Name: Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen In-vitro- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Lernen Sie die Messung der Kontraktionsaktivität kultivierter Muskelfasern mit mikroskaligen Siliziumcantilevern. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen der Muskelphysiologie und Hochdurchsatz-Screenings.

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Diese Forschung wurde von National Institute of Health Zuschuss Zahlen R01NS050452 und R01EB009429 finanziert. Herstellung der Cantilever-Chips wurde von außen durch Mitarbeiter an der Nanofabrication Einrichtung an der Cornell University durchgeführt. Alle Geräte in der freitragenden Herstellungsprozess verwendet wurde in dieser Anlage entfernt. Besonderen Dank an Mandy Esch und Jean-Matthieu Prot für die Unterstützung bei freitragenden Mikrofabrikation. Video-Animation des Auslegers Funktionalität wurde von Charles Hughes, Alex und Eric Zelenin Imperiale aus dem synthetischen Reality Lab an der UCF erzeugt.

1. Freischwinger Chipfertigungs Dargestellten Details der beschriebenen Herstellungsschritte sind in Figur 1 versehen. <ol><li> Platzieren Silicon-On-Insulator (SOI)-Wafer in einem Ofen gebacken und bei 125 ° C für 20 Minuten, um sie zu entwässern. </li><li> Abscheidung einer 1,5 um dicken Schicht aus Siliziumoxid auf den Griff Schicht des entwässerten SOI Wafers unter Verwendung einer Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD)-Tool. </li><li> Platzieren des Wafers auf dem Spin-Coater Futter mit der Vorrichtungsschicht nach oben weist. Sicherzustellen Wafer zentriert Streifen 2 ml P20-Primer auf der Mitte des Wafers und Schleudern bei 3000 Upm für 60 sec bei einer Beschleunigung von 1000 Umdrehungen / sec. P20 Primer fördert die Haftung des Photoresist an der Vorrichtungsschicht. </li><li> Während der Wafer weiterhin auf dem Spin-Coater Futter Streifen 2 ml S1818 Photoresist auf die Mitte des Wafers und Schleudern bei 3000 Upm für 60 sec bei einer Beschleunigung von 1000 Umdrehungen / Sek obtain eine 1,5 um dicke Schicht Photolack. </li><li> Legen Sie die Wafer auf einer heißen Platte und führen Sie einen Soft backen bei 115 ° C für 1 min. </li><li> Durchführen einer harten Kontakt UV Belichtung unter Verwendung einer Photolithographie-Kontaktmaskenausrichter, um das Muster von der Auslegermaske auf den Fotolack auf der Geräteschicht übertragen. Berechnung der Belichtungszeit auf der Grundlage einer Belichtungsenergie von 125 mJ / cm 2 für S1818 Photoresist. </li><li> Entwicklung der Photolack durch Eintauchen der Wafer in einem Fotolack 726 MIF-Entwickler für 1 min unter leichtem Schütteln der Wafer hin und her. </li><li> Spülen Sie die Wafer mit deionisiertem (DI) Wasser und trocknen Sie sie am besten mit einem Spin-rinse Trockner (SRD)-Tool. </li><li> Entfernen des Photoresists von der Kante des Wafers (bis zu 5 mm von der Kante) mit einem Wattestäbchen in Aceton getaucht. </li><li> Laden Sie die Wafer in einer tiefen Reactive Ion Etch (DRIE) Werkzeug, mit dem Photoresist Seite nach oben, und führen Sie ein Rezept, um die strukturierte Siliziumschicht durch die Devi ätzence-Schicht. Die vergrabene Oxidschicht dient als Ätzstopp, so führen eine Ätzung mit 50% bis 100% mehr Zyklen, als erwartet wird erforderlich zu sein, um ein vollständiges Ätzen zu gewährleisten. </li><li> Platzieren des Wafers in einem heißen Bad Photoresistlösung für 20 min, um die Fotolackentfernung. Übertragen Sie die Wafer einem Eilgang-Rinser (QDR), um die Wafer mit DI-Wasser spülen. Nach der Fotolackentfernung, laden Sie die Wafer in einer SRD-Tool zu spülen und trocknen Wafer. Überprüfen Sie die Wafer unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, der Ausleger Muster erscheint, wie erwartet. </li><li> Abscheidung einer 1 um dicken Schicht von undotiertem Siliziumoxid auf der Bauteilschicht des Wafers unter Verwendung eines PECVD-Anlage. Diese Oxidschicht dient als Schutzschicht für die Ausleger während der weiteren Verarbeitungsschritte. </li><li> Platzieren des Wafers auf dem Spin-Coater Spannfutter mit der Griffschicht nach oben, um die Verarbeitung von der Rückseite des Wafers beginnen. Sicherzustellen Wafer zentriert Streifen 2 ml P20-Primer auf der Mitte des Wafers und Schleudern bei 3000 UpMfür 60 Sekunden bei einer Beschleunigung von 1000 U / sec. </li><li> Während der Wafer weiterhin auf dem Spin-Coater Futter Streifen 2 ml SPR220-4.5 Photoresist auf die Mitte des Wafers und Schleudern bei 2000 Upm für 45 sec bei einer Beschleunigung von 1000 Umdrehungen / sec, um eine 6,5 um dicke Schicht zu erhalten, Photoresist. </li><li> Legen Sie die Wafer auf einer heißen Platte Nähe, um eine weiche backen bei 115 ° C für 2 min durchzuführen. </li><li> Mit Hilfe eines Photolithographie Kontakt Ausrichter der Lage, vorne / hinten Ausrichtung, richten Sie die Rückseite Fenster Maske auf der Vorderseite freitragende Muster und führen Sie eine harte Kontakt UV-Exposition, um die Muster von der Rückseite Fenster Maske auf den Photolack auf dem Griff Schicht übertragen. Verwenden Sie eine Belichtungszeit, basierend auf Belichtungsenergiewert von 480 mJ / cm 2 für SPR220-4.5 Photolack berechnet. </li><li> Nach der UV-Belichtung, lassen die Scheiben bleiben in einem dunklen Raum 30 Minuten lang vor dem nächsten Verarbeitungsschritt. </li><li> Entwickeln des Photoresists durch Eintauchen des Wafers inein 726 MIF Photoresistentwickler für 2 min unter leichtem Schütteln der Wafer hin und her. </li><li> Spülen Sie die Wafer mit deionisiertem (DI) Wasser und trocknen Sie sie am besten mit einem Spin-rinse Trockner (SRD)-Tool. </li><li> Platzieren der Wafer in einem Ofen bei 90 ° C für 12 Stunden. </li><li> Ätzen der Silizium-Oxid-Schicht auf der Rückseite des Wafers unter Verwendung eines RIE-System mit fluorierten Gasen und ein Rezept für das Ätzen umfaßt. Die strukturierte Oxid auf der Rückseite des Wafers wirkt als eine Ätzmaske für die weitere Verarbeitung. Untersuchen der Wafer unter dem Mikroskop, um zu gewährleisten, daß das Siliziumoxid in der freiliegenden Fenster vollständig geätzt. </li><li> Entfernen des Photoresists auf dem Rand des Wafers (bis zu 5 mm von der Kante) mit einem Reinraum Tupfer in Aceton getaucht. </li><li> Laden Sie die Wafer in einem DRIE Werkzeug mit und führen Sie ein Rezept, um die strukturierte Griffschicht bis zu einer Tiefe von 500 um mit der vergrabenen Oxidschicht, die als Ätzstopp ätzen. Aufgeteilt in mehrere dieses Etch läuft auf eine übermäßige Erwärmung des zu verhindernWafer, die im Widerspruch Ätzen des Silizium bewirkt. Dieser Ätzschritt entfernt das Silizium unter den Auslegern. </li><li> Durchführen einer nassen Ätzschritt unter Verwendung von 25% verdünnte HF-Ätzmittel, um die vergrabene Oxidschicht unterhalb der Ausleger und die schützende Oxidschicht auf der Oberseite der Kragarme abzustreifen. HINWEIS: Dieser Schritt setzt die untere Oberfläche der Siliziumausleger und öffnet ein Fenster unter einen Zugriff auf den Ausleger mit der Lasersonde ist. </li><li> Spülen der Wafer mit einer Reihe von Wasserbädern DI und sorgfältig mit Stickstoff trocken. Da die Ausleger sind nur an ihrer Basis unterstützt, verwenden Sie keine Sprays kraft DI-Wasser oder Inertgas direkt auf den Auslegern. </li><li> Spalten die einzelnen Chips aus dem Wafer entlang der Schicht während der Griff Ätzschritt hergestellt spalten Linien. </li></ol> 2. Zellkultur <ol><li> Bereiten 13F Deckgläser nach bisher veröffentlichten Methoden 17. HINWEIS: Wenn 13F Buchtrslips nicht verfügbar sind, kann jede beliebige hydrophobe Oberfläche mit einem Kontaktwinkel von über 95 ° verwendet werden. </li><li> Sterilisieren Cantilever-Chips und 13F Deckgläschen in einer 70% igen Ethanollösung und an der Luft trocknen in einem Flow-Haube. </li><li> Zeigen einzelnen Cantilever-Chips auf der Oberseite der Deckgläser 13F in einem Standard-12-Well-Platte. </li><li> Mantel die Ausleger mit dem Biopolymer oder Oberflächenmodifikation für die Zelltyp optimiert wird nach den Standard-Zellkulturprotokolle verwendet. </li><li> Resuspendieren der Zellen in ihrer spezifischen Wachstumsmedium auf die gewünschte Konzentration. HINWEIS: Dieses Protokoll wird bei einer erheblichen Anzahl von Zellen fallen durch die Fenster freitragende und nicht zu der gewünschten Auslegeroberfläche anhaftenden führen. Zellpräparate sollten daher 3-4x konzentrierter als für Standard-Deckglas Vorbereitungen getroffen werden. B. Aussäen von Rattenskelettmuskelsatellitenzellen wird typischerweise unter Verwendung einer Aussaatdichte von 500 bis 700 Zellen / mm ² durchgeführt 15,16Und sind mit Cantilever-Substrate bei 2.000 Zellen / mm ² eingesetzt. Optimierungsversuche sollte