion der Klappengewebe und einer Reihe von neun enzymatischen Verdaus, gefolgt von FACS-Sortierung kann VECs isoliert und für verschiedene experimentelle Techniken verwendet werden,einschließlich RNA-Extraktion und Kultur, direkt nach Sortierung.

Protokoll

1. Herstellung der Geräte und Lösungen

  1. Sterilisieren Sie die Dissektion Werkzeuge - Feingewebe Schere Erwachsenen Herzen und 2 feinen Pinzette für die Präparation des Klappen Region zu extrahieren - in einem überdachten Instrumentenablage durch Autoklavieren. Spritzwerkzeuge mit 70% Ethanol (EtOH) vor der Dissektion.
  2. Bereiten alle Lösungen unmittelbar vor dem Experiment und sterilisieren Lösungen, indem sie durch einen sterilen 0,2 um Filter. Halten Sie Lösungen auf Eis bis zum Gebrauch.
    1. Sterile Dissoziationspuffer (15 ml Gesamt / Probe). Kombinieren Sie 1,2 ml Kollagenase IV, 300 ul 2,5% Trypsin und 150 ul Küken Serum. Bringt Volumen von bis zu 15 ml mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
    2. Sterile Sortierpuffer (12 ml insgesamt). Kombinieren von 25 ul 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 12 ul DNase I (RNase-frei). Bringt Volumen von bis zu 12 ml mit HBSS.
    3. VEC Kultur Medien. Mix endothelialen growth Medien gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Material Tabellenkalkulation), indem Sie die aliquotiert Komponenten aus dem Kit zu 500 ml EBM2 Medien.
    4. GFP Negative Kultur, Medien (Nicht-Endothelzellen Medien). Mischen 445 ml Medium 199 1x mit 5 ml Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) (1% Endkonzentration) und 50 ml FBS (10% Endkonzentration).

2. Präparation der Herzklappen Region von Mäusen und Erwachsene E14.5 Embryonen

  • Alle Tier Verfahren genehmigt und in Übereinstimmung mit der bundesweiten Kinderklinik Forschungsinstitut IACUC Richtlinien durchgeführt.
  • Tie2-GFP-Mäuse wurden von Jackson Laboratories (Bestellnummer 003658) 14 gekauft und wurden als homozygote Genotypen auf einem FVB / N Hintergrund gehalten, und damit sicherzustellen, dass alle Off-Feder ausdrückliche GFP in Tie2-positiven Endothelzellen.
  • Für FACS-Sortierung, bereiten einem Alter abgestimmt negativen sample, die nicht GFP enthält wie C57 / Bl6 GFP Gate-Parameter für die FACS-Sortierung eingestellt. Hinweis: Dieses Protokoll und repräsentative Ergebnisse basieren auf der Verwendung drei, vier Monate alten erwachsenen Mäusen oder einen Wurf an embryonalen Tag (E) 14.5 basiert.
  1. Erwachsene Mäuse: unmittelbar nach der Tötung von CO 2 Anoxie, verwenden Dissektion Schere öffnen Sie vorsichtig die Brusthöhle und setzen die Herz und Lunge. Einmal ausgesetzt, Griff das Herz mit einer Pinzette an den großen Arterien und ziehen weg aus dem Körper. Lungengewebe zu entfernen, wenn intakt und Ort Herzen in kaltem HBSS zu spülen. Entfernen Sie die Herzkammer und ziehen weg die Vorhöfe des AV-Kanal "Ring" und Aorten-Regionen intakt. Machen Sie einen Schnitt an der Seite von AV-Kanal zu öffnen, den "Ring" und setzen die Klappenstrukturen. Entfernen Sie den Herzmuskel und der proximalen Aorta Regionen vorsichtig mit einer Pinzette entfernt necken. Identifizieren Sie die Klappensegel als weiße, dichte Gewebe über dem rosa Myokard. Sanft DetaCH Das Sehnenfäden aus den AV-Klappen und entfernen Sie so viel von der restlichen Myokard wie möglich. Seien Sie vorsichtig, um nicht ziehen oder kratzen die Klappensegel in diesem Prozess seit VECs kann verdrängt werden. Platzieren getrimmt Klappenbereiche in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml HBSS und auf Eis halten. HINWEIS: Eine sorgfältige Präparation ist entscheidend, um nicht-valvulärem Endothelzellen, die die Probe verunreinigen könnten zu beseitigen.
  2. Embryonen: Sacrifice weiblichen Mäusen 14,0 Tage nach der Kopulation beobachtet Stecker (morgens der Kopulation Stecker = 0.5 Tage).
    1. Unmittelbar nach der Tötung, sezieren die Gebärmutter (mit Embryonen), und Wäsche in kaltem HBSS. Sezieren einzelne Embryonen aus der Gebärmutter und entfernen Sie die embryonalen Dottersack jedes Embryo umgibt. Entfernen Sie die Herzen von jedem der Embryonen und führen Sie Schritt 2.1. (HINWEIS: leichtes Zusammendrücken der Embryo mit einer Pinzette direkt unter den oberen Fortsätze sollen helfen, das Herz freizulegen und stellen die Entfernung zu erleichtern.)
3. Zelle Dissoziation und Vorbereitung für die FACS

