Summary
Este protocolo describe el uso de palancas de silicio microescala como superficies de cultivo flexibles para la medición de la contractilidad de las células musculares in vitro. La contracción celular hace que la flexión en voladizo, que se puede medir, grabada, y se convierte en lecturas de fuerza, proporcionando un sistema no invasivo y escalable para la medición de la función contráctil in vitro.
Abstract
El desarrollo de ensayos in vitro más predictivos y biológicamente relevantes se basa en el avance de los sistemas de cultivo de células versátiles que facilitan la evaluación funcional de las células sembradas. Para ello, la tecnología voladizo microescala ofrece una plataforma con la que para medir la funcionalidad contráctil de una gama de tipos celulares, incluyendo esquelético, cardiaco, y las células de músculo liso, a través de la evaluación de la contracción inducida por sustrato flexión. Aplicación de las matrices multiplexadas en voladizo proporciona los medios para desarrollar protocolos de moderado a alto rendimiento para la evaluación de la eficacia del fármaco y la toxicidad, fenotipo de la enfermedad y la progresión, así como neuromusculares y otras interacciones célula-célula. Este manuscrito proporciona los detalles para la fabricación de matrices voladizo fiables para este fin, y los métodos necesarios para con éxito células de cultivo en estas superficies. Una descripción más detallada se proporciona en los pasos necesarios para realizar anal funcionalanalysis de tipos de células contráctiles mantuvo en tales matrices usando una novela láser y sistema de foto-detector. Los datos representativos proporcionados destaca la precisión y la naturaleza reproducible de análisis de la función contráctil posible utilizar este sistema, así como la amplia gama de estudios a los que tal tecnología se puede aplicar. Amplia adopción exitosa de este sistema podría proporcionar a los investigadores con los medios para llevar a cabo estudios funcionales rápidas y de bajo costo in vitro, lo que lleva a predicciones más exactas de rendimiento de tejidos, desarrollo de la enfermedad y la respuesta al nuevo tratamiento terapéutico.
Protocol
1. Cantilever viruta Fabrication
Detalles ilustrados de los pasos de fabricación descritos se proporcionan en la Figura 1.
- Coloque las obleas de silicio sobre aislante (SOI) en un horno y hornear a 125 ° C durante 20 minutos para deshidratar ellos.
- Depositar una gruesa capa de óxido de silicio 1,5 m sobre la capa de mango de la oblea SOI deshidratado usando un Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) de la herramienta.
- Coloque las tabletas sobre el mandril recubridora de rotación con la capa de dispositivo hacia arriba. Asegúrese de oblea se centra, dispensan 2 ml de cebador P20 en el centro de la oblea, y centrifugado a 3.000 rpm durante 60 segundos a una aceleración de 1.000 rpm / seg. P20 imprimación promueve la adhesión de resina fotosensible a la capa de dispositivo.
- Mientras que la oblea todavía está en el revestidor de giro del mandril, prescindir de 2 ml de S1818 fotorresistente en el centro de la oblea, y centrifugado a 3.000 rpm durante 60 segundos a una aceleración de 1000 rpm / sec a Obtain una gruesa capa de resina fotosensible 1,5 m.
- Coloque las tabletas sobre un plato caliente y realizar una cocción suave a 115 ° C durante 1 min.
- Realizar un disco exposición por contacto UV utilizando un alineador de máscara de fotolitografía de contacto con el fin de transferir el patrón de la máscara en voladizo a la resina fotosensible sobre la capa de dispositivo. Calcular el tiempo de exposición basado en el valor energético de la exposición de 125 mJ / cm 2 para S1818 fotoprotector.
- Desarrollar la fotoprotección mediante la inmersión de la oblea en un MIF promotoras de fotorresistencia 726 para 1 min mientras se agita suavemente la oblea de ida y vuelta.
- Enjuague la oblea con (DI) de agua desionizada y se seca, preferiblemente usando una herramienta de secador de enjuague de centrifugado (SRD).
- Retire la fotoprotección desde el borde de la oblea (hasta 5 mm del borde) con un bastoncillo de algodón humedecido en acetona.
- Cargar la oblea en una herramienta de Deep Reactive Ion Etch (DRIE), con la cara de resina fotosensible, y ejecutar una receta para grabar la capa de silicio modelada a través de la Devicapa de ce. Las funciones de la capa de óxido enterrada como una parada de grabado, de modo realizar un grabado con 50% a 100% más ciclos que se espera que sea necesaria para garantizar un grabado completo.