mit neuen Zellquellen durchgeführt werden, um eine geeignete Aussaatdichte zu ermitteln. </li><li> Je 200 ul der Zellsuspension auf dem Ausleger Chipoberfläche, wodurch die Blase des Mediums deckt die freitragende Fenster ganz. Wenn das Medium transportiert durch das Fenster und keine statische Ball oberhalb der Ausleger bilden ersetzen 13F Deckglas und erneut versuchen, die Beschichtung. </li><li> Übertragen Sie die Platte mit den Chips in einen Inkubator und damit die Zellen für mindestens 1 Stunde (vorzugsweise 2-3 h) entsprechen. </li><li> Nach diesem Zeitraum Beschichtung, sterile Pinzette, um den Chip zu einer sauberen und die Kultur mit 1 ml Wachstumsmedium zu übertragen, ohne Deckglas 13F und nachfüllen. </li><li> Bringen Sie die Platte in den Inkubator. </li><li> Pflegen Zellen nach ihren Standardprotokoll für die In-vitro-Wartung auf Deckgläsern. Für Skelettmuskelzellen,einen Schalter der Mediumzusammensetzung zu Myotuben Bildung zu induzieren, wenn Zellen konfluent erforderlich. </li></ol> 3. Einrichten von Hardware und Software für Cantileverauslenkung Analyse <ol><li> Legen Sie einen beheizten Kulturschale in die Stufe eines aufrechten Elektrophysiologie Mikroskop. </li><li> 3 ml des Nährmediums werden die Zellen noch in (+ 10 mM HEPES) suspendiert, um die erhitzte Mikroskoptisch. </li><li> Halterung aus Edelstahl-Elektroden auf der Innenseite der erhitzten Kulturschale in einem Abstand von 15 mm und sie an einen Impulsgenerator, fähig zur Herstellung von Feldstimulationsimpulse variierender Intensität, Frequenz und Wellenform, damit das System die Feldstimulation zu erzeugen von Zellen, wenn angemessen. </li><li> Schraube eine Helium-Neon-Laser, auf XY Translationsstufen angebracht sind, die an der Unterseite des Mikroskoptisches und so einstellen, daß der Laserstrahl durch die Basis der erhitzten Kulturschale in einem Winkel von 30 ° gerichtet RelativE auf die Ebene des Auslegers. </li><li> Schraube eine Quadranten-Photodetektormodul, auf XY Translations Stufen montiert, die an der Unterseite des Mikroskoptisches und die Position, so dass der reflektierte Laserstrahl landet in der Mitte der 4 Quadranten. Abbildung 2 gibt einen Überblick über die Hardware einrichten die für die Durchführung des beschriebenen Protokolls. </li><li> Schreiben Sie ein Software-Programm, um die Linearantriebe, die über den Auslegern scannen steuern. Schreiben des Software-Programms mit Bezug auf das Flußdiagramm in Figur 3 versehen. Die für die Verwendung mit diesem System programmiert graphische Schnittstelle ist in Figur 4 vorgesehen. </li></ol> 4. Aufnahme Cantileverauslenkung Daten <ol><li> Schalten Sie den Freischwinger-Analyse-Hardware und der zugehörigen Software. </li><li> Legen Sie die beheizten Bühne Thermistor in das Medium und warten, bis es 37 ° C zu lesen. </li><li> Legen Sie die Cantilever-Chip in die Stufe mit der cantilevers in Richtung der rechten Seite der Bühne ausgerichtet. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop-Lichtquelle. </li><li> Fokussieren Sie das Mikroskop, um die Kanten der Ausleger in den Blick zu bringen und mit dem Laser / Photodetektor Steuerungssoftware, um den Laserstrahl an der Spitze des Auslegers 1. HINWEIS Position: Unter der Annahme, die Ausleger sind auf der rechten Seite der Bühne, Freischwinger 1 ausgerichtet ist die in der oberen linken Ecke des Arrays positioniert und Zahlen laufen auf 16 in der unteren linken. Cantilever 17 ist in der oberen rechten Position und läuft bis 32 in der unteren rechten (5A). </li><li> Drücken Sie "Play" auf der Recording-Software. </li><li> Positionieren des Fotodetektors, so dass der Signalpegel "0" in sowohl x als auch y-Rahmen, indem die Schrittmotoren Steuerung des Photodetektors. </li><li> Set Freischwinger 1 Position in der Laser / Photodetektor Steuersoftware (Abbildung 4). </li><li> Bewegen Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers 16, wiederholen Sie Schritt 4.7., Und legen cantilevER 16 Position in der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware. </li><li> Bewegen Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers 32, wiederholen Sie Schritt 4.7., Und setzen Ausleger 32 Position in der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware. </li><li> Bewegen Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers 17, wiederholen Sie Schritt 4.7., Und setzen Ausleger 17 Position in der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop Lichtquelle und das Deckenlicht im Labor. </li><li> Drücken Sie auf "Record" auf der Recording-Software. </li><li> Stellen Sie den Impulsgenerator Hardware bis 40 ms, 5 V Impulse mit einer Frequenz von 1 Hz, und schalten Sie das Gerät ein. HINWEIS: Optional, beschäftigen optimierte Stimulationsprotokolle für bestimmte Zellquellen an dieser Stelle, die angegebenen Einstellungen sind Leitlinien auf der Basis gesammelter Daten mit Hilfe von Mensch und Nagetier-Zellquellen 12,13,15,16. </li><li> Mit dem Laser / Photodetektor Steuerungssoftware, setzen Sie die Hardware, um über die 32 Freischwinger Array scannen, Anhalten für 5 Sekunden bei jedem aufe. </li><li> Wenn der Scan der 32 Ausleger abgeschlossen ist, schalten Sie den Stimulator, dann stoppen Sie die Aufnahme-Software und bringen Sie die Datendatei. </li><li> Untersuchen Sie die aufgezeichneten Trace von jedem Ausleger zum Nachweis von Kontraktion. Notieren Sie jedes Frei mit positiven Antworten. Einer Kontraktion wird als Peak bezeichnet, wenn die Durchbiegung mindestens 0,1 V über der Basislinie. </li><li> Entfernen Sie alle nicht mehr reagiert Ausleger aus der Scan-Protokoll auf der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware. </li><li> Die aktiven Ausleger können dann ohne Stimulation, um eine Lesung der spontanen Kontraktionsaktivität der Zelle erhalten erneut gescannt werden. </li><li> Führen Scans mit oder ohne weites Feld elektrische Stimulation nach Zugabe einer therapeutischen Verbindung zu dem Medium, um ihre Wirkung auf die funktionelle Leistung der kultivierten Zellen zu beobachten. </li><li> Zuführen Müdigkeit Einschätzungen von elektrischen Stimulation der Zellen über einen längeren Zeitraum und Scanebenen contr actility zu messen, wie lange es dauert, Spitzenkraft unter einen bestimmten Schwellenwert fällt. </li><li> In Experimenten, in denen Motorneuronen in Co-Kultur mit Muskel gehalten wird, zu messen neuromuskulären Verbindungsbildung durch Behandlung von Motoneuronen-Myotuben Ausleger Co-Kulturen mit einem neuronalen Stimulans (wie Glutamat) oder synaptische Inhibitor (zB D-Tubocurarin) und Scannen und Zunahmen und Abnahmen der Spontanaktivität bzw. 16. </li><li> Führen bestimmte Abtastungen, wie durch die Anforderungen der geplanten Experimenten bestimmt. </li></ol> 5. Analyse der Daten Cantileverauslenkung <ol><li> Verwendung modifizierter Stoney-Gleichungen 15 (siehe unten), um rohe Cantileverauslenkung Daten (in Volt) in eine Auslesung der Stress in der Zellschicht oder Myotube (in Pascal) und eine direkte Messung der zellulären Kontraktionskraft (in nano-Newton) zu konvertieren: ad / 51866 / 51866eq1.jpg "/&gt; Gleichung 1 <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="2in" width="300" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq2.jpg"> Gleichung 2 </li><li> Wobei δ = Auslegerspitzenbiegung und Spannung durch die Myotuben hergestellt, σ c = Spannung, die durch die Myotuben hergestellt, unter der Annahme einer gleichförmigen dicken Film über die gesamte Breite des freitragenden, C = der Detektorsystem-spezifischen Koeffizienten in Bezug Spannung der Laserposition auf dem Foto -Detektor, θ = der Winkel der Laser und der Detektor relativ zu der Ebene des Auslegers, E Si = die Elastizitätsmoduls von Silizium, Si t = die Dicke des Auslegers, t f = Myotuben Dicke, V Si = Verhältnis Giftes Silizium, L = Länge Ausleger, P = Weglänge des Lasers von Cantileverspitze zu Detektor und w 6 vorgesehen. </li><li> Angenommen, die Myotuben wird ein gleichmäßiger Film ist die Kraft in der Myotuben gleich der Kraft in dem Film, was zu Gleichung 3 durch Gleichsetzen der Berechnung der Kraft von Stress und die angenommene Zellquerschnittsfläche, die für die Anwendung der Stoney verwendet wurde Gleichung. <img alt="Gleichung 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq3.jpg"> Gleichung 3 </li><li> Folgenden Funktionsdatenerfassung, beheben Cantilever-Chips für immunzytochemische Analyse oder nutzen Zellen für Proteine ​​oder DNA-Analyse unter Verwendung von Standardverfahren. </li><li> Optional liefern die Zellen in den Inkubator statt der Vorbereitung für die molekulare Analyse, um funktionale Leistung zu einem späteren Zeitpunkt, neu zu bewerten. </li></ol>

