Abstract
टेलोमिरेज, एक Ribonucleoprotein, टेलोमेर की लंबाई को बनाए रखने और इसलिए जीनोमिक अखंडता, प्रसार, और उम्र को बढ़ावा देने के लिए जिम्मेदार है. ऐसे न्यूरॉन्स के रूप में गैर mitotic, अत्यधिक सक्रिय कोशिकाओं के जीवित रहने के लिए अपनी संभव महत्व का सुझाव दे, इसके अलावा, टेलोमिरेज oxidative तनाव से माइटोकॉन्ड्रिया की रक्षा करता है और apoptosis के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है. हम पहले से विभिन्न माउस मस्तिष्क क्षेत्रों में टेलोमिरेज गतिविधि और अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए और oxidative तनाव से मोटर न्यूरॉन्स की कोशिकाओं की रक्षा के लिए उपन्यास टेलोमिरेज activators की क्षमता का प्रदर्शन किया. इन परिणामों टेलोमिरेज विभिन्न घावों से न्यूरॉन्स की सुरक्षा में शामिल है कि धारणा को मजबूत. मस्तिष्क में टेलोमिरेज की भूमिका को रेखांकित करने के लिए, हम यहाँ पुरुष और महिला माउस मस्तिष्क में टेलोमिरेज की गतिविधि और उम्र पर अपनी निर्भरता की तुलना करें. ट्रैप परख विभिन्न ऊतकों या सेल लाइनों में टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने के लिए एक मानक तरीका है. यहाँ हम analy का प्रदर्शनCHAPS का उपयोग प्रोटीन निकासी गैर denaturing द्वारा माउस मस्तिष्क के तीन क्षेत्रों में टेलोमिरेज गतिविधि की बहन मानक ट्रैप परख के संशोधन द्वारा बफर पीछा lysis.
इस 2 कदम परख में, अंतर्जात टेलोमिरेज TTAGGG 6 बी.पी. दोहराता (टेलोमिरेज प्रतिक्रिया) जोड़कर एक विशिष्ट टेलोमिरेज सब्सट्रेट (टीएस प्राइमर) elongates. टेलोमिरेज प्रतिक्रिया उत्पादों 6 बी.पी. वेतन वृद्धि का एक डीएनए सीढ़ी बनाने पीसीआर प्रतिक्रिया से परिलक्षित कर रहे हैं. डीएनए सीढ़ी का विश्लेषण बेहद संवेदनशील न्यूक्लिक एसिड दाग के साथ धुंधला हो जाना द्वारा पीछा 4.5% उच्च संकल्प agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा किया जाता है.
32 पी डीएनए का पता लगाने और डीएनए सीढ़ी को हल करने के लिए polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए रेडियोधर्मी dCTP के लेबल का उपयोग कि पारंपरिक ट्रैप परख की तुलना में, इस प्रोटोकॉल, माउस मस्तिष्क में टेलोमिरेज गतिविधि का मूल्यांकन करने की क्षमता के प्रदर्शन के लिए जाल परख बचत एक गैर विषैले समय प्रदान करता है telomeras में अंतर का पता लगानेविभिन्न महिला और पुरुष माउस मस्तिष्क क्षेत्र में ई गतिविधि.
Introduction
टेलोमिरेज टेलोमिरेज से बना एक Ribonucleoprotein रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (TERT), टेलोमिरेज के उत्प्रेरक सबयूनिट, और एक शाही सेना घटक (TERC) है. टेलोमिरेज की विहित भूमिका इसलिए जीनोमिक अखंडता, और सेल प्रसार 1 को बढ़ावा देने, telomeric छोर तक दोहराए दृश्यों (TTAGGG) जोड़कर telomeres की उचित लंबाई की रक्षा के लिए है. यह विभिन्न हानिकारक एजेंट 2 द्वारा प्रेरित apoptosis के लिए प्रतिरोध प्रदान यानी अतिरिक्त भूमिकाओं, कोशिकाओं में TERT के लिए जिम्मेदार ठहराया गया, oxidative तनाव 3 से मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं की रक्षा करता है, और सकारात्मक आरएनए TIA1 को अपने सहयोग से पूरी तरह से विभेदित न्यूरॉन्स में एक समर्थक अस्तित्व भूमिका निभाता कणिकाओं 4.