- Coloque las tabletas en un baño de solución fotoprotector caliente durante 20 minutos para quitar la fotoprotección. Transferir la oblea a un-dump-enjuagadora rápida (QDR) para enjuagar la oblea con agua DI. A raíz de la tira fotoprotector, cargue la oblea en una herramienta SRD para enjuagar y secar la oblea. Inspeccionar la oblea bajo un microscopio para asegurar el patrón voladizo aparece como se esperaba.
- Depositar una gruesa capa de óxido de silicio dopado con un-1 m sobre la capa de dispositivo de la oblea usando una herramienta de PECVD. Esta capa de óxido funciones como una capa protectora para los voladizos durante etapas de procesamiento adicionales.
- Coloque la oblea sobre el mandril recubridora de rotación con la capa de mango hacia arriba para comenzar el procesamiento de la parte trasera de la oblea. Asegúrese de oblea se centra, dispensan 2 ml de cebador P20 en el centro de la oblea, y centrifugado a 3000 rpmdurante 60 segundos con una aceleración de 1.000 rpm / seg.
- Mientras que la oblea todavía está en el revestidor de giro del mandril, prescindir de 2 ml de resina fotosensible SPR220-4.5 sobre el centro de la oblea, y centrifugado a 2.000 rpm durante 45 segundos a una aceleración de 1.000 rpm / seg para obtener una capa gruesa de 6,5 micras fotoprotector.
- Coloque la oblea en una placa caliente de proximidad para llevar a cabo una cocción suave a 115 ° C durante 2 min.
- El uso de un alineador de contactos de fotolitografía capaz de delante / atrás alineación, alinear la máscara de la ventana trasera al patrón voladizo lado frontal y realizar un contacto dura la exposición UV con el fin de transferir el patrón de la máscara de la ventana trasera a la resina fotosensible sobre la capa de mango. Utilice un tiempo de exposición calculado con base en el valor de energía de exposición de 480 mJ / cm 2 para fotoprotector SPR220-4.5.
- Después de la exposición UV, permiten las obleas permanecen en una zona oscura durante 30 min antes de la siguiente etapa de procesamiento.
- Desarrollar la fotoprotección sumergiendo la oblea enun desarrollador 726 MIF fotoprotector durante 2 minutos mientras se agita suavemente la oblea de ida y vuelta.
- Enjuague la oblea con (DI) de agua desionizada y se seca, preferiblemente usando una herramienta de secador de enjuague de centrifugado (SRD).
- Coloque las obleas en un horno a 90 ° C durante 12 horas.
- Etch la capa de óxido de silicio en la parte trasera de la oblea utilizando un sistema RIE con gases fluorados y una receta para el grabado de óxido. El óxido de modelado en la parte trasera de la oblea actúa como una máscara de grabado para su posterior procesamiento. Inspeccionar las obleas bajo un microscopio para asegurarse de que el óxido de silicio en la ventana expuesta está completamente grabado.
- Retire la resina fotosensible en el borde de la oblea (hasta 5 mm del borde) usando un hisopo de sala limpia sumergido en acetona.
- Cargar la oblea en una herramienta con DRIE y ejecutar una receta para grabar la capa modelada mango a una profundidad de 500 micras con el funcionamiento capa de óxido enterrada como un tope de grabado. Dividir esta grabado en múltiples carreras para evitar un calentamiento excesivo de laoblea, lo que hace que el grabado inconsistente del silicio. Este paso elimina por completo el ataque químico de silicio por debajo de los voladizos.
- Realizar una etapa de ataque químico en húmedo utilizando 25% grabador HF diluido, para despojar a la capa de óxido enterrada debajo de los voladizos y la capa protectora de óxido en la parte superior de los voladizos.
NOTA: Este paso libera la superficie inferior de las palancas de silicio y también abre una ventana debajo para proporcionar un acceso a sondear el voladizo con el láser. - Enjuague la oblea usando una serie de baños de agua DI y secar cuidadosamente con nitrógeno. Desde los voladizos se apoyan sólo en sus bases, no utilice aerosoles contundentes de agua desionizada o gas inerte directamente en los voladizos.