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<li>Hickman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+pattern+design+for+in+vitro+cellular+networks+using+surface+photochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Scienc.%2C+%26+Technology+A%3A+Vacuum%2C+Surfaces%2C+and+Films%22%5BJournal%5D)">Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry.</a> Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).</li>
<li>Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+rat+embryonic+motor+neurons+in+a+defined+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+progress%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system.</a> Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).</li>
<li>Rumsey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Node+of+Ranvier+formation+on+motor+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro.</a> Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).</li>
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<li>Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+fetal+spinal+cord+stem+cell+line%2C+NSI-566RSC%2C+and+its+induction+to+functional+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).</li>
<li>Varghese, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+target+for+amyloid+beta+toxicity+validated+by+standard+and+high-throughput+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology.</a> PLoS ONE. 5, e8643(2010).</li>
<li>Natarajan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+cardiomyocytes+on+microelectrode+arrays+as+a+functional%2C+high+information+content+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform.</a> Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).</li>
<li>Davis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+Cortical+Oligodendrocyte-Embryonic+Motoneuron+Co-Culture%3A+An+Axon-Oligodendrocyte+Interaction+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomaterials+and+tissue%22%5BJournal%5D)">Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model.</a> Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).</li>
<li>Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+In+Vitro+Feed-Forward+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol+Biomater%22%5BJournal%5D)">Engineered In Vitro Feed-Forward Networks.</a> J Biotechnol Biomater. 3, 2(2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die kritischen Schritte bei der Analyse von Mikrobiegebalken zum Nachweis der zellulären Kontraktion sind die Anordnung der Auslegerchip innerhalb des Mikroskoptisch, und die nachfolgende Ausrichtung des Lasers und Photodetektors mit der Spitze der Ecke Auskragungen in der Anordnung. Wenn dies nicht genau durchgeführt, dann wird die Software nicht in der Lage, die Positionen der übrigen Cantilever in der Anordnung zu extrapolieren, bei der Datensammlung potentiell zu einer Akkumulation von falschen Negativen führen. Die...