एंजाइम अभिव्यक्ति और गतिविधि के स्तर कसकर गैर विभाजित कोशिकाओं 5,6 में विनियमित रहे हैं, जबकि TERT, व्यक्त और मुख्य रूप से दैहिक कोशिकाओं को विभाजित में और कैंसर के सबसे प्रकार में सक्रिय है. अध्ययन अनुसंधान में पता चला है किTERT mRNA वयस्कता 7 में निचले स्तर पर बनाए रखा है, जबकि odent मस्तिष्क, टेलोमिरेज गतिविधि, प्रसव के बाद 10 दिन से undetectable हो जाता है. अन्य अध्ययनों वयस्क उप निलय क्षेत्र, घ्राण बल्ब, हिप्पोकैम्पस के भीतर टेलोमिरेज गतिविधि का प्रदर्शन किया, और वयस्क सेरिबैलम और प्रांतस्था 8 में. , इंजेक्शन चूहों SOD1 ट्रांसजेनिक में amyotrophic पार्श्व काठिन्य रोग की शुरुआत और प्रगति में देरी - हमने हाल ही में मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी डोरियों में टेलोमिरेज अभिव्यक्ति और गतिविधि बढ़ा कि उपन्यास यौगिकों एन मिथाइल-D-aspartate (NMDA) में न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव exerted कि प्रदर्शन चूहों और इन चूहों 9 की रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स के अस्तित्व में वृद्धि हुई. पूरी तरह से न्यूरॉन्स में और मस्तिष्क में टेलोमिरेज के समर्थक अस्तित्व भूमिका को समझते हैं, यह मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने के लिए एक सरल और अपेक्षाकृत संवेदनशील तेजी से परख विकसित करने के लिए आवश्यक है.
telomeric REPEAT प्रवर्धन प्रोटोकॉल (ट्रैप) टेलोमिरेज की विहित गतिविधि और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के संयोजन एक प्रसिद्ध संवेदनशील परख है. इस परख में, टेलोमिरेज TTAGGG एक टेलोमिरेज सब्सट्रेट करने के लिए टीएस रिवर्स प्राइमर का उपयोग 6 बेस जोड़े (बीपी) डीएनए सीढ़ी उत्पन्न करता है जो पीसीआर प्रवर्धन द्वारा पीछा (टीएस प्राइमर) oligonucleotide, दोहराता कहते हैं -. ACX 32 पी लेबल dCTP का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है पीसीआर उत्पादों की कम राशि. डीएनए सीढ़ी अनुक्रमण polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) द्वारा हल हो गई है. दोनों डीएनए बैंड की तीव्रता और डीएनए सीढ़ी की लंबाई सक्रिय एंजाइम अणुओं की राशि और उनके processivity क्रमशः 10 दर्शाते हैं.
इस पारंपरिक परख कुछ बड़ी कठिनाइयों रखती है: (रात भर दोनों ही मामलों में) अनुक्रमण पृष्ठ और जेल चलाने का समय खपत और रेडियोधर्मी उत्पाद की फिल्म जोखिम को संभालने के लिए बड़ी और कठिन रेडियोधर्मी पदार्थों के लिए जोखिम के खतरे. इस प्रोटोकॉल एक बेहतर गैर रेडियोधर्मी agarose मिनी जेल आधारित परख प्रदान करता है. डीएनए 6 बीपी सीढ़ी 4.5% उच्च संकल्प agarose जेल का उपयोग कर हल हो गई है और पहचान अत्यधिक संवेदनशील न्यूक्लिक एसिड दाग का उपयोग कर हासिल की है. agarose उच्च संकल्प मिनी जेल और संवेदनशील न्यूक्लिक एसिड दाग का उपयोग करने का संयोजन, परख संभाल करने के लिए आसान प्रदान करता है रेडियोधर्मिता से संपर्क का खतरा समाप्त और काफी कई घंटे के लिए 3 दिनों से समग्र परख अवधि को कम.
