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Methodenartikel

Methylnitrosoharnstoff (MNU) induzierten Netzhautdegeneration und Regeneration im Zebrafisch: Die histologische und funktionelle Eigenschaften

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DOI:

10.3791/51909

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20. Oktober 2014

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1Department of Ophthalmology, Inselspital, University of Bern, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Basel, 3Department of Biology, University of Fribourg

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier zeigen wir Quantifizierung der Netzhaut De- und Regeneration und ihre Auswirkungen auf die visuelle Funktion mit N-Methyl-N -nitrosourea im erwachsenen Zebrafisch. Verlust der Sehschärfe und verminderte Photorezeptorzahlen wurden durch Proliferation in der inneren Kernschicht gefolgt. Vollständige morphologische und funktionelle Regeneration aufgetreten 30 Tage nach der ersten Behandlung.

Zusammenfassung

Degenerativer Netzhauterkrankungen, beispielsweise Retinitis pigmentosa, mit daraus resultierenden Schäden Konto Photorezeptor für die Mehrheit der Verlust der Sehkraft in der industriellen Welt. Tiermodelle sind von zentraler Bedeutung, um solche Krankheiten zu studieren. In diesem Zusammenhang wird der Photorezeptor-spezifischen N-Methyl-N-Toxin -nitrosourea (MNU) ist weit verbreitet in Nagetieren verwendet, um pharmakologisch herbeiNetzHautDegeneration. Bisher haben wir eine MNU-induzierte Degeneration der Netzhaut-Modell in der Zebrafisch, ein weiteres beliebtes Modellsystem in der visuellen Forschung etabliert.

Eine faszinierende Unterschied zu den Säugetieren ist die anhaltende Neurogenese im erwachsenen Zebrafisch Netzhaut und ihre Regeneration nach der Beschädigung. Um diese Beobachtung haben wir Sehschärfe Messungen im erwachsenen Zebrafisch eingesetzt quantifizieren. Dabei wurde die optokinetischen Reflex verwendet, um funktionelle Veränderungen in nicht-narkotisierten Fische folgen. Dies wurde mit der Histologie sowie immunhistochemischen staini ergänztng für die Apoptose (TUNEL) und Proliferation (PCNA), die Entwicklungs morphologischen Veränderungen zu korrelieren.

Zusammenfassend, die Apoptose von Photorezeptoren erfolgt drei Tage nach MNU Behandlung, die durch eine deutliche Verringerung der Zellen in der äußeren Körnerschicht (ONL) folgt. Danach wird die Proliferation von Zellen in der inneren Kernschicht (INL) und ONL beobachtet. Hier offenbaren wir, dass nicht nur eine vollständige histologische sondern auch eine funktionelle Regeneration über einen Zeitraum von 30 Tagen auf. Jetzt zu veranschaulichen wir die Methoden zur Quantifizierung und Follow-up Zebrafisch Netzhaut De- und Regeneration mit MNU in einem Video-Format.

Einleitung

Vision ist der wichtigste Sinn für den Menschen und seine Wertminderung hat einen hohen sozioökonomischen Auswirkungen. In der entwickelten Welt sind degenerativer Netzhauterkrankungen die häufigste Ursache für Sehverlust und Erblindung bei älteren Erwachsenen 1. Die Ursache der meisten degenerativen Netzhauterkrankungen ist nur teilweise verstanden und therapeutische Lösungen, um verlorene Vision wieder sehr eingeschränkt. Retinitis pigmentosa ist ein typisches Beispiel einer degenerativen Netzhauterkrankungen mit primären Photorezeptorverlust 2-3. N-Methyl-N -nitrosourea (MNU) induziert Degeneration der Netzhaut und ist deshalb weit verbreitet in Nagetieren verwendet, um Krankheiten mit primären Photorezeptorzelle Tod 4-Modell. Es ist ein Alkylierungsmittel und führt zu gutartigen und bösartigen Tumoren, die in der Regel werden mehrere Monate nach der Belichtung 5-7. Darüber hinaus werden spezifische Photorezeptor Zelltod bewirkt, dass es innerhalb eines kurzen Zeitbeobachtungszeitraum. Dadurch wird der Verlust an retinalen Schicht structure und der wesentlichen Netzhautverdünnung wurden in einer konzentrationsabhängigen Weise beobachtet. Netzhaut-Gliazellen aktiviert wurden, aber keine Änderungen im retinalen Pigmentepithel (RPE) wurden gefunden. Endoplasmatischen Retikulum (ER) Stress-Apoptose scheint der Hauptweg von MNU Aktion in der Netzhaut 8 sein.