- Escindir los chips individuales de la oblea a lo largo de las líneas escinden producidos durante el paso de capa de grabado mango.
2. Cell Culture
- Preparar 13F cubreobjetos de acuerdo con métodos publicados previamente 17.
NOTA: Si 13F calarslips no están disponibles, cualquier superficie hidrofóbica con un ángulo de contacto por encima de 95 ° se puede utilizar. - Esterilizar fichas en voladizo y 13F cubreobjetos en una solución de etanol al 70% y dejar secar al aire en una campana de flujo.
- Coloque fichas individuales en voladizo en la parte superior de 13F cubreobjetos interior una placa de estándar de 12.
- Escudo los voladizos con la modificación de biopolímeros o superficie optimizado para el tipo de células que se utilizan de acuerdo con los protocolos estándar de cultivo celular.
- Vuelva a suspender las células en su medio de crecimiento específico a la concentración deseada.
NOTA: Este protocolo se traducirá en un número sustancial de células que caen a través de la ventana en voladizo y no se adhieren a la superficie en voladizo deseado. Por lo tanto, las preparaciones de células se deben hacer 3-4x más concentrada que para las preparaciones cubreobjetos estándar. Por ejemplo, la siembra de las células satélite de músculo esquelético de rata se lleva a cabo típicamente utilizando una densidad de siembra de 500 a 700 células / mm cuadrado 15,16, Y se usan con sustratos en voladizo a 2.000 células / mm cuadrado. Experimentos de optimización deben llevarse a cabo con nuevas fuentes de células para determinar una densidad de siembra apropiada. - Pipetear 200 l de la suspensión celular sobre la superficie del chip en voladizo, asegurando la burbuja de medio cubre las ventanas en voladizo por completo. Si el medio absorbe a través de la ventana y no forma una burbuja estática en la parte superior de las ménsulas reemplazar el cubreobjetos 13F y reintentar el forro.
- Transferir la placa que contiene las fichas a una incubadora y permitir que las células se adhieran durante al menos 1 hora (preferiblemente 2-3 h).
- Después de este período de chapado, el uso de fórceps estériles para transferir el chip a un pocillo limpio, sin un cubreobjetos 13F, y la parte superior de la cultura con 1 ml de medio de crecimiento.
- Volver a la placa de la incubadora.
- Mantener las células de acuerdo con su protocolo estándar para el mantenimiento in vitro en cubreobjetos. Para las células del músculo esquelético,un interruptor de la composición del medio para inducir la formación de miotubos una vez que las células se vuelven confluentes será necesario.
3. Configuración de Hardware y Software para el Análisis Cantilever deflexión
- Colocar una placa de cultivo calentado en la etapa de un microscopio de electrofisiología en posición vertical.
- Añadir 3 ml del medio de alimentación de las células se suspenden en la actualidad (+ 10 mM HEPES) a la platina del microscopio climatizada.
- Montar los electrodos de acero inoxidable en el interior de la placa de cultivo se calentó a una distancia de separación de 15 mm y conectarlos a un generador de impulsos, capaz de producir impulsos de estimulación campo de intensidad variable, frecuencia y forma de onda, para permitir que el sistema para producir la estimulación de campo de las células cuando sea apropiado.
- Perno de un láser de helio-neón, montado en etapas de traslación XY, a la parte inferior de la mesa microscopio y ajustar de modo que el rayo láser se dirige a través de la base de la placa de cultivo se calentó a un ángulo de 30 ° relative al plano del voladizo.
- Atornille un módulo fotodetector cuadrante, montado en etapas de traslación XY, en los bajos de la platina del microscopio y ajuste la posición para que las tierras rayo láser reflejado en el centro de los 4 cuadrantes. Figura 2 proporciona una visión general del hardware configurado necesarios para la aplicación del protocolo descrito.
- Escriba un programa de software para controlar los actuadores lineales que exploran a través de los voladizos. Escribir el programa de software con referencia al diagrama de flujo proporcionado en la Figura 3. La interfaz gráfica programada para su uso con este sistema se proporciona en la Figura 4.
4. grabación Cantilever deflexión de datos
- Encienda el hardware análisis voladizo y el software asociado.
- Inserte el termistor escenario caliente en el medio y esperar a leer 37 ° C.
- Inserte el chip en voladizo en el escenario con el cantilevers orientados hacia el lado derecho del escenario.
