Abstract
التيلوميراز، وهو بروتين نووي ريبوزي، هو المسؤول عن الحفاظ على طول التيلومير وبالتالي تعزيز النزاهة الجيني، والانتشار، وعمر. بالإضافة إلى ذلك، التيلوميراز يحمي الميتوكوندريا من الاكسدة ويمنح المقاومة لموت الخلايا المبرمج، مما يشير إلى الأهمية المحتملة على قيد الحياة من غير الإنقسامية، خلايا نشطة للغاية مثل الخلايا العصبية. أثبتنا سابقا قدرة تفعيل التيلوميراز جديدة لزيادة النشاط التيلوميراز والتعبير في مختلف المناطق الماوس الدماغ وتحمي الخلايا العصبية الحركية من الاكسدة. هذه النتائج تعزز فكرة أن التيلوميراز تشارك في حماية الخلايا العصبية من الآفات المختلفة. التأكيد على دور التيلوميراز في الدماغ، ونحن هنا مقارنة النشاط تيلوميراز في الذكور والإناث الماوس الدماغ واعتمادها على العمر. TRAP الفحص هو الطريقة القياسية للكشف عن النشاط التيلوميراز في الأنسجة المختلفة أو خطوط الخلايا. نحن هنا لشرح analyجهاز الأمن والمخابرات النشاط التيلوميراز في ثلاث مناطق من الدماغ الماوس عن طريق غير تغيير طبيعة استخراج البروتين باستخدام CHAPS الاحتياطي تحلل تليها تعديل TRAP الفحص القياسية.
في هذا 2 خطوة الفحص، التيلوميراز الذاتية يستطيل ركيزة التيلوميراز محددة (TS التمهيدي) وذلك بإضافة 6 يكرر TTAGGG مضت (التيلوميراز رد فعل). وتتضخم المنتجات رد فعل التيلوميراز عن طريق تفاعل PCR خلق سلم DNA من 6 الزيادات مضت. يتم إجراء تحليل للسلم DNA بنسبة 4.5٪ عالية الدقة هلام الاغاروز الكهربائي تليها تلطيخ مع حساسة للغاية وصمة عار الحمض النووي.
بالمقارنة مع فحص TRAP التقليدية التي تستخدم 32 P المسمى المشعة في dCTP للكشف عن الحمض النووي وبولي أكريلاميد الكهربائي للهلام لحسم سلم الحمض النووي، وهذا البروتوكول يوفر الوقت غير سامة إنقاذ TRAP الفحص لتقييم نشاط التيلوميراز في مخ الفأر، مما يدل على القدرة على كشف الفروق في telomerasنشاط البريد في مختلف المنطقة الماوس الدماغ الإناث والذكور.
Introduction
التيلوميراز هو بروتين نووي ريبوزي تتألف من التيلوميراز الناسخ العكسي (TERT)، الوحيدات الحفاز تيلوميراز، ومكون RNA (TERC). دور الكنسي تيلوميراز هو الحفاظ على طول التيلوميرات السليم للطريق إضافة سلاسل متكررة (TTAGGG) إلى نهايات الكروموسومات، وبالتالي تعزيز النزاهة الجينومية، وانتشار الخلايا 1. ونسبت أدوار إضافية لTERT في الخلايا، أي أنه يمنح مقاومة لموت الخلايا المبرمج الناجمة عن مختلف عامل ضار 2، يحمي الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان من الإجهاد التأكسدي 3، ويلعب دورا المؤيدة للبقاء في الخلايا العصبية متباينة بالكامل من قبل ارتباطه إلى TIA1 RNA إيجابي حبيبات 4.