Wir haben vor kurzem MNU als chemisches Modell Photorezeptordegeneration im Zebrafisch 9 induzieren. Neben anderen Gründen ist der Zebrafisch (Danio rerio) ist wegen der Ähnlichkeiten der visuellen System zu anderen Wirbeltieren 10 in der visuellen Forschung wichtig. Die äußere Netzhaut enthält den Photorezeptoren, die in vier verschiedenen Zapfentypen mit Spitzenempfindlichkeiten in den ultravioletten, kurze, mittlere und lange Wellenlängen des sichtbaren Spektrums und eine Stange Photorezeptor-Typ gruppiert werden können. In der inneren Körnerschicht (INL) werden die Zellkörper der bipolaren, horizontalen und amacrine Inter gefunden, als well als Zellsoma Müller Gliazellen. In der äußeren plexiformen Schicht (OPL) die synaptischen Kontakte zwischen Photorezeptoren und der inneren Netzhaut gebildet werden, wohingegen die Zellschicht am nächsten an der Linse ist die Ganglienzellschicht (GC), die Bestandteile lange Axone, die den Sehnerv und die Sehbahn bilden . Synaptischen Kontakte zwischen Ganglienzellen und die Zellen in der inneren Kernschicht in der inneren plexiformen Schicht (IPL) 11 ausgebildet sind. Die RPE liegt außerhalb der neurosensorischen Netzhaut und umgibt die Photorezeptoraußensegmente mit langen apikalen Mikrovilli 12. Weiterhin ist die Zebrafisch hoch regenerativen und Verletzungen ist in der Lage, Gehirn, Retina, Rückenmark, Herz und anderen Geweben 13 nachwachsen. Wenn Netzhautschädigung auftritt, Zellen in der INL, die vermutlich Müller Zellen werden aktiviert und das Potential haben, in verschiedenen Netzhautzelltypen zu differenzieren. Darüber hinaus erzeugen sie auch Stange Vorläufern, die in der ONL befinden. Ein weiteres source, die die Netzhaut des erwachsenen Zebrafisch mit neuen Zellen liefert die ciliary Randzone. Diese Quelle ist erforderlich, um eine konstante Dichte der Stäbchen-Photorezeptoren in den kontinuierlich wachsenden Zebrafischauge 14 zu erzielen.

Die MNU-Modell kann als eine einfache und reproduzierbare Degeneration / Regeneration Ansatz für Netzhautgewebe eingesetzt werden. Aufgrund bestimmter Ähnlichkeiten der biologischen Prozesse im Zebrafisch und in den Menschen könnte dies die Türen zu öffnen, sich zu engagieren Zelltod Wege zu identifizieren und mögliche neuroprotektive Medikamente auszusortieren. Basierend auf einer früheren Studie aus unserer Gruppe, jetzt haben wir veranschaulichen die Methoden dieser MNU-induzierte Zebrafisch-Modell der Netzhaut De- und konsequente Regeneration einschließlich funktionelle Veränderungen mit nach Labor Videos 9.

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Protokoll

Alle Versuche der Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen und Vision Research von der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) eingehalten werden.

1. Tiere

  1. Pflegen Sie die Wildtyp-Zebrafisch (Danio rerio) der AB (Oregon) Spannung zwischen 6-12 Monaten unter Standardbedingungen in Wasser mit einer Temperatur von 26,5 ° C und einem 14/10 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus 15 Jahren.
  2. Befolgen Sie die Tierpflege-Richtlinien der beteiligten Institutionen für die Tierversuche nach Genehmigung durch die kantonalen Veterinäramt.