- Encienda la fuente de luz del microscopio.
- Enfocar el microscopio para que los bordes de las ménsulas a la vista y utilizar el software de control de láser / fotodetector para posicionar el haz de láser en la punta del cantilever 1. NOTA: Suponiendo que los voladizos están orientados a la derecha del escenario, en voladizo 1 es la una situada en la parte superior izquierda de la matriz y los números se extienden hasta 16 en la parte inferior izquierda. Cantilever 17 está en la posición de arriba a la derecha y corre a 32 en la parte inferior derecha (Figura 5A).
- Pulse el botón "Play" en el software de grabación.
- Coloque el fotodetector para que la señal se lee "0" en ambos x y marcos Y ajustando los motores paso a paso que controlan el fotodetector.
- Establecer voladizo 1 posición en el software de control de láser / foto-detector (Figura 4).
- Mueva el láser a la punta del cantilever 16, repita el paso 4.7., Y establecer cantilever 16 posición en el software de control de láser / foto-detector.
- Mueva el láser a la punta del cantilever 32, repita el paso 4.7., Y establecer en voladizo 32 posición en el software de control de láser / foto-detector.
- Mueva el láser a la punta del cantilever 17, repita el paso 4.7., Y establecer en voladizo 17 posición en el software de control de láser / foto-detector.
- Apague la fuente de luz del microscopio y la luz del techo en el laboratorio.
- Pulse el botón "Grabar" en el software de grabación.
- Configure el hardware generador de impulsos a 40 ms, 5 V pulsos a una frecuencia de 1 Hz, y encender la máquina.
NOTA: De forma opcional, emplean protocolos de estimulación optimizados para fuentes de células específicas en este punto, los ajustes indicados son directrices basadas en datos recopilados utilizando humanos y celulares de roedores fuentes 12,13,15,16. - Usando el software de control de láser / foto-detector, establezca el hardware para explorar a través de la matriz 32 en voladizo, parando durante 5 segundos a cada uno ene.
- Cuando el análisis de los 32 voladizos es completa, apague el estimulador, a continuación, detener el software de grabación y abrir el archivo de datos.
- Examine la traza registrada de cada voladizo para la evidencia de la actividad contráctil. Tome nota de cada voladizo con respuestas positivas. Una contracción se define como un pico si la desviación es de al menos 0,1 V por encima de la línea de base.
- Retire cualquier voladizos que no responden desde el protocolo de exploración en el software de control de láser / foto-detector.
- Los voladizos activos pueden entonces ser analizados de nuevo sin estimulación con el fin de obtener una lectura de la actividad contráctil espontánea de la célula.
- Ejecutar exploraciones con o sin un amplio campo de estimulación eléctrica, después de la adición de un compuesto terapéutico para el medio con el fin de observar su efecto sobre la salida funcional de las células cultivadas.
- Llevar a cabo evaluaciones de la fatiga mediante la estimulación eléctrica de las células durante largos periodos y niveles de exploración de contr actility para medir cuánto tiempo le toma a la fuerza máxima a caer por debajo de un umbral determinado.
- En experimentos en los que las neuronas motoras se mantienen en co-cultivo con músculo, medir la formación de la unión neuromuscular a través del tratamiento de las neuronas motoras en voladizo myotube-co-cultivos con un estimulante neuronal (tales como glutamato) o inhibidor sináptica (por ejemplo, D-tubocurarina) y escaneo para aumentos y disminuciones en la actividad espontánea, respectivamente 16.
- Realizar exploraciones específicas según lo dictado por las necesidades de los experimentos planeados.
5. Análisis de voladizo deflexión de datos
- Uso modificar las ecuaciones de Stoney 15 (detallados a continuación) para convertir datos de deflexión de voladizo en bruto (en voltios) en una lectura de la tensión en la capa de células o myotube (en Pascales), y una medición directa de la fuerza contráctil celular (en nano-Newtons):
ad / 51866 / 51866eq1.jpg "/> la ecuación 1
Ecuación 2 - Donde δ = desviación de la punta en voladizo y el estrés producidos por el myotube, σ c = tensión producida por el myotube, suponiendo una película de espesor uniforme toda la anchura del voladizo, detector C = el coeficiente específico del sistema de tensión relativa a la posición del láser en la foto -detector, θ = el ángulo del láser y el detector con respecto al plano del voladizo, Si = E el módulo elástico de silicio, Si = t Los espesores de las voladizo, t = espesor myotube f, v = relación de Si de veneno de silicio, L = longitud en voladizo, longitud P = ruta de láser desde la punta en voladizo para detector, y w
- Suponiendo que el myotube es una película uniforme, la fuerza en la myotube es igual a la fuerza en la película, lo que lleva a la Ecuación 3, igualando el cálculo de la fuerza de la tensión y el área de sección transversal de células asumido que se utilizó para la aplicación de Stoney de ecuación.