  1. Mit sterilen Pipettenspitzen, entfernen HBSS aus dem Eppendorf-Röhrchen, die die Herzklappen Regionen.
  2. Ersetzen mit 1 ml Dissoziationspuffer und 4 ul DNase I.
  3. Drehen die Röhrchen bei 37 ° C für 7 min.
  4. Pipette auf und ab 3 Mal und dann lassen Sie die Probe für 15 Sekunden absetzen. Die überstehende Flüssigkeit (die dissoziierten Zellen enthält) in einem 15 ml konischen Röhrchen.
  5. Um die Reaktion zu stoppen Kollagenase, fügen Sie 125 ul von Pferdeserum auf die Sammelröhrchen. Halten Sammelröhrchen auf Eis.
  6. Wiederholen Sie die Schritte Dissoziation (3,2-3,5) neun Mal zu neun Fraktionen der Überstand zu sammeln.
  7. Übergeben Sie die fraktionierte Sammlung durch eine 70 um Nylonfilter in ein neues Sammelröhrchen, um eine Einzelzellsuspension durch Entfernen Sie alle Fremdkörper und Klumpen zu gewährleisten.
  8. Drehen Sie die Suspension bei 400 g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren.
  9. Zellpellet in 1 ml Sortierpuffer undauf Eis zu halten, bis FACS.

4. FACS-Sortierung GFP positive VECs

  1. Gesetzt Tore für vorne und Seitenstreuung, um Schmutz auszuschließen und Aufnahme von Einzelzellen; Dubletten ausschließen, indem Sie Wams Diskriminierung Gating. Notieren Sie sich die negative Kontrollprobe und Gate-Einstellungen zu definieren, um in der Tie2-GFP Probe zu vergleichen und genau zu definieren, die das GFP-positive Zellpopulation.
  2. Analyse GFP-positiven Zellen über FACS und verfeinern Gate-Einstellungen.
  3. Sortieren Sie die Tie2-GFP Probe und sammeln beide GFP-positiven und GFP-negativen Zellen. Wenn Zellen zur RNA-Extraktion, Art direkt in den Sortierpuffer verwendet werden. Zur Kultivierung von Zellen nach FACS, sammeln GFP-positiven Zellen in einem sterilen Röhrchen mit 1 ml VEC Medien mit 1 ml FBS und sammeln GFP-negativen Zellen in 1 ml von nicht-endothelialen Medien mit 1 ml FBS. Verwenden Sie diese 50% Medien / 50% Serum Kombination, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Halten Sie sich auf Eis, bis nach FACS-Analyse.