Die In-vitro-Kultur von Muskelzellen sowohl aus menschlichen als auch aus Nagetierquellen ist seit Jahrzehnten möglich1,2. Obwohl Standard-Deckglaspräparate für die biochemische Beurteilung nützlich sind, erleichtern sie nicht die Analyse der primären funktionellen Leistung der Zelle (Kontraktilität) und sind daher von etwas begrenztem Wert als Mittel zur Beurteilung der zellulären Reifung und Leistung. Um die Menge der aus solchen In-vitro-Kulturen erhaltenen Daten zu maximieren, ist es notwendig, die Entwicklung von Systemen voranzutreiben, die in der Lage sind, solche Zellen in Konfigurationen unterzubringen, die eine Echtzeitbewertung ihrer funktionellen Leistung ermöglichen. Die Etablierung einer Vielzahl von dreidimensionalen Muskelmodellen hat einige Fortschritte bei der Erfüllung dieses Bedarfs gemacht, und solche Systeme wurden in einer Reihe von Publikationen als Mittel zur Beurteilung der kontraktilen Kapazität von kultivierten Muskelzellen in vitroverwendet 3-5. Während solche Systeme für Gewebemodellierungs- und Rekonstruktionsstudien von unschätzbarem Wert sind, sind sie in ihrer Anwendbarkeit für Studien von Einzelzellantworten begrenzt. In solchen Fällen, in denen Einzelfaserstudien erforderlich sind, bleiben komplexe und arbeitsintensive Ex-vivo-Methoden die einzige Option6-10. Darüber hinaus erfordert die derzeitige Entwicklung komplexer Multiorgan-Plattformen für die Arzneimittelentwicklung und Screening-Protokolle die Etablierung von Systemen, die nicht-invasiv und leicht skalierbar sind und sich leicht in unterstützende Zellen und Gewebemodelle integrieren lassen11. 
Mikroskalige Cantilever bieten eine einfache Methode zur Beurteilung der funktionellen Kontraktionskapazität von Einzelzellen/kleinen Zellpopulationen12,13. Die Technik basiert auf der modifizierten Rasterkraftmikroskopie (Rasterkraftmikroskopie)14 und verwendet ein Laser- und Photodetektorsystem, um die mikroskalige Auslenkung des Cantilevers als Reaktion auf die kultivierte kontraktile Aktivität der Myotuben zu messen. Modifizierte Stoney-Gleichungen werden dann verwendet, um die Spannung im Myotubus und die vom Myotubus ausgeübte Kraft zu berechnen, um die beobachtete Substratablenkung15 zu erzeugen. Es wurde ein Scan-Programm geschrieben, das die gleichzeitige Bewertung von Multiplex-Cantilever-Arrays ermöglicht und potenzielle Anwendungen mit mittlerem bis hohem Durchsatz für Toxizitäts-/Wirksamkeitsstudien von Arzneimitteln bietet15,16. Eine solche Technologie kann sich bei der Entwicklung funktioneller, präklinischer Assays zur Vorhersage der Wirksamkeit von Arzneimitteln in vivo als von unschätzbarem Wert erweisen.Darüber hinaus behindert die Herstellung von Cantilever-Chips in Silizium nicht die Nachanalyse von Zellen für biomolekulare Standardassays wie Immunfärbung, Western Blotting und PCR. 
Dieses Manuskript enthält detaillierte Anweisungen zur Herstellung und Herstellung von mikroskaligen Silizium-Cantilevern, zur Hardware- und Software-Einrichtung und die Betriebsrichtlinien zur Bewertung der Funktionalität von kontraktilen Zellen, die auf diesen Chips kultiviert werden. Standard-Zellkulturtechniken können für die Beschichtung und Pflege von Zellen auf diesen Oberflächen implementiert werden, daher sollte jeder kontraktile Zelltyp, für den zuverlässige Kulturparameter existieren, problemlos in dieses Gerät integriert werden können. Die relativ einfachen 2D-Kulturparameter, die in diesem System verwendet werden, machen die Integration anderer Zellmodelle oder das Hinzufügen von Zelltypen, die mit Muskeln interagieren können (wie z. B. innervierende Neuronen), unkompliziert und erhöhen die Anwendbarkeit dieses Modells bei der Entwicklung komplexerer funktioneller In-vitro-Assays und Multiorganmodelle von Säugetiersystemen erheblich.

