Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen In-vitro-

Das Ziel des folgenden Experiments ist es, die kontraktile Aktivität von kultivierten Muskelfasern als Reaktion auf Stimulation in einer kontrollierten in vitro-Umgebung zu messen. Dies wird erreicht, indem dissoziierte Muskelzellen auf mikroskaligen Silizium-Cantilever plattiert und die Fusion dieser mononukleierten Zellen zu Fasern induziert werden, die als Myoröhren bezeichnet werden. Diese Cantilever-Chips, die differenzierte Muskelzellen unterstützen, werden dann auf ein elektrophysiologisches Mikroskop übertragen, das so modifiziert ist, dass es einen Laser- und Photodetektor unterstützt, der zur Messung der Cantilever-Ablenkung als Reaktion auf die Muskelkontraktion nach dem Platzieren des Chips im Rig verwendet wird.

Der Laser ist so positioniert, dass er auf die Spitze des Cantilevers fokussiert ist, und der Photodetektor ist ebenfalls so ausgerichtet, dass er den abgelenkten Strahl einfängt. Es werden Ergebnisse erhalten, die den Grad der Cantilever-Ablenkung zeigen, die durch Muskelkontraktion als Reaktion auf elektrische oder chemische Behandlung verursacht wird, und eine direkte Messung des Kontraktionsprofils der ausgesäten Zellen in Echtzeit ermöglichen. Letztendlich kann die Auslegerverschiebung verarbeitet werden, um eine Kraftauslesung zu ermöglichen. Dieses System ist gemultiplext, um einen potenziellen Hochdurchsatz-Prüfstand für die Bewertung von Veränderungen der kontraktilen Funktion als Reaktion auf medikamentöse Behandlungs-, Krankheits-, Zustands- oder Trainingsprotokolle bereitzustellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Patch-Clamp-Elektrophysiologie besteht darin, dass diese Methode zur Funktionsanalyse nicht-invasiv und leicht für Hochdurchsatzstudien anpassbar ist. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Arzneimittelentwicklung zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung geeigneter Dosis-Wirkungs-Konzentrationen vor der klinischen Bewertung. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie mehrerer Muskelerkrankungen, da sie die Möglichkeit bietet, die funktionelle Leistung von Zellen aus verschiedenen pathologischen Phänotypen zu untersuchen. In Echtzeit kann diese Methode jedoch Einblicke in Pathologien der Skelettmuskulatur geben.

Es kann auch für andere Gewebesysteme wie Herz- und glatte Muskulatur sterilisierte, zuvor vorbereitete Cantilever-Chips und 13 F Deckgläser in 70%iger Ethanollösung verwendet werden und in einer Strömungshaube an der Luft trocknen lassen. Legen Sie dann einzelne Auslegerchips auf 13 F Abdeckplatten. In einer Standard-12-Well-Platte beschichten Sie die Cantilever mit dem Biopolymer oder der Oberflächenmodifikation, die für den verwendeten Zelltyp optimiert ist. Gemäß den Standard-Zellkulturprotokollen dauert die Oberflächenbeschichtung bei unserer Präparationsmethode 30 Minuten, kann jedoch je nach spezifischem Kulturprotokoll des Prüfarztes geändert werden.

Reese hat die Zellen in ihrem spezifischen Wachstumsmedium auf die gewünschte Konzentration gebracht, dann hundert Mikroliter der Zellsuspension auf die Cantilever-Chip-Oberfläche gegeben, um sicherzustellen, dass die Blase aus Medium die Cantilever-Fenster vollständig bedeckt. Bringen Sie die Platte mit den Chips in einen Inkubator und lassen Sie die Zellen nach dieser Plattierzeit mindestens eine Stunde lang anhaften. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um den Chip in eine saubere Vertiefung ohne 13 F Deckglas zu überführen, und fügen Sie jeweils einen Milliliter Wachstumsmedium hinzu.

