Wir stellen ein in-vitro-Maus fötalen Leber Erythroblasten Kultursystem, das die frühen und späten Stadien der Erythropoese Anschluß seziert. Dieses System erleichtert die funktionelle Analyse von spezifischen Genen in verschiedenen Entwicklungsstadien.
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Methodenartikel
Maus fötalen Leberkultursystem zur Ziel Gen-Funktionen in der frühen und späten Stadien der Klemme Erythropoese Dissect
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Erythropoese beinhaltet ein dynamischer Prozess, der mit engagierten Erythroid-Burst-bildende Einheiten (BFU-E), gefolgt von sich schnell teilenden erythroiden Kolonien bildenden Einheiten (CFU-E) beginnt. Nach CFU-Es sind Zellen morphologisch erkennbar und in der Regel Terminal Erythroblasten bezeichnet. Eine der Herausforderungen bei der Untersuchung der terminalen Erythropoese ist der Mangel an experimentellen Ansätzen, um Genfunktionen in chronologischer Weise zerlegen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einzigartige Strategie Genfunktionen in der frühen und späten Stadien der Erythropoese Endgerät bestimmen. In diesem System wurden Maus fötalen Leber TER119 (reifen Erythrozyten-Zellmarker) negativ Erythroblasten gereinigt und mit exogenen Expression von cDNAs oder kleine Haarnadel RNAs (shRNAs) für die Gene von Interesse transduziert. Anschließend wurden die Zellen in Medium, das außer Erythropoietin (Epo), ihre Vorläuferstufe für 12 Stunden beibehalten, während man die exogene cDNA oder shRNAs Wachstumsfaktoren kultiviertzum Ausdruck zu bringen. Die Zellen wurden auf Epo Medium nach 12 h geändert wurde, um die Zelldifferenzierung und Proliferation zu induzieren, während die exogene genetische Materialien wurden bereits angegeben. Dieses Protokoll ermöglicht Analyse der Genfunktionen in der frühen Stufe der terminalen Erythropoese. Zu spät Terminal Erythropoese zu untersuchen, wurden Zellen sofort in Epo Medium nach Transduktion kultiviert. Auf diese Weise wurden die Zellen bereits mit dem späten Stadium der terminalen Erythropoese unterschieden, wenn die transduzierten genetischen Materialien wurden exprimiert. Wir empfehlen eine allgemeine Anwendung dieser Strategie, die Ihnen helfen zu verstehen, detaillierte Gen-Funktionen in verschiedenen Stadien der Erythropoese Terminal würde.
Einleitung
Erythropoiese ist der Prozess der Differenzierung der multipotenten hämatopoetischen Stammzellen zu reifen Erythrozyten. Dieses schrittweise Verfahren umfasst die Bildung von erythroiden Bursts engagierten bildenden Einheiten (BFU-E), die sich schnell teilende erythroide Kolonien bildenden Einheiten (CFU-E) und morphologisch erkennbaren Erythroblasten 1,2. Terminal Erythropoese von CFU-E-Vorläuferzellen beinhaltet sequentielle Erythropoietin-abhängigen und unabhängigen Stufen 2,3. In der frühen Stufe der terminalen Erythropoese, Erythropoietin (Epo) bindet an seinen Rezeptor auf der Zelloberfläche und induziert eine Reihe von stromabwärts gelege....
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Protokoll
Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der Northwestern University Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt.
1. Herstellung des Kulturmediums
- Bereiten Fibronektin-Lösung. 1 ml Wasser zu einem Fläschchen mit humanem Fibronektin (1 mg). Verlassen Lösung in der Gewebekultur Haube für 30 min ohne Rühren. Dann wird die gesamte Flüssigkeit in 50 ml PBS auf eine Endkonzentration von 20 ug / ml herzustellen und schonend gut mischen. Stellen Sie vor dem Beschichten der Platte (siehe unten) die Fibronektin-Lösung frisch.
- Bere....
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Ergebnisse
Abbildung 1 skizziert die experimentellen Strategien. Das Protokoll besteht aus zwei unabhängige Bedingungen für die Ausrichtung der Funktionen der Signalmoleküle in den frühen und späten Stadien der Erythropoese Terminal. TER119 negativen fötale Leber Erythroblasten wurden aus E13.5 Maus Fötus gereinigt. Durchflusszytometrische Analyse der fötalen Leber erythroiden Zellen vor und nach der Reinigung zeigte, daß die Reinigung effizient war (2A und 2B). Für die frühe Stuf.......
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Diskussion
Hier präsentieren wir ein einzigartiges System chronologisch analysieren Maus fötalen Leber Terminal Erythropoese. Durch die Anwendung der verschiedenen Kulturbedingungen haben wir erfolgreich seziert Terminal Erythropoese in frühen und späten Stadien. Dies ist besonders wichtig, die Mechanismen von Genen mit mehreren Funktionen zu bestimmen. Zum Beispiel spielen Rac GTPasen wichtige Rollen in verschiedenen Stadien der Erythropoese Terminal. Hemmung der Rac GTPasen in der frühen Stufe der terminalen Erythropoese Einflüs.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Diese Studie wurde von NIH R00HL102154 ein American Society of Hematology Scholar Award P Ji unterstützt und.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetales Rinderserum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung | Hyclone | SV30010 | 100x |
| L-Glutamin | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Maus FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Rekombinantes Interleukin-6 (IL-6) der Maus | GEMINI Bio-Produkt | 300-327P | |
| Fibronektin | BD Biosciences | ||
| Rinderserumalbumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% Vorrat an IMDM |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3.000 U/ml Vorrat |
| Streptavidin-Partikel Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylen Rundbodenröhrchen, 5 ml | FALCON |
Referenzen
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L.
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Nachdrucke und Genehmigungen