Ecuación 3 - Tras la recogida de datos funcional, fijar los chips en voladizo para el análisis inmunocitoquímico o utilizar las células para análisis de proteína o ADN usando técnicas estándar.
- Opcionalmente, devolver las células a la incubadora en lugar de prepararse para el análisis molecular con el fin de volver a evaluar el rendimiento funcional en un punto de tiempo después.
Ecuación 2 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cultivo con éxito de células contráctiles en voladizos es un procedimiento relativamente sencillo, utilizando técnicas estándar de cultivo de células (Figura 5). El porcentaje de los voladizos soportan células contratantes variará dependiendo del tipo de célula que se examina y técnica de cultivo específica empleada. El uso de células embrionarias de rata primarios derivados de las extremidades posteriores, la actividad contráctil se detectó el 12% de los voladizos examinadas (n = 4). Análisis de la función contráctil usando el sistema de láser y foto-detector descrito proporciona datos precisos en tiempo real relativos a la madurez funcional de las células sembradas. El uso de software electrofisiológico estándar se puede utilizar para analizar los datos en bruto, lo que facilita el cálculo de propiedades funcionales relevantes, tales como la fuerza pico, tiempo hasta el pico de fuerza, y el tiempo para un medio de relajación, como se ilustra en la Figura 7. Recogida de datos subsiguiente a partir de cultivos tratados con compuestos terapéuticos permitecomparación de las propiedades funcionales con y sin la adición del fármaco, permitiendo así la evaluación de la actividad del compuesto y la posterior predicción de respuestas in vivo. Además, los protocolos de estimulación extendidas proporcionan los medios para evaluar las tasas de fatiga en células cultivadas, ampliando así el nivel de los datos fisiológicos que se pueden obtener de este sistema (Figura 8).
La cultura en voladizo puede ser modificado para incluir las neuronas motoras en el sistema de cultivo con miotubos de músculo esquelético 16, a fin de permitir la evaluación de la formación de sinapsis neuromuscular in vitro (Figura 9). En estos cultivos, las tasas de actividad contráctil espontánea se comparan con las tasas de contracción en respuesta al tratamiento con un estimulante específico de neuronas, tales como el glutamato. Cualquier aumento de glutamato inducida observadas en las tasas de contracción sugieren la activación de las neuronas cultivadas, dando lugar a la liberación de acetilcolina y la posterior myoactivación tubo. El tratamiento con inhibidores sinápticos, como el bloqueador del receptor de la acetilcolina D-tubocurarina, conduce a la interrupción de la actividad inducida por el glutamato proporcionar más evidencia de la presencia de las sinapsis neuromusculares funcionales en estos cultivos 16.