Nun, stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator und pflegen Sie die Zellen gemäß ihrem Standardprotokoll für die In-vitro-Wartung. Stellen Sie auf Deckgläsern eine erhitzte Kulturschale auf den Tisch eines aufrecht stehenden Elektrophysiologie-Mikroskops. Geben Sie drei Milliliter des aktuellen Zellnahrungsmediums in das beheizte Mikroskop.

Edelstahlelektroden werden an der Innenseite der beheizten Kulturschale in einem Abstand von 15 Millimetern auf den Tisch montiert. Schließen Sie sie an einen Impulsgenerator an, der in der Lage ist, Feldstimulation zu erzeugen, Impulse unterschiedlicher Intensität, Frequenz und Wellenform, damit das System gegebenenfalls eine Feldstimulation von Zellen erzeugen kann. Schrauben Sie einen Helium-Neon-Laser, der auf XY-Translationstischen montiert ist, an die Unterseite des Mikroskoptisches.

Stellen Sie dann den Laser so ein, dass der Laserstrahl in einem Winkel von 30 Grad relativ zur Ebene des Auslegers durch den Boden der erhitzten Kulturschale geleitet wird. Der nächste Bolzen, ein Quadranten-Photodetektormodul, das auf XY-Translationstischen an der Unterseite des Mikroskoptisches montiert ist. Passen Sie seine Position so an, dass der reflektierte Laserstrahl in der Mitte der vier Quadranten landet.

Schreiben Sie ein Softwareprogramm zur Steuerung der Linearantriebe, die über die Ausleger scannen, unter Bezugnahme auf das im Textprotokoll bereitgestellte Flussdiagramm. Schalten Sie die Hardware für die Cantilever-Analyse und die zugehörige Software ein. Setzen Sie die beheizte Stufe dort mrta in das Medium ein und warten Sie, bis sie 37 Grad Celsius anzeigt.

Setzen Sie dann den Cantilever-Chip in die Bühne ein, wobei die Ausleger zur rechten Seite der Bühne ausgerichtet sind. Schalten Sie die Lichtquelle des Mikroskops ein. Fokussieren Sie das Mikroskop, um die Kanten der Ausleger sichtbar zu machen, und verwenden Sie die Software zur Steuerung des Laser-Photodetektors, um den Laserstrahl auf der Spitze des Auslegers zu positionieren, wobei davon ausgegangen wird, dass die Ausleger rechts vom Tischausleger ausgerichtet sind.

Eine ist diejenige, die oben links im Array positioniert ist, und die Zahlen laufen bis 16 herunter. Unten links. Ausleger 17 befindet sich in der oberen rechten Position und läuft bis 32.

Drücken Sie unten rechts auf Play in der Aufnahmesoftware. Positionieren Sie den Fotodetektor so, dass das Signal sowohl im x- als auch im y-Rahmen Null anzeigt, indem Sie die Schrittmotoren einstellen, die den Fotodetektor steuern. Stellen Sie dann den Ausleger in der Steuerungssoftware für den Laser-Photodetektor um eine Position ein.

Bewegen Sie als Nächstes den Laser zur Spitze des Auslegers 16. Wiederholen Sie die Positionierung des Fotodetektors und stellen Sie die Position des Auslegers 16 in der Steuerungssoftware des Laser-Fotodetektors ein. Bewegen Sie nun den Laser auf die Spitze des Auslegers 32.

Wiederholen Sie die Positionierung des Fotodetektors und stellen Sie die Position des Auslegers 32 in der Steuerungssoftware für den Laser-Fotodetektor ein. Bewegen Sie schließlich den Laser zur Spitze des Auslegers 17. Wiederholen Sie die Positionierung des Fotodetektors und stellen Sie die Position des Cantilevers 17 in der Steuerungssoftware für den Laser-Fotodetektor ein.

Schalten Sie die Lichtquelle des Mikroskops und dann die Deckenleuchte im Labor aus. Drücken Sie die Aufnahmetaste in der Aufnahmesoftware. Stellen Sie die Impulsgenerator-Hardware auf 40 Millisekunden und fünf Volt Impulse ein, was einer Frequenz von einem Hertz entspricht.