وأعرب عن TERT وتنشط بشكل رئيسي في الخلايا الجسدية وتقسيم في معظم أنواع السرطان، في حين يتم تنظيم مستويات التعبير والنشاط بإحكام انزيم في الخلايا غير تقسيم 5،6. وقد أظهرت الدراسات أن في صodent الدماغ، ويصبح النشاط التيلوميراز لا يمكن الكشف عنها من قبل يوم 10 بعد الولادة، بينما يتم الحفاظ TERT مرنا في المستويات الدنيا في مرحلة البلوغ 7. وأظهرت دراسات أخرى التيلوميراز النشاط داخل المنطقة البطيني الفرعية الكبار، البصلة الشمية، والحصين، والمخيخ والقشرة الكبار 8. أثبتنا مؤخرا أن المركبات الجديدة التي تزيد التعبير التيلوميراز والنشاط في الدماغ والعمود الفقري الحبال المبذولة آثار اعصاب في N-ميثيل-D-اسبارتاتي (NMDA) - الفئران المحقونة، أخرت ظهور وتطور مرض التصلب الجانبي الضموري في SOD1 المعدلة وراثيا زاد الفئران وبقاء الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي من هذه الفئران 9. إلى فهم كامل للدور الموالي للبقاء تيلوميراز في الخلايا العصبية في الدماغ و، فمن الضروري لتطوير فحص بسيط وسريع نسبيا حساسة للكشف عن النشاط التيلوميراز في مناطق مختلفة من الدماغ.
ص الكروموسوماتبروتوكول التضخيم EPEAT (TRAP) هو فحص حساسية معروفة الجمع بين النشاط الكنسي التيلوميراز وتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). تستخدم ACX المسمى 32 P لdCTP لكشف - في هذا الاختبار، التيلوميراز يضيف TTAGGG يكرر إلى الركيزة التيلوميراز (TS التمهيدي) قليل النوكليوتيد، تليها PCR التضخيم الذي يولد قاعدة 6 أزواج (بي بي) سلم DNA باستخدام TS العكسي التمهيدي. كمية قليلة من المنتجات PCR. يتم حل سلم الحمض النووي عن طريق التسلسل هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE). كل من شدة العصابات DNA وطول سلم DNA تعكس كمية جزيئات أنزيم نشطة وprocessivity على التوالي 10.
هذا الاختبار التقليدي يحمل بعض الصعوبات الرئيسية: خطر التعرض للمواد المشعة، كبيرة ويصعب التعامل PAGE التسلسل واستهلاك الوقت من هلام على التوالي وتعرض الفيلم المنتج المشع (بين عشية وضحاها في كل الحالات). هذا البروتوكول يوفر تحسين الاغاروز مصغرة هلام الفحص القائمة على غير المشعة. يتم حل BP سلم DNA 6 باستخدام 4.5٪ عالية الدقة الاغاروز جل ويتحقق الكشف يستخدم حساسة للغاية وصمة عار الحمض النووي. الجمع بين استخدام عالية الدقة الاغاروز مصغرة هلام وحساسة وصمة عار الحمض النووي يوفر سهولة التعامل مع الفحص، ويزيل خطر التعرض للنشاط الإشعاعي وتقصير كبير في مدة الفحص الشاملة من 3 أيام إلى عدة ساعات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة الأخلاقية للتجارب الحيوانية في جامعة بن غوريون (IL-39-08-2010).
1. ماوس الدماغ استخراج البروتين
- إعداد 3 أنابيب من 15 مل تحتوي كل منها على 5 مل من محلول ومكان أنابيب رينغر على الجليد.
- التضحية الماوس باستخدام التخدير الأيزوفلورين (تنبيه - استخدام غطاء الكيميائية) لمدة 10-20 ثانية تليها خلع عنق الرحم وقطع الرأس على الفور.
- إزالة الدماغ من الجمجمة وشطف لبضع ثوان مع حل الجليد الباردة رينغر لمنع تلف أنسجة المخ.
- باستخدام شفرة جراحية، فصل المخيخ (CR) والدماغ (BS) من القشرة الأمامية. بعد ذلك، فصل المخيخ من الدماغ وقطع الفص الجبهي (FL) من القشرة الأمامية. إزالة البصلة الشمية من الفص الجبهي. وضع مناطق الدماغ 3 في تعيين 15 مل أنابيب.
- تجانس الأنسجة في كل أنبوب. إضافة الابحل الجليد العش رينغر بارد جدا يحتوي كل أنبوب نفس الحجم وأجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 800 × ز.