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Protocol
पशु प्रयोगों बेन Gurion विश्वविद्यालय (आईएल 39-08-2010) में पशु प्रयोगों के लिए नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
1 माउस ब्रेन प्रोटीन निष्कर्षण
- प्रत्येक बर्फ पर 5 एमएल घंटी समाधान और जगह ट्यूब युक्त 15 मिलीलीटर की 3 ट्यूबों तैयार.
- (चेतावनी - रासायनिक हुड उपयोग) isoflurane संज्ञाहरण का उपयोग माउस बलिदान ग्रीवा अव्यवस्था और तत्काल कत्ल के द्वारा पीछा 10-20 सेकंड के लिए.
- खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें और मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान को रोकने के लिए बर्फ के ठंडे घंटी समाधान के साथ कुछ सेकंड के लिए कुल्ला.
- एक सर्जिकल ब्लेड का प्रयोग, ललाट प्रांतस्था से सेरिबैलम (सीआर) और brainstem (बी एस) अलग. अगला, brainstem से सेरिबैलम अलग और ललाट प्रांतस्था से ललाट पालि (फ्लोरिडा) में कटौती; ललाट पालि से घ्राण बल्ब हटा दें. नामित 15 मिलीलीटर ट्यूब में 3 मस्तिष्क क्षेत्रों रखें.
- प्रत्येक ट्यूब में ऊतक homogenize. Fr जोड़ेंESH बर्फ के ठंडे घंटी समाधान तो प्रत्येक ट्यूब x जी 800 पर 7 मिनट के लिए ही मात्रा और अपकेंद्रित्र में शामिल है.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और प्रत्येक ट्यूब CHAPS lysis बफर के 100 μl जोड़ें. एक 21 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के माध्यम से समाधान के लिए कई बार (~ 10) से गुजर रहा है, अच्छी तरह मिक्स, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
- 13,000 एक्स जी पर 30 मिनट के लिए एक नया सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए प्रत्येक ट्यूब की सामग्री को स्थानांतरित. एक नया सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और एक पहले से स्थापित विधि का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण. -80 डिग्री सेल्सियस पर 10 μl की aliquots में प्रोटीन अर्क स्टोर.
उपकरण, रिएक्शन समाधान, और प्रोटीन कमजोर पड़ने गणना के 2 ट्रैप परख तैयारी
- प्रोटीन निकालने dilutions और टेलोमिरेज प्रतिक्रिया बफर के लिए लेबल सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों के उपयुक्त संख्या तैयार करें. प्रदूषण को रोकने के लिए फिल्टर सुझावों का उपयोग प्रोटोकॉल में सभी pipetting प्रदर्शन करना. जाल प्रतिक्रिया मिश्रण 10x, टीएस प्राइमर, dNTP की, UPW और प्रोटीन के अर्क (अभिकर्मकों और अभिकर्मकों सांद्रता के लिए सामग्री की तालिका देखें): बर्फ पर निम्नलिखित समाधान पिघलना.
- अति शुद्ध पानी (UPW) का उपयोग 1 माइक्रोग्राम / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए प्रोटीन निकालने का समाधान पतला.
3 टेलोमिरेज रिएक्शन
- एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए निम्न जोड़कर टेलोमिरेज प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार: 2 μl ट्रैप मिक्स (10x), 1 μl टीएस प्राइमर (0.1 माइक्रोग्राम), 1 μl dNTPs (10 मिमी) और 15 μl UPW. कई नमूने लिए, नमूने, प्लस 1 की संख्या से ऊपर उल्लिखित संस्करणों गुणा.
- प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब प्रतिक्रिया मिश्रण के 19 μl जोड़ें और 20 μl के अंतिम मात्रा के लिए प्रत्येक ट्यूब पतला प्रोटीन निकालने (1 ग्राम प्रोटीन) की 1 μl जोड़ें.