Figura 1 Esquema de flujo del proceso de fabricación en voladizo que detalla. Los números que aparecen en el diagrama de flujo se correlaciona con medidas de protocolo en la sección de métodos titulado "fabricación de chips en voladizo." Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Hardwaredetalles del sistema de láser / foto-detector utilizado para evaluar la contracción celular en voladizos. (A) Fotografía del microscopio electrofisiológico modificado utilizado para la evaluación del voladizo. El láser (i) y el fotodetector (ii) se montan debajo del escenario en etapas de traslación XY. Una placa de cultivo transparente se monta en la etapa (iii), que permite el paso a la matriz de láser en voladizo a través de la parte inferior de la etapa. (B) Esquema "top-down" perspectiva de la platina del microscopio. XY etapas de traslación permiten el movimiento del láser y fotodetector, tanto en planos X e Y (flechas rojas), que facilita el movimiento del láser para interrogar a cada voladizo en una matriz. Fichas Cantilever (iii) se deben colocar en el escenario con los voladizos que enfrenta hacia la derecha del escenario para que el sistema funcione correctamente. (C) Cierre de fotografía del láser (i) yfoto-detector (ii) montado debajo de la platina del microscopio. El láser se coloca en un ángulo de 30 ° con respecto al plano del chip en voladizo (θ). (D) Cierre de fotografía de la placa de cultivo. De amplio campo de estimulación eléctrica se aplica por medio de un par de electrodos de plata colocado 15 mm de separación (iv). Un elemento de calentamiento (v) unido a la parte inferior del plato se utiliza para mantener el cultivo a 37 ° C durante el análisis. El control de temperatura es dinámico, y regulada por medio de un termistor colocado en el medio (no se muestra). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Diagrama de flujo de la lógica de software para el control subyacente. escaneado del software dos láser y fotodetector bucles de control de movimiento: un bucle principal de la entrada del usuario y un lazo que controla el movimiento de barrido. Configuración se realiza mientras en el bucle principal, seguido por la activación del segundo bucle por medio de la recolección de datos de alto rendimiento. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. interfaz gráfica de usuario de software utilizado para controlar las posiciones de láser y foto-detector durante la evaluación en voladizo. (A) Botones para controlar manualmente las posiciones de láser y foto-detectores en ambos planos X e Y. (B) los mandos para configurar manualmente las posiciones de las 4 ménsulas de esquina (1, 16, 17, y 32), lo que permite que el softwareextrapolar las posiciones de los voladizos restantes de la matriz. (c) los controles que permite a los usuarios seleccionar que voladizo incluir en cada exploración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Imágenes de un chip en voladizo hecha a la medida para su uso en este sistema, y las imágenes representativas de células mantenidas en superficies similares. (A) Fotografía de un solo chip de voladizo, hecha a la medida. Cada chip contiene 32 voladizos dispuestos en 2 filas de 16 en voladizo 1 se coloca en la parte inferior izquierda de la imagen y en voladizo 32 en la parte superior derecha. Fichas en voladizo son (B) Imagen de contraste de fases de las células del músculo esquelético de rata primaria 15 x 15 mm 2. Cultiva en voladizos. Cada voladizo es de 750 micras de longitud, 100 micras de ancho y 4 m de espesor. (C) tinción inmunocitoquímica de un myotube rata primaria mantenido en un voladizo. Las células se tiñeron utilizando una sonda de anticuerpo de cadena pesada de miosina. Tenga en cuenta el aspecto estriado de la fibra cultivada, lo que indica la maduración de la maquinaria contráctil. Bordes en voladizo se han destacado artificialmente en esta imagen para proporcionar una indicación de la escala. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. esquemático que ilustra los términos usados en las ecuaciones de Stoney para derivar fuerza producida por miotubos en voladizos. Δ = desviación de la punta en voladizo y el estrés producido por la myotube, Cdetector = el coeficiente específico del sistema de tensión relativa a la posición del láser en la foto-detector, θ = el ángulo del láser y el detector con respecto al plano del voladizo, Si = E el módulo elástico de silicio, Si = t los espesores de el voladizo, t f = espesor myotube, v Si = relación del veneno de silicio, la longitud L = voladizo, y la longitud P = ruta de láser desde la punta en voladizo al detector. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. datos brutos representativas y análisis de la forma contráctil mediante el sistema descrito en voladizo. (A) Ejemplo de una traza de datos en bruto de la estimulación eléctrica de amplio campo de miotubos primarios de rata en los voladizos. Top traza = deflexión láser (en voltios) en el eje x, que indica la tensión en el sentido longitudinal en voladizo. Traza Medio = deflexión láser (en voltios) en el eje y, lo que indica la tensión torsional en toda la voladizo. Traza de fondo = Indicación de la posición temporal de los impulsos eléctricos utilizados para provocar la contracción myotube en este sistema. (B) Uso de software de electrofisiología estándar, es posible medir el pico de fuerza (PF), tiempo hasta el pico de fuerza (TTP) y el tiempo medio de relajación (RT media) a partir de los datos en bruto recogido. (C) Clasificadas datos de contracción (n = 11) de miotubos primarios de rata músculo esquelético. Aplicación de la ecuación de una Stoney modificado permite el cálculo de la tensión en voladizo de las lecturas de datos en bruto en Volts. De estos datos, el cálculo directo de la fuerza (en Newtons) también puede ser generada. Los datos publicados reimpresos wpermiso 13 i. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. Los datos representativos que demuestran el análisis de la fatiga muscular esquelético en culturas en voladizo. Los datos en bruto (en voltios) se convierte en una medida de la fuerza myotube (en nano-Newtons) y re-trazado. Los datos ilustran la magnitud de las contracciones miotubo sobre ménsulas en respuesta a 1 Hz pulsos de amplio campo eléctrico después de 0 min (trazo negro) y 120 min (trazo gris) de la estimulación continua. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9. trazas representativas del análisis de un co-cultivo músculo-esquelético motoneuronas mantenido en voladizos, lo que demuestra los efectos funcionales de la estimulación de las neuronas motoras con y sin adición de un bloqueador neuromuscular. Datos en bruto (en voltios) se convirtió en una medición de myotube fuerza (en Newtons nano-) y re-trazado. (A) Medición de las contracciones espontáneas de los miotubos en cultivo sin estimulación neuronal. (B) Medición de la contracción de miotubos después de la estimulación neuronal a través de la adición de 200 mM de glutamato. (C) Medición de la myotube contracción siguiente glutamato y 12,5 mM de tratamiento D-tubocurarina. Los datos publicados reimpresos con permiso 16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las siguientes tablas recogen los reactivos específicos utilizados para cultivar células en los experimentos de validación descritos, así como los equipos necesarios para llevar a cabo la evaluación en voladizo. Tenga en cuenta que los reactivos de cultivo utilizados no son necesarios y este sistema deben ser fácilmente integrados con los protocolos de cultivo de cualquier laboratorio de mantenimiento de las células contráctiles in vitro. Los reactivos enumerados se proporcionan deben investigadores desean repetir los resultados experimentales específicos descritos.
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Discussion
Los pasos críticos en el análisis de voladizos microescala para la evidencia de la contracción celular son la colocación del chip en voladizo dentro de la platina del microscopio, y la posterior alineación del láser y foto-detector con la punta de los voladizos de las esquinas de la matriz. Si esto no se realiza con precisión, entonces el software no será capaz de extrapolar las posiciones de los voladizos restantes en la matriz, que puede conducir a la acumulación de falsos negativos durante la recogida de datos. Los operadores deben tener cuidado para asegurar que el chip en voladizo se ha quedado a ras con la parte inferior de la placa de cultivo antes de calibrar las posiciones de láser. Si el chip se encuentra en un ángulo en el plato, se alterar la trayectoria del haz de láser desviado confundir a la recogida de datos.
Una de mesa de aire funcional debe ser empleado para anular las vibraciones de fondo durante la recolección de datos. El pequeño espesor (aproximadamente 4 micras) de los voladizos utilizado en este estudio provides alta sensibilidad a la actividad contráctil, pero tiene el efecto secundario de aumento de la sensibilidad a las vibraciones. Los operadores deben tener cuidado para moverte por el hardware lo menos posible durante la grabación de datos, para reducir lecturas de fondo. Por último, al colocar el chip en voladizo en el escenario, tener cuidado de asegurarse que el chip no entre en contacto con los electrodos de plata estimulantes en la cultura también. Aplicación de la estimulación de amplio campo con el electrodo de tocar el chip va a alterar la trayectoria de corriente e impactar negativamente en la capacidad del sistema para estimular eficazmente las células cultivadas.
Con el fin de obtener lecturas más precisas de la producción de fuerza en miotubos de músculo esquelético, es muy recomendable realizar la inmunotinción de las células cultivadas análisis funcional una vez se ha completado. Las ecuaciones que figuran requieren entrada del área de sección transversal de un myotube (CSA) para calcular la fuerza. Mientras que un valor supuesto se puede utilizar sobre la base de pla mera existencia de datos, la medición de CSA exacta de un myotube utilizando técnicas de imagen confocal proporcionará una estimación más precisa de la fuerza ejercida por el myotube contratación. Relacionar los datos de contracción primas a las características físicas de la celda en cuestión es valioso en los resultados de la normalización a través de múltiples voladizos y entre condiciones experimentales 15, y por lo tanto crítico para generar predicciones exactas de respuestas tisulares enteros a tratamiento de drogas o la enfermedad. Ecuaciones de Stoney asumen los miotubos examinados abarcan toda la longitud del voladizo por lo que debe hacerse un esfuerzo para incluir sólo los datos obtenidos a partir de células que se ajusten a esta suposición. Si esto no es posible, análisis de elementos finitos se puede utilizar para proporcionar una medición precisa de la fuerza de miotubos más pequeñas según lo publicado previamente 15. Este método analítico es mucho más mano de obra intensiva, y por lo tanto mal adaptado a las aplicaciones de mayor rendimiento, pero puede ser necesario si optimizadocultivos celulares que se ajusten a los supuestos de Stoney no se pueden obtener.