2. MNU-Behandlung

  1. Bereiten Sie Wasser mit 150 mg / L Trockensubstanz von N-Methyl-N -nitrosourea (MNU). VORSICHT! MNU ist giftig; kann Krebs, vererbbare Schäden oder Schädigung des ungeborenen Kindes führen.
  2. Inkubieren Zebrafisch in Wasser, das das MNU für 60 min bei Raumtemperatur.
  3. Schnell mit spülen Zebrafischfrischem Wasser und setzen die Fische in ein neues Aquarium ohne MNU. Pflegen Fisch unter Standardbedingungen, so lange für die Experimente gewünscht.

3. Sehschärfe Mess

  1. Starten Sie den optomotorischen System, wählen Sie "Test" aus dem Menü und die Optionen auf "Simple Treppe", "Acuity (Freq)" und "Randomisierte / Separate" 16.
  2. Installieren Sie eine Infusionsflasche mit 500 ml Wasser gefüllt ca. 1 m über der optomotorischen Systems.
  3. Legen Sie ein Zebrafisch in der Untersuchungskammer und an die Infusionsflasche. Legen Sie die Prüfung Kammer in der optomotorischen Systems.
  4. Starten Sie die Messung und die Augenbewegungen in Echtzeit auf dem Computerbildschirm zu beobachten. Dadurch wird eine positive Antwort ("Ja") als aufeinander folgende Sakkaden in die richtige Richtung definiert, während eine negative Antwort ("nein") stellt zufälligen Augenbewegungen ähnlich wie die mit der Station beobachtet wirdary Gitter. Wenn die Augen der Zebrafisch zeigen drei oder mehr aufeinanderfolgenden optokinetischen Antworten (OKR), drücken Sie "Ja"; Wenn nicht, drücken Sie "Nein".
  5. Extrahieren der Sehschärfe, die durch die Software durch Bestimmen der Schwelle der Raumfrequenz des optokinetischen Stimulus unter "Ergebnisse" im Menü berechnet wurde.

4. Histologie

  1. Einschläfern Der Zebrafisch durch eine Überdosis von Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat- (200-300 mg / L) und entkernen Sie die Augen.
  2. Fixierung der ganzen Augen in 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 4 ° C für 12 h und dann Dehydratisierung der Proben in einer abgestuften Alkoholreihe.
  3. Einbetten der Proben in Paraffin, schneiden 5 um Schnitte durch den Sehnervenkopf (Papille) und montieren sie auf einen Glasobjektträger.
  4. Färben die deparaffized Paraffinschnitten mit Hämalaun für 4 min und tauchen die Dias zweimal in destilliertem Wasser, gefolgt von 0,2% iger acid und 0,8% Ammoniak. Färben die Schnitte mit Eosin für 3 min nach der Entwicklung der Hämalaun-Färbung in Leitungswasser für mindestens 10 min (H & E).
  5. Betten Sie die Folien in dehydriert Montagemedium und unter dem Lichtmikroskop beobachten die Folien.

5. Immunhistochemie

  1. Desoxyribonukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL)
    1. Inkubiere die entparaffinierten Schnitte mit 20 ug / ml Proteinase K bei Raumtemperatur für 15 min. Dreimal mit Tris waschen Sie die Abschnitte Kochsalzlösung (TBS) für jeweils 5 min.
    2. In einer feuchten Kammer inkubieren die Abschnitte mit 50 ul TUNEL Reaktionsmischung (10% Markierungslösung und 90% Enzym-Lösung) bei 37 ° C für 60 min. Dreimal waschen mit TBS für jeweils 5 min.
    3. Montieren Sie die Folien mit Montage-Medium mit DAPI und unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten die Folien.
  2. Wuchernden Cell Nuclear Antigen (PCNA) Färbung
    1. Man kocht die entparaffiniert Abschnitte in Antigen-Retrieval-Puffer (Tris-EDTA + 0,05% Tween 20, pH 9,0) für 3 min und dreimal mit TBS für jeweils 5 min. Block mit 100 ul Blockierungslösung (TBS + 10% Ziegennormalserum + 1% Rinderserumalbumin, pH 7,6) bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
    2. Fleck mit Anti-PCNA primäre Antikörper in einer 1: 200-Verdünnung in einer befeuchteten Kammer bei 4 ° C über Nacht. Dreimal für je 5 min waschen mit TBS + Tween 20.
    3. Beenden Sie die Erkennung mit den entsprechenden Sekundärantikörper in einer 1: 500-Verdünnung bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
    4. Montieren Sie die Folien mit Montage-Medium mit DAPI und unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten die Folien.