- إزالة طاف وإضافة 100 ميكرولتر من CHAPS تحلل العازلة لكل أنبوب. تخلط جيدا، عن طريق تمرير الحل عدة مرات (~ 10) عن طريق حقنة 1 مل مع إبرة 21 G، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- نقل محتويات كل أنبوب جديد لأنبوب الطرد المركزي الصغيرة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 13،000 ز س. نقل طاف لأنبوب الطرد المركزي الصغيرة الجديدة وتحديد تركيز البروتين باستخدام طريقة المحددة سابقا. تخزين مستخلصات البروتين في aliquots من 10 ميكرولتر في -80 درجة مئوية.
2. TRAP الفحص إعداد الآلات، حلول ردود الفعل، والبروتين الحسابات التخفيف
- إعداد العدد المناسب من وصفت أنابيب الطرد المركزي الصغيرة للبروتين مستخلص التخفيفات ورد فعل العازلة التيلوميراز. أداء جميع pipetting لفي البروتوكول باستخدام نصائح فلتر لمنع التلوث. ذوبان الجليد الحلول التالية على الجليد: TRAP مزيج رد فعل 10X، TS التمهيدي، وdNTP وعصائر UPW والبروتين (انظر الجدول المواد والكواشف الكواشف لتركيزات).
- تمييع الحل لاستخراج البروتين إلى تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / ميكرولتر باستخدام المياه فائقة نقية (UPW).
3. التيلوميراز رد الفعل
- إعداد مزيج رد فعل التيلوميراز بإضافة ما يلي إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة: 2 ميكرولتر مزيج TRAP (10X)، 1 ميكرولتر TS التمهيدي (0.1 ميكروغرام)، 1 ميكرولتر dNTPs (10 ملم) و 15 ميكرولتر UPW. لعينات متعددة، ومضاعفة حجم المذكورة من قبل عدد من العينات، بالإضافة إلى 1.
- إضافة 19 ميكرولتر من مزيج رد فعل على كل أنبوب رد فعل وإضافة 1 ميكرولتر من استخراج البروتين المخفف (1 ميكروغرام البروتينات) إلى كل أنبوب عن الحجم النهائي من 20 ميكرولتر.
- وضع أنابيب رد الفعل في 30 ° C حمام الماء المسخن مسبقا لمدة 45 دقيقة.
4. PCR تفاعل
- خمسة عشر ميلن قبل نهاية التفاعل التيلوميراز، ذوبان الجليد الحلول التالية: التمهيدي ACX، التيتانيوم طق العازلة، UPW.
- إعداد PCR مزيج التفاعل بإضافة ما يلي إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة: 2.5 ميكرولتر التيتانيوم طق العازلة (10X)، 1 ميكرولتر ACX التمهيدي (0.1 ميكروغرام)، 2 ميكرولتر UPW (1 ميكرولتر عند استخدام IC) و 0.5 ميكرولتر التيتانيوم طق البلمرة (50X). لعينات متعددة، ومضاعفة حجم المذكورة من قبل عدد من العينات زائد 2.
- إضافة 6 ميكرولتر من PCR مزيج لكل أنبوب PCR وإضافة وحدة التخزين بالكامل من رد فعل التيلوميراز (20 ميكرولتر) إلى كل أنبوب عن الحجم النهائي من 26 ميكرولتر.
- إدراج أنابيب PCR إلى الحرارية cycler PCR وتشغيل البرنامج التالي:
- 90 ° C - 2 دقيقة.
- 94 ° C - 30 ثانية *
- 60 ° C - 30 ثانية *
- 72 ° C - 45 ثانية *
- 72 ° C - 2 دقيقة.
متجر المنتجات PCR في -20 درجة مئوية.
* = 34 دورات
5. الاغاروز البسيطة-GEل إعداد وعينات التوالي، وجل تلطيخ
- إضافة 25 مل عازلة الكهربائي المبرد (TBE) وبقضيب إلى دورق هذا هو 2-4 أضعاف حجم حل العازلة ويرش ببطء في 1.125 غرام من عالية الدقة (HR) مسحوق الاغاروز بينما يحرك الحل بسرعة . إزالة شريط ضجة، وتغطي الدورق مع غلاف بلاستيكي وبيرس في حفرة صغيرة للتهوية. تسخين كوب في الميكروويف على "منخفضة" السلطة لمدة 3 دقائق ومن ثم التبديل إلى السلطة "عالية" وتسخين الحل في نبضات قصيرة مع الحرص على عدم التسبب في إراقة. لاحظ أنه عند الرغوة التي تم إنشاؤها عن طريق التسخين تصبح فقاعات كبيرة ويختفي بعد بضع ثوان، والاغاروز جاهز.