- 45 मिनट के लिए एक 30 डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म पानी के स्नान में प्रतिक्रिया ट्यूबों रखें.
4 पीसीआर प्रतिक्रिया
- पंद्रह मीलACX प्राइमर, टाइटेनियम Taq बफर, UPW: n टेलोमिरेज प्रतिक्रिया के अंत से पहले, निम्न समाधान पिघलना.
- 2.5 μl टाइटेनियम Taq बफर (10x), 1 μl ACX प्राइमर (0.1 माइक्रोग्राम), 2 μl (आईसी प्रयोग किया जाता है जब 1 μl) UPW और 0.5 μl टाइटेनियम Taq पोलीमरेज़: एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए निम्न जोड़कर पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार (50x). कई नमूने लिए, नमूने प्लस 2 की संख्या से ऊपर उल्लिखित संस्करणों गुणा.
- पीसीआर के 6 μl प्रत्येक पीसीआर ट्यूब मिश्रण और 26 μl के अंतिम मात्रा के लिए प्रत्येक ट्यूब टेलोमिरेज प्रतिक्रिया (20 μl) की पूरी मात्रा जोड़ें.
- एक पीसीआर थर्मामीटरों cycler को पीसीआर ट्यूब डालें और निम्नलिखित प्रोग्राम चलाने:
- 90 डिग्री सेल्सियस - 2 मिनट.
- 94 डिग्री सेल्सियस -. 30 सेकंड *
- 60 डिग्री सेल्सियस -. 30 सेकंड *
- 72 डिग्री सेल्सियस -. 45 सेकंड *
- 72 डिग्री सेल्सियस - 2 मिनट.
-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर पीसीआर उत्पादों.
* = 34 चक्रों
5 Agarose मिनी जीईएल तैयार करना, नमूने चल रहा है, और जेल धुंधला
- 25 मिलीलीटर ठंडा वैद्युतकणसंचलन बफर (TBE) और बफर समाधान के 2-4 गुना मात्रा है और धीरे धीरे उच्च संकल्प (मानव संसाधन) agarose पाउडर के 1.125 ग्राम में समाधान तेजी से हड़कंप मच गया है जबकि छिड़क कि एक बीकर को एक हलचल बार जोड़ें . हलचल पट्टी निकालें, वेंटिलेशन के लिए एक छोटा सा छेद में एक प्लास्टिक की चादर और पियर्स के साथ बीकर को कवर किया. फिर 3 मिनट के लिए "कम" शक्ति पर माइक्रोवेव में बीकर गर्मी और "उच्च" बिजली स्विच और spilling पैदा करने के लिए नहीं देखभाल के साथ कम दालों में समाधान गर्मी. हीटिंग के द्वारा बनाई गई फोम कुछ सेकंड के बाद बड़े बुलबुले हो जाता है और गायब हो जाता है, जब agarose तैयार है कि ध्यान दें.
- जेल कमरे के तापमान पर solidifies के बाद जेल का प्रयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं, एक क्षैतिज मिनी जेल तंत्र को जेल डाली.
- 25 ट्रैप का नमूना μl (20 μl जाल पीसीआर उत्पादों और 5 μl 6x जेल लोडिंग डाई) के साथ प्रत्येक लेन लोड और 11 में चला4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में 3 घंटे के लिए 0 वी.
- 15 μl 10,000x न्यूक्लिक एसिड दाग, 0.1 एम NaCl (0.29 छ) के साथ 50 मिलीलीटर दोहरा आसुत जल (DDW) के लिए शेयर समाधान जोड़कर समाधान काम कर न्यूक्लिक एसिड दाग 3x तैयार करें. कोमल झटकों के साथ 20 मिनट के लिए जेल दाग.
- ट्रैप सीढ़ी डीएनए बैंड देखने के लिए 302 एनएम तरंगदैर्ध्य के साथ यूवी transilluminator का प्रयोग करें.