<table><tbody><tr><td>Primäres Muskelwachstumsmedium</td><td></td><td></td><td></td>für Ratten</tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>G5-Ergänzung</td><td>Life Technologies</td><td>17503-012</td><td>1x</td></tr><tr><td>Glia-Präparat Neurotropher Faktor</td><td>Zellwissenschaften</td><td>CRG400B</td><td>20 ng/ml</td></tr> Neurotropher <tr><td>Faktor des Gehirns</td><td>Zellwissenschaften</td><td>CRB600B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Ziliärer Neurotropher Faktor</td><td>Zellwissenschaften</td><td>CRC400A</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>Neurotrophin-3</td><td>Zellwissenschaften</td><td>CRN500B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Neurotrophin-4</td><td>Zellwissenschaften</td><td>CRN501B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor</td><td>Life Technologies</td><td>13241-013&nbsp;</td><td>25 ng/ml</td></tr><tr><td>Cardiotrophin-1</td><td>Zellwissenschaften</td><td>CRC700B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Heparinsulfat</td><td>Sigma</td><td>D9809&nbsp;</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Leukämie-Hemmfaktor</td><td>Sigma</td><td>L5158&nbsp;</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Sigma</td><td>V0132</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Primäres Medium</td><td></td><td></td><td></td>zur Differenzierung von Rattenmuskeln</tr><tr><td>NB Activ 4</td><td>Brain Bits LLC</td><td>NB4-500</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klasse 2 roter Diodenlaser</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photo-Detektor</td><td>Noah Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modell 2100 Pulse Stimulator</td><td>A-M-Systeme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B Digitizer</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch-Clamp-Mikroskop und -Tisch</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Delta T4 Kulturschalen-Controller</td><td>Bioptechs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axoskop-Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW-Software</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 oC, 5% CO2 Inkubator</td><td>NAPCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klasse 2 mikrobiologische Durchflusshaube</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetten und Spitzen</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nutzung von microscale siliziumcantilevern to cellular kontraktionsfähigkeit beurteilen in-vitro-