Como ya se ha dicho, los parámetros del cultivo se pueden transferir a partir de preparaciones cubreobjetos estándar. Sin embargo, se recomienda considerar el uso de composiciones de medios libres de suero y sustratos no biológicos para la utilización de este sistema en las aplicaciones de detección de drogas. Debido a la naturaleza indefinida de los sueros de animales, el efecto de nuevas terapias puede ser confundida por la inclusión de dichos aditivos en el medio de cultivo. Formulaciones de medios libres de suero están disponibles tanto para los roedores y cultivos de músculo esquelético humano 18-21 y proporcionar un entorno más controlado y bien definido para llevar a cabo la evaluación compuesto. Del mismo modo, el uso de revestimientos biológicos (colágeno, laminina, etc) en voladizos introduce la variabilidad de las preparaciones de células que se evitan mediante la aplicación de sustratos no biológicos. La deposición de silano monocapas auto-ensambladas en superficies de cultivo se ha demostrado extensively para apoyar la adherencia y desarrollo de múltiples tipos de células 16,18,20,22-31, y representan los medios para generar superficies definidas totalmente de una manera fiable y repetible.
Debido a la gama de células contráctiles presentes en los sistemas de mamíferos, la aplicación de este modelo para los ensayos in vitro es relativamente amplia. Aunque optimizado utilizando células del músculo esquelético, el sistema es potencialmente aplicable a las células musculares lisas y cardiomiocitos, así, proporcionar los medios para llevar a cabo la evaluación rápida de respuesta a la dosis para nuevas terapias en estas células en tiempo real. Fichas voladizo actuales consisten en una serie de 32 voladizos (Figura 5A), pero podrían alterarse fácilmente para incluir muchos más. El análisis de tales matrices produce un número considerable de puntos de datos de una sola cultura, lo que aumenta en gran medida el poder estadístico de las diferencias observadas. Como se evidencia en la Figura 8, las células cultivadasen este sistema de someterse a la fatiga con el tiempo, en respuesta a la estimulación continua de amplio campo, lo que permite la evaluación de efectos del fármaco sobre los niveles de resistencia de las células in vitro. Adición de las neuronas motoras que inervan a este modelo de cultivo también permite la evaluación de la formación de sinapsis mediante la medición de músculo contracción en respuesta a los estimulantes neuronales (Figura 9). Mientras que la medición de los parámetros funcionales de línea de base en un ensayo multiplexado (Figura 7) tiene ventajas obvias sobre evaluación biomolecular estándar de cultivos in vitro, la capacidad de evaluar la funcionalidad neuromuscular y la capacidad de resistencia de las células sembradas aumenta en gran medida la aplicabilidad de este modelo para la detección de drogas y aplicaciones de modelado de la enfermedad. La técnica descrita ofrece a los investigadores los medios para llevar a cabo la evaluación funcional rápida, de bajo costo tanto de las células musculares sanas y enfermas en vitro. La versatilidad del sistema de cultivo, y la hnivel CIB de detalle funcional que se puede obtener a partir del análisis de los datos en bruto, debe producir predicciones más exactas de in vivo respuestas tisulares a nuevos desafíos patológicos y químicos.
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Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional de Salud de subvención números R01NS050452 y R01EB009429. La fabricación de los chips en voladizo se realizó externamente por los colaboradores en el Centro de nanofabricación situado en la Universidad de Cornell. Todos los equipos utilizados en el proceso de fabricación en voladizo se encuentra en esta instalación. Un agradecimiento especial a Mandy Esch y Jean-Matthieu Prot por su colaboración en voladizo microfabricación. Vídeo de animación de la funcionalidad voladizo fue generada por Charles Hughes, Alex y Eric Zelenin Imperiale desde el Laboratorio de Realidad sintética en la UCF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
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