- يلقي هلام إلى جهاز الأفقي مصغرة هلام، هلام بعد يتصلب في درجة حرارة الغرفة تسمح هلام البرد لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
- تحميل كل حارة مع 25 ميكرولتر من العينة TRAP (20 ميكرولتر TRAP المنتجات PCR و 5 ميكرولتر 6X صبغ هلام التحميل) وتعمل في 110 V لمدة 3 ساعة في غرفة باردة 4 درجات مئوية.
- تحضير حمض النووي 3X وصمة عار الحل تعمل عن طريق إضافة 15 ميكرولتر 10،000x-نوكليك حمض صمة عار، محلول المخزون إلى 50 مل ماء مقطر مزدوجة (DDW) مع 0.1 M كلوريد الصوديوم (0.29 ز). وصمة عار في هلام لمدة 20 دقيقة مع اهتزاز لطيف.
- استخدام الأشعة فوق البنفسجية مع نقل transilluminator 302 نانومتر الطول الموجي لعرض أشرطة DNA TRAP سلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أعدت كلها مقتطفات بروتين الخلية من الفص الجبهي (FL)، جذع الدماغ (BS)، والمخيخ (CR)، والمستمدة من 3 CD-1 الإناث و 3 CD-1 الفئران الذكور في الأعمار من 1 و 3 أشهر من العمر ل تعديل مقايسة TRAP و 3 CD-1 الفئران الذكور في سن 2 أشهر من العمر لTRAP فحص الإشعاعي. تم الكشف عن نشاط التيلوميراز في 1 ميكروغرام البروتينات استخراجها باستخدام مقايسة TRAP تعديل و 2 ميكروغرام استخراج البروتينات لTRAP الفحص الإشعاعي. الكشف عن النشاط التيلوميراز من قبل TRAP الفحص الإشعاعي والفحص TRAP تعديل يوضح أن التصور أفضل وقرار من المنتجات الحمض النووي التيلوميراز لوحظ مع مقايسة تعديل كما يراها طول وكثافة سلم الحمض النووي (الشكل 1A مقابل 1C و1D). لوحظ انخفاض تدريجي في منتجات الحمض النووي التيلوميراز عندما خفض تركيزات مستخلصات البروتين، والمستمدة من ورم أرومي دبقي خط الخلية U-251، كان يستخدم suggeاللدغة حساسية طريقة الفحص TRAP تعديل للكشف عن النشاط التيلوميراز بتركيزات أقل من البروتينات استخراج (الشكل 1B).
وينظر الى النشاط التيلوميراز أعلى بكثير في المناطق FL وBS مقارنة CR في الإناث القديمة 3 أشهر والذكور كما يتضح من شدة العصابات DNA وطول السلم المنتجات DNA. وبالإضافة إلى ذلك، يظهر أنه خلال المرحلة الانتقالية إلى مرحلة البلوغ الماوس التيلوميراز زيادة النشاط في فلوريدا والنقصان في BS وCR (الشكل 1D). المقارنة بين الجنسين تبين أن في النشاط التيلوميراز FL أعلى في الإناث على النقيض من BS وCR تظهر أعلى نشاط التيلوميراز في الذكور.
في أنسجة التعبير عن مستويات منخفضة من النشاط التيلوميراز وجدنا أن الكشف عن الحمض النووي باستخدام PCR سلم هو أكثر كفاءة دون استخدام الرقابة الداخلية (IC) التمهيدي، منذ IC يستخدم TS بمثابة التمهيدي إلى الأمام وبالتالي التدخل في التضخيم سلم DNA. ويتحقق استنساخ البيانات من خلال تكرار كل تجربة عدة مرات.