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Representative Results
पूरे सेल प्रोटीन के अर्क के लिए 1 और 3 महीने पुरानी की उम्र में 3 सीडी-1 महिला और 3 सीडी -1 पुरुष चूहों से ली गई, ललाट पालि (फ्लोरिडा), ब्रेन स्टेम (बी) और सेरिबैलम (सीआर) से तैयार की गई संशोधित ट्रैप परख और रेडियोधर्मी ट्रैप परख के लिए पुराने 2 महीने की उम्र में 3 सीडी -1 पुरुष चूहों. टेलोमिरेज गतिविधि संशोधित ट्रैप परख का उपयोग निकालने 1 ग्राम प्रोटीन में पता चला और 2 ग्राम प्रोटीन रेडियोधर्मी ट्रैप परख के लिए निकाल दिया गया था. रेडियोधर्मी ट्रैप परख द्वारा और संशोधित ट्रैप परख द्वारा टेलोमिरेज गतिविधि की जांच 1C बनाम डीएनए सीढ़ी (चित्रा 1 ए की लंबाई और तीव्रता से देखा के रूप में टेलोमिरेज डीएनए उत्पादों की एक बेहतर दृश्य और संकल्प संशोधित परख के साथ मनाया जाता है कि पता चलता है और -1 डी). टेलोमिरेज डीएनए उत्पादों में एक क्रमिक कमी ग्लियोब्लास्टोमा U-251 सेल लाइन से व्युत्पन्न प्रोटीन अर्क, की सांद्रता कम करते हैं, तो मनाया जाता है Sugge इस्तेमाल किया गया थाप्रोटीन की कम सांद्रता में टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने के लिए संशोधित ट्रैप परख विधि की संवेदनशीलता निकालने डंक (चित्रा 1 बी).
डीएनए बैंड की तीव्रता और डीएनए उत्पादों सीढ़ी की लंबाई से पता चला एक महत्वपूर्ण उच्च टेलोमिरेज गतिविधि 3 महीने पुराने महिलाओं और पुरुषों में सीआर की तुलना में फ्लोरिडा और बी एस क्षेत्रों में देखा जाता है. इसके अलावा, यह फ्लोरिडा में वयस्कता टेलोमिरेज गतिविधि बढ़ जाती है में माउस संक्रमण के दौरान दिखाया गया है कि और बी एस और सीआर (चित्रा -1) में कम हो जाती है. लिंगों के बीच तुलना FL टेलोमिरेज गतिविधि में पुरुषों में उच्च टेलोमिरेज गतिविधि दिखा बी एस के विपरीत और सीआर में महिलाओं में अधिक है कि यह दर्शाता है.
आईसी टी इस्तेमाल के बाद से टेलोमिरेज गतिविधि के निम्न स्तर व्यक्त ऊतकों में हम, पीसीआर का उपयोग डीएनए सीढ़ी का पता लगाने के आंतरिक नियंत्रण (आईसी) प्राइमर का उपयोग किए बिना अधिक कुशल है कि मिल गया हैएस एक आगे किताब के रूप में इस प्रकार डीएनए सीढ़ी प्रवर्धन के साथ दखल दे. डेटा के reproducibility प्रत्येक प्रयोग कई बार दोहरा द्वारा हासिल की है.
माउस मस्तिष्क में चित्रा 1 टेलोमिरेज गतिविधि: संशोधित ट्रैप परख बनाम पारंपरिक. रेडियोधर्मी ट्रैप परख (2 महीने पुरानी सीडी -1 पुरुष चूहों, 2 ग्राम प्रोटीन निकालने). बी) प्रोटीन की सांद्रता कम करके दिखाया गया है संशोधित ट्रैप परख की संवेदनशीलता से विश्लेषण 3 मस्तिष्क क्षेत्रों में ए) टेलोमिरेज गतिविधि ग्लियोब्लास्टोमा यू से व्युत्पन्न निकालने -251 सेल लाइन. सी, डी) 1 (सी) और 3 (डी) महीने पुरानी सीडी-1 महिला और पुरुष चूहों के 3 मस्तिष्क क्षेत्रों में टेलोमिरेज गतिविधि. डीएनए सीढ़ी 6 बी.पी. वेतन वृद्धि के साथ 50 बीपी बैंड में शुरू होता है. (नेकां - नकारात्मक नियंत्रण, IC- आंतरिक नियंत्रण, बी - ब्रेन स्टेम, सीआर - सेरिबैलम, FL - ललाट पालि).