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Die Entwicklung von mehr vorausschauende und biologisch relevanten in-vitro-Tests liegt auf der Weiterentwicklung der vielseitigen Zellkultursysteme, die die funktionelle Beurteilung der gesetzten Zellen zu erleichtern sagt. Zu diesem Zweck bietet Mikrotechnik Ausleger eine Plattform, mit der die Funktionalität der Kontraktions einer Reihe von Zelltypen, einschließlich Skelett, Herz und Zellen der glatten Muskulatur zu messen, durch die Bewertung der Kontraktion induziert Substrat Biegen. Anwendung der gemultiplexten Auslegerarrays stellt die Mittel zur Entwicklung moderaten bis hohen Durchsatz Protokolle zur Beurteilung der Wirksamkeit von Medikamenten und Toxizität, Krankheits-Phänotyp und Progression sowie neuromuskuläre und andere Zell-Zell-Interaktionen. Diese Handschrift enthält die Details zur Herstellung zuverlässiger Cantilever-Arrays für diesen Zweck, und die erforderlich sind, um erfolgreich Kulturzellen auf diesen Flächen Methoden. Weitere Beschreibung über die notwendigen funktionalen anal führen Sie die Schritte vorgesehenlyse von kontraktilen Zelltypen auf solche Arrays mit einem neuartigen Laser-und Foto-Detektor-System gepflegt. Die repräsentativen Daten zur Verfügung gestellt Highlights die Präzision und reproduzierbare Art der Analyse der Kontraktionsfunktion möglich mit diesem System, sowie die breite Palette von Studien, denen solche Technologie kann angewandt werden. Erfolgreiche weit verbreitete Annahme dieses Systems konnten die Ermittler stellen die Mittel, um eine schnelle, kostengünstige funktionelle Studien in vitro durchzuführen, was zu genaueren Vorhersagen von Gewebe Leistung, die Entwicklung der Krankheit und der Reaktion auf neue therapeutische Behandlung.