الرقم 1. النشاط التيلوميراز في مخ الفأر: التقليدية مقابل تعديل مقايسة TRAP. أ) النشاط في مناطق الدماغ التيلوميراز 3 تحليلها من قبل المشع فحص TRAP (2 أشهر من العمر CD-1 ذكور الفئران، واستخراج 2 ميكروغرام البروتينات). B) حساسية للمقايسة TRAP تعديل يظهر من خلال خفض تركيزات البروتينات تستخرج مستمدة من ورم أرومي دبقي U -251 خلية الخط. C، D) النشاط التيلوميراز في 3 مناطق الدماغ من 1 (C) و 3 (D) أشهر من العمر CD-1 إناث وذكور الفئران. يبدأ سلم DNA في الفرقة 50 نقطة مع 6 الزيادات مضت. (NC - السيطرة السلبية، IC- الرقابة الداخلية، BS - جذع الدماغ، CR - المخيخ، FL - الفص الجبهي).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليل النشاط التيلوميراز في مخ الفأر عن طريق فحص TRAP يتكون من 4 خطوات رئيسية: 1) استخراج البروتينات من مناطق معينة من أنسجة المخ 2) TS استطالة التمهيدي من التيلوميراز - رد فعل التيلوميراز 3) التضخيم من منتجات التفاعل التيلوميراز بواسطة PCR 4 ) فصل المنتجات PCR باستخدام عالية الدقة الاغاروز هلام.
يتناول هذا الاختبار TRAP تعديل اثنين من الصعوبات الرئيسية التي ترتفع من الفحص التقليدي: استخدام في dCTP المشعة للكشف عن حساسية في PCR المنتجات وPAGE فصل سلم DNA. عالية الدقة الاغاروز هلام يبسط الكشف عن منتجات التفاعل التيلوميراز (سلم DNA) مقارنة الصعب التعامل مع التسلسل PAGE. وبالإضافة إلى ذلك، وتلطيخ الحمض النووي هو حل غير سامة مع حساسية عالية اللازمة للكشف عن كمية صغيرة من الحمض النووي.
وينبغي إيلاء اهتمام خاص إلى الخطوات الهامة التالية: 1) الحفاظ على الوقت بين إزالة الأنسجة والتجانس إلى أدنى حد ممكن للحفاظ على سلامة البروتين 2) الفصول وينبغي تجنب تحلل عازلة إعادة تجميد يجب أن تبقى 3) مقتطفات مأخوذة من البروتين في وإذابة مرة واحدة قبل الاستخدام. تجنب إعادة تجميد العينات.
قد تحدث مشاكل أثناء الخطوة تحضير هلام هلام منذ تركيزات عالية الاغاروز هو عرضة للانتشار ويتطلب اهتماما وثيقا أثناء الطهي. تقنية يحمل عدة قيود مع ضرورة تشغيل هلام في غرفة باردة. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن أن ينظر إلى كمية قليلة من المنتجات PCR على طاولة الأشعة فوق البنفسجية.
مستوى النشاط التيلوميراز يختلف بين الأنسجة المختلفة، ويعتبر أن تكون منخفضة في الدماغ. هذا البروتوكول يوفر طريقة الكشف أكثر حساسية، مقارنة الفحص الإشعاعي التقليدي تمكين الكشف أفضل من النشاط التيلوميراز في الدماغ. على الرغم من الأساليب لمرة وكفاءة المختلفة المتاحة (خطوة واحدة مجموعات TRAP الفحص، وذلك باستخدام labeleد التمهيدي للكشف TS) هذه الأساليب هم بشكل ملحوظ أكثر تكلفة. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الاغاروز يلغي الخطر السامة باستخدام هلام بولي أكريلاميد.
كما كشفت عن نتائج ممثلة، باستخدام الطريقة الموصوفة أعلاه، فمن الممكن أن تظهر الاختلافات في مستويات النشاط التيلوميراز بين مختلف مناطق الدماغ وبين الذكور والإناث. هذه الطريقة يمكن استخدامها للكشف عن النشاط التيلوميراز في الأنسجة الطبيعية الأخرى ذات النشاط التيلوميراز منخفضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