5. Beitrag FACS Analysis

  1. RNA-Extraktion:
    1. Unmittelbar nach FACS, Zentrifuge GFP positiven und-negativen Zellen bei 1.500 g für 8 min.
    2. Beim Pipettieren der Überstand (Sortierpuffer) und entsorgen.
    3. Zellpellet (Pellet ist nicht für die Stichprobengrößen hier empfohlen sichtbar) in 200 ul Trizol.
    4. Einfrieren bei -80 ° C oder beginnen Standard Phenol-Chloroform-Extraktion zur Gesamt-mRNA zu isolieren, wie zuvor von unserem Labor 15 beschrieben.
    5. Verwenden 50-200 ng RNA für die cDNA-Synthese unter Verwendung des Mastermix nach den Anweisungen des Herstellers.
    6. Gegenstand cDNA, quantitative PCR-Amplifikation unter Verwendung von IDT Primetime qPCR-Sonden gegen Maus-Endothelzellen-Marker (CD31, von Willebrand Faktor (vWF)), Ventil interstitiellen Zellmarker (α-Aktin des glatten Muskels (α-SMA), Periostin (Postn)), Myozyten Marker (Mhc6, Mhc7) und GAPDH.
  2. Züchten Murine VEC:
    1. Nach FACS-Sortierung und Zellsammlung (Schritt 4.3), Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min.
    2. Beim Pipettieren Sie den Überstand (Sortierpuffer + Medien) und entsorgen.
    3. Resuspendieren der GFP-positiven Zellpellet in 1 ml VEC Medien und die GFP-negative Pellet in 1 ml nicht-endothelialen Medien.
    4. Schild Jede Probe in eine Vertiefung einer Plastikkammer Schieber und wachsen bis zur Konfluenz. Kultur für etwa 1 Woche für GFP-negativen Zellen konfluent werden und mehr als 2 Wochen für GFP-positiven Zellen konfluent geworden (aus einer Probe von 3, erwachsene Mäuse). Ändern Medien alle zwei Tage.
  3. Immunfluoreszenzfärbung:
    1. Entfernen Medien von Zellen und Fixierung in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bei RT. Für jeweils 5 min in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen fixierten Zellen dreimal.
    2. Entfernen Kammer Vertiefungen von Folie und Block in 5% Rinderserumalbumin / 1 × PBS für 1 h bei RT.
    3. BebrütenFolien O / N bei 4 ° C mit Primärantikörpern (CD31, 1: 1000 oder α-Aktin des glatten Muskels (α-SMA), 1: 100). Für 5 min in PBS waschen 3x.
    4. Verdünnen Sie die Sekundärantikörper (Alexa-Fluor 568 Ziege anti-Rat) 1: 400 in PBS, in den Rutschen, und Inkubation 1 h bei RT. Spülen Folien 3x für 5 min in PBS.
    5. Berg in Vectashield haltigen DAPI und Inkubation 1 h bei 4 ° C vor der Anzeige.

Ergebnisse

Tie2-GFP-Zellen co-lokalisiert mit Endothelzellmarkern in den embryonalen und adulten Herzklappen.

Um die Spezifität der Tie2-GFP-Expression in VECs von embryonalen und erwachsenen Mäusen zu bestätigen, wurde Immunfluoreszenz durchgeführt, um die Co-Lokalisierung mit der endothelialen Zellmarker, CD31 in Gewebeschnitten von E14.5 und 3 Monate alten Erwachsenen Tie2-GFP vorbereitet bestimmen Mäuse mit Methoden zuvor von unserem Labor 16 veröffentlicht. Wie in Abbildung 1 dargestellt, VECs Co-express GFP (Abbildung 1 A, B, E, F) und CD31 (Abbildung 1 C, D, E, F) bei beiden Erwachsenen (Abbildung 1 B, D, F) und embryonalen ( Abbildung 1 A, C, E) Stufen, damit die Validierung unseres Modells für nachfolgende VEC Isolation.

FACS-Analyse identifiziert deutliche GFP-positiven und GFP-negative Zellpopulationen in embryonalen und adulten Herzklappen aus Tie2-GFP Mäusen isoliert.

Wild typ C57 / Bl6 Mäuse wurden verwendet, um GFP Parameter eingestellt und ca. 2% der Single-Wohnzellen aus Tie2-GFP-Mäuse zeigen eine deutliche Anreicherung in GFP-positiven Zellen durch FACS-Analyse sowohl in embryonalen und adulten Proben (Abbildung 2). Basierend auf in Abbildung 1 dargestellt Co-Lokalisationsstudien, werden diese Zellen als VECs und ergeben einen Durchschnitt von 61.800 Gesamt Zellen (Proben reichen von 39,000-77,000 Zellen / Probe) bei erwachsenen Proben (n = 3), und 8.928 Zellen (8,015- 11.000 Zellen / Wurf) von einem Wurf von E14.5 Embryonen.

PCR-Analyse bestätigt Anreicherung Endothelzellmarkern in GFP-positiver Zellen und der Ventil interstitiellen Zellmarkern in GFP-negativen Zellen von Tie2-GFP-Mäuse isoliert.

