Telomerase wird im Gehirn von Neugeborenen und auch in verschiedenen Regionen des erwachsenen Gehirns exprimiert. Wir präsentieren einen ungiftigen, zeitsparenden TRAP-Assay zur Analyse der Telomeraseaktivität in verschiedenen Regionen des Mäusegehirns und zum Nachweis von Unterschieden in der Telomeraseaktivität zwischen männlichen und weiblichen Mäusegehirnen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Regionen der Maus Gehirn: Nicht-radioaktive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assay
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Telomerase, ein ribonucleoprotein, ist für die Aufrechterhaltung der Telomerlänge und damit die Förderung der genomischen Integrität, Proliferation und Lebensdauer verantwortlich. Darüber hinaus schützt die Telomerase Mitochondrien aus oxidativem Stress und verleiht Resistenz gegenüber Apoptose, was seine mögliche Bedeutung für das Überleben der nicht-mitotischen hochaktive Zellen, wie Neuronen. Wir haben bereits gezeigt, die Fähigkeit der neuen Telomerase-Aktivatoren, um die Telomerase-Aktivität und Expression in den verschiedenen Hirnregionen der Maus zu erhöhen und die motorischen Nervenzellen Zellen vor oxidativem Stress zu schützen. Diese Ergebnisse stärken die Vorstellung, dass die Telomerase in den Schutz von Neuronen vor verschiedenen Läsionen beteiligt. Um die Rolle der Telomerase im Gehirn unterstreichen, hier vergleichen wir die Aktivität der Telomerase in männlichen und weiblichen Maus Gehirn und seine Abhängigkeit vom Alter. TRAP-Assay ist ein Standardverfahren zum Nachweis von Telomerase-Aktivität in verschiedenen Geweben oder Zelllinien. Die Analy Hier zeigen wirsis der Telomerase-Aktivität in drei Regionen des Mäusehirns durch nicht-denaturierenden Protein-Extraktion unter Verwendung von CHAPS Lysepuffer gefolgt von Modifikation der Standard-TRAP-Assay.
In diesem 2-Schritt-Assay, verlängert endogenen Telomerase eine bestimmte Telomerasesubstrat (TS-Primer) durch Zugabe von 6 bp TTAGGG Wiederholungen (Telomerase-Reaktion). Die Telomerase-Reaktionsprodukte durch PCR-Reaktion die Schaffung einer DNA-Leiter mit 6 bp-Schritten amplifiziert. Die Analyse der DNA-Leiter wird durch 4,5% Agarose hochauflösende Gelelektrophorese, gefolgt von Anfärben mit hochempfindlichen Nucleinsäure-Färbung.
Im Vergleich zu den traditionellen TRAP-Assay, nutzen 32 P markierten radioaktiven dCTP für DNA-Detektion und-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die Lösung des DNA-Leiter, bietet das Protokoll eine nicht-toxische Zeitersparnis TRAP-Assay zur Auswertung der Telomeraseaktivität im Gehirn der Maus, demonstrieren die Fähigkeit, erkennen Unterschiede in telomerasE-Aktivität in den verschiedenen weiblichen und männlichen Gehirn der Maus Region.
Einleitung
Telomerase ist ein Ribonukleoprotein-Telomerase zusammen Reverse Transkriptase (TERT), der katalytischen Untereinheit der Telomerase-RNA-Komponente und eine (TERC). Die kanonische Funktion der Telomerase ist, um die richtige Länge der Telomere durch Zugabe von repetitiven Sequenzen (TTAGGG) an die telomeren Enden, damit die Förderung der genomischen Integrität und Zellproliferation 1 erhalten. Weitere Rollen wurden in TERT-Zellen zurückzuführen, dh Resistenz gegen Apoptose durch verschiedene schädigende Mittel induziert 2 schützt humanen mesenchymalen Stammzellen vor oxidativer Beanspruchung 3, und spielt eine überlebens Roll....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Tierversuche in der Ben-Gurion-Universität (IL-39-08-2010) zugelassen.
1. Maus Gehirn Proteinextraktion
- Bereiten Sie 3 Rohre von je 15 ml 5 ml Ringer-Lösung und Ort Röhrchen auf Eis enthält.
- Opfern Sie die Maus mit Isofluran-Narkose (Achtung - chemische Haube) für 10-20 Sekunden, gefolgt von Genickbruch und sofortige Enthauptung.
- Entfernen das Gehirn aus dem Schädel und gründlich für einige Sekunden mit eiskaltem Ringer-Lösung, um Schäden am Hirngewebe zu verhindern.
- Verwendung einer chirurgischen Klinge, trennen das Cerebellum (CR) und Hirnstamm (BS)....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Gesamtzellproteinextrakte wurden aus dem Frontallappen (FL), Hirnstamm (BS) und Cerebellum (CR) hergestellt aus 3 CD-1 und 3 weibliche CD-1 männliche Mäuse im Alter von 1 und 3 Monaten für die abgeleitete TRAP-Assay modifiziert und 3 CD-1 männliche Mäuse im Alter von 2 Monate alt für die radioaktive TRAP-Assay. Telomerase-Aktivität wurde in 1 pg Proteine festgestellt wurden unter Verwendung der modifizierten TRAP-Assay und 2 pg Proteine zu extrahieren für die radioaktive TRAP-Assay. Nachweis von Telomerase-Aktivität.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Analyse von Telomerase-Aktivität in Gehirn der Maus über die TRAP-Assay besteht aus 4 Schritten: 1) Extraktion von Proteinen spezifische Bereiche des Hirngewebes 2) TS Primerverlängerung durch Telomerase - Telomerasereaktion 3) Amplifikation der Telomerase-Reaktionsprodukte durch PCR 4 ) Auftrennung der PCR-Produkte mit hoher Auflösung Agarosegel.
Diese modifizierte TRAP-Assay befasst sich mit zwei Hauptschwierigkeiten, die sich aus der traditionellen Assay steigen: die Verwendung von radioa.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch B.G. Negev Technologie und den Beitrag von Linda Powers.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| TRAP Mix (10x) | Manuell hergestellt, mischen Sie Folgendes in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8,2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0,5% TWEEN (von Sigma gekauft). Aliquots werden bei -20 °C eingefroren. | ||
| Ringer-Lösung | Manuell hergestellt, mischen Sie Folgendes in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4· H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,802 g/L D-(+)-Glukose wasserfrei. | ||
| Isofluran | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Vorsichtig handhaben in einer Chemikalienhaube |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS Primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')Sigma | DNA-Oligos im DRY-Format bestellt und UPW entsprechend der geforderten Konzentration hinzugefügt | ||
| ACX Primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA-Oligos im DRY-Format bestellt und UPW nach Bedarf hinzugefügt Konzentration | |
| Titan Taq Polymerase/Puffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| Hochauflösende | Agarose Sigma | A4718 | Jede hochwertige hochauflösende Agarose kann geeignet sein |
| Mini-Gel-Gerät | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nukleinsäure-Färbung (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC-Primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA-Oligos, bestellt im DRY-Format und Zugabe von UPW entsprechend der erforderlichen Konzentration | |
| CHAPS-Lysepuffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Zugabe von PMSF (Proteaseinhibitor) zu einer Endkonzentration von 1 mM |
| Reinstwasser (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 Mäuse | HARLAN Laboratories INC. |
Referenzen
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by nove....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