Erfolgreiche Kultur von kontraktilen Zellen Ausleger ist ein relativ einfaches Verfahren, unter Verwendung von Standard-Zellkulturtechniken (Abbildung 5). Der Anteil der Ausleger unterstützt Vertrags Zellen variiert je nach Zelltyp untersucht und spezifische Kulturtechnik beschäftigt. Verwendung von primären embryonalen Zellen aus Rattenhinterglieder abgeleitet wurden kontraktile Aktivität auf 12% der untersuchten Ausleger erfaßt wird (n = 4). Analyse der Kontraktionsfähigkeit unter Verwendung der besch...

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikro Siliziumcantilevern biegsam Kulturoberflächen zur Messung der Kontraktionskraft der Muskelzellen in vitro. Zellkontraktion bewirkt Cantilever Biege, die gemessen werden können, aufgezeichnet und umgerechnet in die Messwerte von Kraft und bietet eine nicht-invasive und skalierbaren System zur Messung Kontraktionsfunktion in vitro.

Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen In-vitro-

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Das Ziel des folgenden Experiments ist es, die kontraktile Aktivität von kultivierten Muskelfasern als Reaktion auf Stimulation in einer kontrollierten in vitro-Umgebung zu messen. Dies wird erreicht, indem dissoziierte Muskelzellen auf mikroskaligen Silizium-Cantilever plattiert und die Fusion dieser mononukleierten Zellen zu Fasern induziert werden, die als Myoröhren bezeichnet werden. Diese Cantilever-Chips, die differenzierte Muskelzellen unterstützen, werden dann auf ein elektrophysiologisches Mikroskop übertragen, das so modifiziert ist, dass es einen Laser- und Photodetektor unterstützt, der zur Messung der Cantilever-Ablenkung als Reaktion auf die Muskelkontraktion nach dem Platzieren des Chips im Rig verwendet wird.Der Laser ist so positioniert, dass er auf die Spitze des Cantilevers fokussiert ist, und der Photodetektor ist ebenfalls so ausgerichtet, dass er den abgelenkten Strahl einfängt. Es werden Ergebnisse erhalten, die den Grad der Cantilever-Ablenkung zeigen, die durch Muskelkontraktion als Reaktion auf elektrische oder chemische Behandlung verursacht wird, und eine direkte Messung des Kontraktionsprofils der ausgesäten Zellen in Echtzeit ermöglichen. Letztendlich

utilization-microscale-silicon-cantilevers-to-assess-cellular

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Zellen Steifigkeit zu messen. Das allgemeine Prinzip dieser Methode besteht darin, Membranverformung in Reaktion auf wohldefinierte negativen Druck durch eine Mikropipette an die Zelloberfläche aufgebracht messen. Diese Methode bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur biomechanischen Eigenschaften von Substrat-anhaftenden Zellen zu studieren.

Mikropipette Aspiration von Substrat-attached Cells zu schätzen Zelle Stiffness

Dieses Video beschreibt die Messung der Kontraktion der Aorten-Glattmuskelzellen (SMC) mit Hilfe der elektrischen Zell-Substrat-Impedanzmessung (ECIS). ECIS misst die Fortbewegung von Zellen und ist eine zuverlässige Methode zur Messung von Kontraktionen.