Genexpressionsanalyse von GFP positiven und negativen Zellpopulationen durch qPCR folgenden FACS zeigen unterschiedliche molekulare Profile. Im Vergleich zu GFP negativen Zellpopulationen aus Tie2-GFP Embryonen und adul isoliertts, sind GFP-positiven Zellen für die Expression von endothelialer Zellmarker CD31 und vWF (Figur 3) angereichert. Weiterhin ist die Expression von Myozyten-Marker (Myh6, MYH7) in diesen Zellpopulationen sehr gering, was zeigt, minimale Kontamination der Nicht Endothelzellen. Im Gegensatz dazu sind GFP-negativen Zellen aus adulten Tie2-GFP-Mäuse und E14.5 Embryonen isoliert Ventilzwischenzelle (VIC) Marker, α-SMA und Periostin (POSTN) relativ zu GFP-positiven Zellen angereichert. Anreicherung dieser Marker ist in GFP-negativen Zellen von E14.5-Proben isoliert Vergleich zu Erwachsenen höher aufgrund der ruhenden Phänotyp der Erwachsenen VICs und daher geringe Expression von aktivierten Marker.

GFP-positive Zellen von Tie2-GFP erwachsenen Mäusen isoliert, können in vitro kultiviert werden.

Die Fähigkeit, Kultur GFP positiven und GFP-negativen Zellen aus adulten Proben isoliert wurde Basis untersuchtd auf die Zellmorphologie und immunhistochemischen Färbung. Unter Verwendung der zuvor von uns 17 beschrieben zeigen wir in Abbildung 4, dass GFP-positiven Zellen erscheinen Runde in der Morphologie (Abbildung 4A) und Co-express GFP mit der endothelialen Zellmarker CD31 nach zwei Wochen in Kultur (4C)-Protokolle. Im Gegensatz dazu sind nicht-Endothelzellen negativ für GFP, zeigen einen mesenchymalen förmige Morphologie (4B) und drücken die VIC-Marker α-SMA nach neun Tagen (4D).

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Abbildung 1. Tie2-GFP-positiven Zellen Co-Lokalisation mit CD31 in embryonalen und adulten Herzklappen. Immunfluoreszenz um die Assoziation (Tie2-) GFP-Expression (A, B) mit dem Endothel-Zellmarker zeigen, CD31 (C, D) in die septal Flugblätter der Mitralklappe bei E14.5 (A, C, E) und Erwachsenen (B, D, F) Stufen. Die Ventilbereich in einem hervorgehobenen, C, E. (E, F) fusioniert Bilder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Tie2-GFP-positiven VECs kann durch FACS identifiziert werden. Vergleich zu gleichaltrigen C57 / Bl6 Kontrollen (A, C), Ventile aus Tie2-GFP Embryonen (B) und Erwachsene (D) isoliert enthalten eine deutliche GFP positive Zellpopulation, wie in grün angezeigt. GFP-negativen Ereignisse, rot dargestellt wurden als Kontrolle gesammelt. Zahlen in (B) und (D) zeigen die durchschnittlichen% der GFP-positive Zellen aus der Gesamtzahl der Veranstaltungen, sortiert nach FACS (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. GFP-positive Zellen für Endothelzellmarkern angereichert wohin GFP-negativen Zellen exprimieren Gene mit Ventilzwischenzellen zugeordnet. Repräsentative qPCR endothelialer Zellmarker (CD31, von Willebrand Faktor (vWF)) und Erwachsenen (Myh6) und fetalen ( MYH7) myocyte Marker in GFP-positiven Zellen von Herzklappen Regionen E14.5 (A) und Erwachsenen (B isoliert) Tie2-GFP-Mäusen. Note Anreicherung Endothelzellmarkern und sehr geringe Mengen an Myozyten-assoziierten Genen. (C, D) Falten changes in der Expression von Ventil interstitielle Zellmarker α-SMA und Postn in isolierten GFP-negativen Zellen aus E14.5 (C) und Erwachsenen (D) Tie2-GFP-Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Tie2-GFP-positiven Zellen zu erhalten Expression der endothelialen Zellmarker in vitro. Nach FACS, GFP positive (A, C) und negativen (B, D) Zellpopulationen aus erwachsenen Mäusen wurden bis zur Konfluenz kultiviert und nach Kontrastbildgebung Phase (A, B) und Fluoreszenz-Immunfärbung (C, D). GFP-positive Zellen exprimieren CD31 (rot) (C) nach10 Tagen Kultur. Im Gegensatz dazu wurde die GFP-Expression nicht in der negativen Zellpopulation, die für α-SMA, einem Marker für aktivierte VICs (D) positiv gefärbt erkannt.