Schalten Sie dann das Gerät ein. Stellen Sie die Hardware mit der Steuerungssoftware für Laser-Photodetektoren so ein, dass sie über das 32-Cantilever-Array scannt. Bei jedem Stopp für fünf Sekunden. Wenn der Scan der 32 Ausleger abgeschlossen ist, schalten Sie den Stimulator aus.

Stoppen Sie dann die Aufnahmesoftware und rufen Sie die Datendatei auf. Untersuchen Sie die aufgezeichnete Spur von jedem Ausleger. Zum Nachweis kontraktiler Aktivität.

Eine Kontraktion wird als Peak definiert. Wenn die Auslenkung mindestens 0,1 Volt über der Grundlinie liegt, notieren Sie sich jeden Ausleger mit positiven Antworten. Entfernen Sie alle nicht reagierenden Ausleger aus dem Scanprotokoll der Steuerungssoftware für den Laser-Photodetektor

Die aktiven Cantilever können dann ohne Stimulation erneut gescannt werden, um einen Messwert der spontanen kontraktilen Aktivität der Zellen zu erhalten. Als nächstes fügen Sie dem Medium eine therapeutische Verbindung hinzu, um deren Wirkung auf die funktionelle Leistung der kultivierten Zellen zu beobachten. Nach der Zugabe von zusammengesetzten Laufscans mit oder ohne elektrische Weitfeldstimulation führen Sie Ermüdungsbewertungen durch, indem Sie die Zellen über längere Zeiträume elektrisch stimulieren, gefolgt von einem Scannen der Kontraktilitätsniveaus, um zu messen, wie lange es dauert, bis die Spitzenkraft unter einen bestimmten Schwellenwert fällt.

In Experimenten, in denen Motoneuronen in Co-Kultur mit Muskeln gehalten werden, messen Sie die Bildung neuromuskulärer Verbindungen durch Behandlung von motorischen Neuro-Myo-Tube-Cantilever-Cokulturen mit einem neuronalen Stimulans oder synaptischen Inhibitor und scannen Sie nach Zu- und Abnahmen der spontanen Aktivität, fahren Sie mit der Analyse der Cantilever-Ablenkungsdaten fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Die erfolgreiche Kultivierung kontraktiler Zellen auf Cantilever ist ein relativ unkompliziertes Verfahren unter Verwendung von Standard-Zellkulturtechniken. Elektrophysiologische Standardsoftware kann verwendet werden, um die Rohdaten zu analysieren und die Berechnung relevanter funktioneller Eigenschaften zu erleichtern, wie z. B. die Zeit der Spitzenkraft und die Zeit bis zur Halbrelaxation.

Erweiterte Stimulationsprotokolle bieten die Möglichkeit, die Ermüdungsraten in kultivierten Zellen zu beurteilen und so das Niveau der physiologischen Daten, die mit diesem System gewonnen werden können, zu erweitern. Das Cantilever-Kultursystem kann so modifiziert werden, dass es Motoneuronen in das Kultursystem mit Skelettmuskel-Myotuben einschließt, um eine Beurteilung der neuromuskulären Synapsenbildung in vitro zu ermöglichen. In solchen Kulturen werden die Raten der spontanen kontraktilen Aktivität mit den Kontraktionsraten als Reaktion auf die Behandlung mit einem neuronenspezifischen Stimulans wie Glutamat verglichen.

Jeder beobachtete Glutamat-induzierte Anstieg der Kontraktionsraten deutet auf die Aktivierung kultivierter Neuronen hin, die zur Freisetzung von Acetylcholin und zur anschließenden Aktivierung der Myoröhre führt. Die Behandlung mit synaptischen Inhibitoren wie dem Acetylcholinrezeptorblocker dtu rin, die zur Beendigung der Glutamat-induzierten Aktivität führen, liefert einen weiteren Beweis für das Vorhandensein von funktionellen neuromuskulären Synapsen in diesen Kulturen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mikroskalige Silizium-Cantilever verwenden können, um die funktionellen Eigenschaften von kultivierten Skelettmuskeln zu beurteilen.