Messung der SMC-Kontraktion in vitro: Eine nicht-invasive Methode zur Bewertung der Kontraktion von glatten Muskelzellen mit Hilfe der elektrischen Zell-Substrat-Impedanzmessung

Ein neuartiges Bildgebungsprotokoll wurde entwickelt, das einen speziellen motorbetriebenen mechanischen Aktuator verwendet, um die Messung von Echtzeitreaktionen auf mechanische Dehnung in lebenden Zellen zu ermöglichen. Das für die Mechanobiologie relevante System kann Dehnungen von bis zu 20 % aufbringen und ermöglicht gleichzeitig eine Bildgebung nahezu in Echtzeit mit konfokaler oder Rasterkraftmikroskopie.

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

Hier beschreiben wir die Entwicklung und Anwendung eines Gelkontraktionsassays zur Bewertung der kontraktilen Funktion in mesenchymalen Zellen, die einen epithelial-mesenchymalen Übergang durchlaufen haben.

Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung

Mechanische Kräfte sind wichtig für die Steuerung der Zellmigration. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von elastischen Hydrogelen, die mit einer Glasmikropipette und einem Mikromanipulator verformt werden können, um Zellen mit einem lokalen Steifigkeitsgradienten zu stimulieren, um Veränderungen in der Zellstruktur und Migration hervorzurufen.

Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Schritt für Schritt die Technik der Extraktion und Bewertung der Herzfunktion mit enthäuten Kardiomyozyten zu beschreiben. Diese Methode ermöglicht die Messung und akute Modulation der Myofilament-Funktion mit kleinen gefrorenen Biopsien, die von verschiedenen Herzstellen, von Mäusen bis zu Männern, gesammelt werden können.

In Vitro-Bewertung der Herzfunktion mit gehäuteten Kardiomyozyten

Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der kontraktilen Eigenschaften von gestreiften Muskelmyofibrils mit Nano-Newton-Auflösung vorgestellt. Das Protokoll verwendet ein Setup mit einer Interferometrie-basierten optischen Kraftsonde. Dieses Setup erzeugt Daten mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht die Beurteilung der kontraktilen Kinetik von Myofibrils.

Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

Dieser Beitrag beschreibt eine explantationskulturbasierte Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer, patientenspezifischer humaner Aortenglattmuskelzellen und dermaler Fibroblasten. Weiterhin wird eine neuartige Methode zur Messung der Zellkontraktion und anschließenden Analyse vorgestellt, mit der patientenspezifische Unterschiede in diesen Zellen untersucht werden können.

Isolierung primärer patientenspezifischer glatter Aortenmuskelzellen und semiquantitative Echtzeit-Kontraktionsmessungen in vitro

Diese Arbeit präsentiert ein flexibles Protokoll für die Verwendung von FLECS-Technologie (fluoreszenzmarkierte elastomere kontrahierbare Oberflächen) im Mikrowellenformat zur vereinfachten, freihändigen Quantifizierung von einzelligen kontraktilen Kräften basierend auf visualisierten Verschiebungen fluoreszierender Proteinmikromuster.

Vereinfachte Hochdurchsatzanalyse der Einzelzellkontraktilität mit mikrostrukturierten Elastomeren

Die Funktion der Skelettmuskulatur kann durch die Quantifizierung der Kontraktilität isolierter Muskelfasern beurteilt werden, wobei traditionell mühsame Ansätze mit niedrigem Durchsatz verwendet werden. Hier beschreiben wir eine optikbasierte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung der Kontraktilität von Hydrogel-eingebetteten Muskelfasern. Dieser Ansatz hat Anwendungen für das Wirkstoffscreening und die therapeutische Entwicklung.

Hochdurchsatz-Kontraktionsmessungen von Hydrogel-eingebetteten intakten Muskelfasern der Maus mit einem optikbasierten System

Hier stellen wir ein neuartiges Gerät vor, das isotrope und uniaxiale Dehnungswellenformen auf Zellen anwendet und gleichzeitig Kultur auf Substraten mit abstimmbarer Steifigkeit und anpassbaren Proteinmatrizen unterstützt. Diese einfache, wirtschaftliche Plattform ermöglicht es Forschern, zu untersuchen, wie mechanische Hinweise die zelluläre Funktion sowohl in grundlegenden Studien als auch in krankheitsrelevanten Kontexten regulieren.

Eine neuartige Plattform für in vitro zelluläre Dehnung und Bildgebung

Lernen Sie die Messung der Kontraktionsaktivität kultivierter Muskelfasern mit mikroskaligen Siliziumcantilevern. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen der Muskelphysiologie und Hochdurchsatz-Screenings.

Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen In-vitro-

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