Diskussion

Hier erstmals beschreiben wir ein neues Verfahren zur Isolierung von embryonalen und adulten murinen VECs von Tie2-GFP-Mäuse. Während dieser Mauslinie wurde ausgiebig für die Isolierung von endothelialen Zellpopulationen verwendet wird, ist dies der erste Bericht zeigt selektive Isolierung von VECs. Wegen der Zerbrechlichkeit der VEC Bevölkerung haben wir eine strenge Protokoll, für Einzelzellisolierung von GFP positiven (negativen und GFP) Zellen von Herzklappen von embryonalen und adulten Mäusen ermöglicht. Im Vergleich zu der ursprünglichen Veröffentlichung mit ganzen Embryonen oder Organe von Tie2-GFP-Mäuse 14, haben wir Kollagenase und Dissektion Schritte auf der Grundlage der geringe Häufigkeit dieser fragilen endothelialen Zellpopulation, eine ausgewählte Population von Zellen zu isolieren optimiert.

VEC-Isolierungen haben bisher nur in Großtiermodellen mit begrenzten genetischen und molekularbiologischen Werkzeuge berichtet. Diese Werkzeuge sind in Mäusen festgestellt, und daher die ABIkeit murine VECs isolieren ermöglicht einen erweiterten Satz von experimentellen Designs für Herzklappen Forschung verwendet werden. Deshalb ist ein wesentlicher Vorteil dieses Ansatzes, dass VECs kann zeitlich von Wildtyp-Mäusen, und Modelle von Klappenerkrankungen und Verletzungen isoliert werden. Ein zweiter Vorteil ist, dass VECs isoliert und fast sofort analysiert nach der Sektion, die Erhaltung Expressionsmuster, das die in vivo-Situation genauer zu reflektieren. Ferner ist diese Trennprotokolls ausreicht, um Zellkultur-Nr Expansion und somit potentielle phänotypischen Veränderungen durch die in vitro-Umgebung induzierten beseitigen verhindert.

Trotz der Neuerungen und experimentelle Vorteile dieses Protokoll, erkennen wir, dass Einschränkungen existieren noch. Erstens ist die Grße des VEC Bevölkerung im murinen Ventile sehr klein, und daher werden mehrere zeitlich embryonalen Würfe um ausreichend RNA für Genexpressionsanalyse zu erzeugen benötigt. Während this kann mit mehreren Züchtern überwunden werden, könnte es einen Einfluss auf die Anwendung von einigen Post-Isolierung Analyse-Tools. Diese Einschränkung hat sich besonders für die Einrichtung konfluenten Kulturen von GFP-positiven VECs um genauere Analysen der VEC Phänotypen einschließlich molekularer Profile und funktionelle Assays durchzuführen war eine Herausforderung. Daher bestätigen wir, dass nicht alle Schwierigkeiten wurden von unseren Ansatz zu überwinden, aber dies ist ein Bereich von Interesse, dass wir sind bestrebt, zu überwinden.

Dieser Ansatz zur Isolierung von VECs Klappen Regionen stellt die Möglichkeit einer Kontamination von Tie-GFP-positiven, nicht-valvulärem Endothelzellen der Endokard oder Gefäßstrukturen im Myokard. Bisher wurden molekulare Unterscheidung VECs von anderen Herz endothelialen Zellpopulationen nicht identifiziert. Jedoch ein Enhancer-Region des NFATc1 Gen identifiziert und gezeigt, spezifisch zu markieren, die nicht VECsEMT unterziehen, und keine andere endotheliale Zellpopulation innerhalb des Herzens 18. Als Cre-Modell (NFATc1 ENCRE) verfügbar ist, könnten zukünftige Studien die Spezifität dieser Linie nutzen, um Kontaminationsrisiken zu minimieren. Zusätzlich zu nicht-Klappen Tie2-GFP-positiven Zellen, besteht immer die Möglichkeit einer Kontamination von Myozyten an dem Punkt, wo die Klappensegel zu befestigen an den ringförmigen Bereich des septalen und Wand myokardialen Wände. In der Daten hier nicht dargestellt, zunächst begannen wir Studien, um VECs von seziert Klappen Regionen mit Antikörper-konjugierten Perlen mit anti-GFP und anti-CD31 beschichtet isolieren. Während dieser Ansatz erfolgreich zur Isolierung der Endothelzellen war, erlebten wir eine signifikante Zell Verklumpung von benachbarten, nicht-endothelialen Zelltypen und damit VICs und Herzmuskelzellen verunreinigt unsere experimentellen Probe. Dies wurde mit Hilfe der FACS-Analyse als Parameter eingestellt sind, nur Einzelzellsuspension zu isolieren vermiedens und die PCR-Analyse zum Nachweis der Expression Myocyten-spezifischen Gene für diese Begrenzung (3) gesteuert wird. Während unsere Verunreinigung als minimal erachtet werden, bleibt es ein Potential experimentellen Aufwand, der in der Zukunft mit der Doppelselektion von GFP und Endothelzell-spezifische Oberflächenmarker vermieden werden.