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Ergebnisse

Sehschärfe:

Der Versuchsaufbau [Ortsfrequenz: 0,042 Kreise / Grad (C / D); Kontrast: 100%; Driftgeschwindigkeit: 20 Grad / Sekunde (d / src); Hintergrundbeleuchtung Helligkeit: 152 cd / m 2] der Studie aktiviert OKR Beurteilung der erwachsenen Zebrafisch. Die mittlere Dauer der VA Messung war etwa 5 - 10 Minuten für jeden Zebrafisch, die das Verfahren gut vertragen. Sehschärfe vor MNU Exposition war 0,577 ± 0,014 Zyklen / Grad (c / d). Abbildung 1 zeigt den Verlau...

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Diskussion

Bisher hat unsere Gruppe die MNU Modell der Photorezeptordegeneration von Nagetieren in den Zebrafisch-System 9 übertragen. Die folgenden Ereignisse wurden beschrieben und anschließend für bis zu 30 Tage. In dieser Zeit trat vollständige Netzhaut morphologischen Degeneration und Regeneration nach der ersten Behandlung. Erstens zeigt die Histologie eine reduzierte Stange Zellzahl von Tag 3 auf mit einem Minimum an Tag 8. Entsprechend identifiziert TUNEL-Färbung Apoptose von Stäbchen-Photorezeptoren 3 Tage nach...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Monika Kilchenmann, Federica Bisignani und Agathe Duda für ihre hervorragende technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EssigsäureSigma-Aldrich, Buchs, SchweizA6283
AmmoniakSigma-Aldrich, Buchs, Schweiz2949930,80
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz05470
Dako PenDako, Glostrup, DanmarkS2002
DAPI EindeckmediumVector Labs, Burlingame, CA, USAH-1200
EosinSigma-Aldrich, Buchs, Schweiz45260
EthanolSigma-Aldrich, Buchs, Schweiz2860100%, 96%, 70%
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Sigma-Aldrich, Buchs, SchweizED
Ethyl-3-aminobenzoat-MethansulfonatsalzSigma-Aldrich, Buchs, SchweizE10521Tricain
EukittSigma-Aldrich, Buchs, Schweiz3989
Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa 594Life Technologies, Zug, Schweiz A11012
Normales Serum für ZiegenDako, Glostrup, DänemarkX0907
SalzsäureSigma-Aldrich, Buchs, Schweiz3203310,20
In situ Kit zur Feststellung des ZelltodsRoche Applied Sciences, Rotkreuz, Schweiz11684795910TUNEL Kit
Mayer's Hämalum LösungMerck, Darmstadt, Deutschland109249
Methylnitrosourea (MNU)Sigma-Aldrich, Buchs, SchweizN4766Toxische
OptoMotryCerebralMechanics, Lethbridge, AB, Kanadan.a.Paraformaldehyd
(PFA)Sigma-Aldrich, Buchs, SchweizP6148
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma-Aldrich, Buchs, SchweizP5368
Proteinase KDako, Glostrup, DanmarkS3004
Kaninchen Anti-PCNA Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USAsc-33756
Superfrost Plus ObjektträgerGehard Menzel GmbH, Braunschweig, Deutschland10149870
Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS)Sigma-Aldrich, Buchs, SchweizP5912
Trizma baseSigma-Aldrich, Buchs, SchweizT1503
Tween 20Sigma-Aldrich, Buchs, SchweizP1379
XylolSigma-Aldrich, Buchs, Schweiz534056
Zebrafisch (Danio rerio) AB (Oregon) StammUniversität Fribourg, Abt. für Biologien.a.EigeneFischanlage
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Referenzen

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