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Discussion
पीसीआर 4 द्वारा टेलोमिरेज प्रतिक्रिया 3) टेलोमिरेज प्रतिक्रिया उत्पादों के प्रवर्धन - मस्तिष्क ऊतक 2) के विशिष्ट क्षेत्रों से 1) प्रोटीन निकासी टेलोमिरेज द्वारा प्राइमर बढ़ाव TS: जाल परख के माध्यम से माउस मस्तिष्क में टेलोमिरेज गतिविधि का विश्लेषण 4 प्रमुख चरण होते हैं उच्च संकल्प agarose जेल का उपयोग पीसीआर उत्पादों की) जुदाई.
डीएनए सीढ़ी की पीसीआर उत्पादों और पृष्ठ जुदाई के संवेदनशील पता लगाने के लिए रेडियोधर्मी dCTP का उपयोग: यह संशोधित ट्रैप परख परंपरागत परख से वृद्धि करने वाले दो प्रमुख कठिनाइयों पते. उच्च संकल्प agarose जेल अनुक्रमण पृष्ठ संभालना मुश्किल की तुलना में टेलोमिरेज प्रतिक्रिया उत्पादों की पहचान (डीएनए सीढ़ी) सरल करता है. इसके अलावा, न्यूक्लिक एसिड धुंधला डीएनए की छोटी राशि का पता लगाने के लिए आवश्यक उच्च संवेदनशीलता के साथ एक गैर विषैले समाधान है.
विशेष ध्यान निम्नलिखित महत्वपूर्ण कदम के लिए दिया जाना चाहिए: 1) एक न्यूनतम करने के लिए ऊतक को हटाने और homogenization के बीच का समय रखते हुए) प्रोटीन अखंडता 2 संरक्षित करने के लिए lysis बफर refreezing 3) प्रोटीन अर्क aliquots में रखा है और उपयोग करने से पहले एक बार thawed किया जाना चाहिए बचा जाना चाहिए लोग. नमूनों की refreezing से बचें.
समस्याएं उच्च एकाग्रता agarose जेल के बाद जेल तैयारी कदम के दौरान हो सकता spillover होने का खतरा है और खाना पकाने के दौरान करीब ध्यान की आवश्यकता है. तकनीक एक ठंडे कमरे में जेल चलाने की आवश्यकता के साथ कई सीमाएं भी रहती है. इसके अलावा, पीसीआर उत्पादों की कम राशि एक यूवी मेज पर नहीं देखा जा सकता.
टेलोमिरेज गतिविधि का स्तर विभिन्न ऊतकों के बीच बदलता है और मस्तिष्क में कम माना जाता है. इस प्रोटोकॉल एक अधिक संवेदनशील पहचान पद्धति प्रदान करता है, मस्तिष्क में टेलोमिरेज गतिविधि के बेहतर पता लगाने को सक्षम करने पारंपरिक रेडियोधर्मी परख की तुलना करें. अलग समय कुशल तरीकों एक labele का उपयोग उपलब्ध (एक कदम ट्रैप परख किट, हालांकिडी टी एस का पता लगाने के लिए प्राइमर) इन तरीकों में काफी अधिक महंगे हैं. इसके अलावा, agarose का उपयोग polyacrylamide जेल का उपयोग करने का विषाक्त खतरा समाप्त.
प्रतिनिधि परिणामों से पता चला है के रूप में, ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर, यह मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों के बीच और पुरुष और महिला के बीच टेलोमिरेज गतिविधि के स्तर में अंतर को प्रदर्शित करने के लिए संभव है. यह विधि कम टेलोमिरेज गतिविधि के साथ अन्य सामान्य ऊतकों में टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