Über dieses Protokoll, haben wir erfolgreich isoliert VECs von embryonalen und adulten Mäusen und bereitgestellt Beispiele, wie dieser Ansatz für die RNA-Isolierung und Zellkultur von GFP und GFP positive negativen Zellpopulationen verwendet werden. Jedoch ist dieser Ansatz nicht auf diese Anwendungen beschränkt und kann für eine Vielzahl von molekularen, zellulären und funktionalen Ansätze verwendet werden. Darüber hinaus kann der Tie2-GFP Hintergrund mit genetischen Mausmodellen, die für Vergleichsstudien von VEC Bevölkerung in Gesundheit und Krankheit ermöglichen wird gezüchtet werden. Die Entwicklung dieser neuartigen Methodik wird, zum ersten Mal, ermöglichen gezielte StudienPrüfung der Beitrag der VECs in Ventil Entwicklung und Wartung und konnte bisher unbeachtet Mechanismen der endothelialen abhängige Klappenerkrankungen zeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir danken der Ohio State University Comprehensive Cancer Center Analytical Cytometry Core Facility, speziell Katrina Moore, für die technische Unterstützung bei der FACS-Analyse. Darüber hinaus erkennen wir, Dr. William Pu und seine Gruppe für ihre wissenschaftlichen Erkenntnisse. Diese Arbeit wurde vom NIH HL091878 (JL) und das Herzzentrum bei Nationwide Kinderkrankenhaus unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alexa Fluor 568 Ziege Anti-Ratte IgG (H+L)Life TechnologiesA-11077
70 μ m Nylon-ZellsiebBD Falcon352350
2,5 % TrypsinInvitrogen LT15090-046
Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V, HitzeschockbehandlungFisher ScientificBP1600-100
CD31 Ratten-Anti-Maus-AntikörperBD Pharmingen553370
KükenserumInvitrogen LT16110-082
Kollagenase IVInvitrogen LT17104-019Hergestellt gemäß den Anweisungen des Herstellers
DNase I, RNasefrei (10.000 Einheiten)Roche4716728001
EBM-2LonzaCC3156Für VEC-Medien
EDTA, 0,5 M Lösung Hoefer03-500-506
EGM2 SingleQuot, BulletkitLonzaCC-4176Für VEC-Medien
Fötales Rinderserum (FBS), HitzeinaktiviertesHyklonSH3007103IH
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14025-092
PferdeserumInvitrogen LT16050-130
HybridisierungsofenVWR230301V
Medium 199 1XCorning cellgro10-060-CV
Paraformaldehyd 16% Lösung EM-QualitätElektronenmikroskopie Sciences15710
Pen/StrepMP-BiomedICN1670049
Permanox steriler Kammerobjektträger mit AbdeckungThermo-Scientific177429
phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1XCorning cellgro21-040-CV
PrimeTime Mini qPCR AssayIntegrated DNA TechnologiesActa2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF
StepOnePlus Real-Time PCR SystemApplied Biosystems4376600
SuperScript VILO MastermixInvitrogen LT11755050
[header]
Tie2-GFP MäuseJackson Laboratories3658
Gewebezange #5 11 cmDumont14096
TrizolAmbion15596018
α-SMA Anti-Maus-Antikörper Sigma-AldrichA2547
VECTASHIELD HardSet Eindeckmedium mit DAPIVector LaboratoriesH-1500

Referenzen

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