Hier zeigen wir Quantifizierung der Netzhaut De- und Regeneration und ihre Auswirkungen auf die visuelle Funktion mit N-Methyl-N -nitrosourea im erwachsenen Zebrafisch. Verlust der Sehschärfe und verminderte Photorezeptorzahlen wurden durch Proliferation in der inneren Kernschicht gefolgt. Vollständige morphologische und funktionelle Regeneration aufgetreten 30 Tage nach der ersten Behandlung.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Methylnitrosoharnstoff (MNU) induzierten Netzhautdegeneration und Regeneration im Zebrafisch: Die histologische und funktionelle Eigenschaften
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Degenerativer Netzhauterkrankungen, beispielsweise Retinitis pigmentosa, mit daraus resultierenden Schäden Konto Photorezeptor für die Mehrheit der Verlust der Sehkraft in der industriellen Welt. Tiermodelle sind von zentraler Bedeutung, um solche Krankheiten zu studieren. In diesem Zusammenhang wird der Photorezeptor-spezifischen N-Methyl-N-Toxin -nitrosourea (MNU) ist weit verbreitet in Nagetieren verwendet, um pharmakologisch herbeiNetzHautDegeneration. Bisher haben wir eine MNU-induzierte Degeneration der Netzhaut-Modell in der Zebrafisch, ein weiteres beliebtes Modellsystem in der visuellen Forschung etabliert.
Eine faszinierende Unterschied zu den Säugetieren ist die anhaltende Neurogenese im erwachsenen Zebrafisch Netzhaut und ihre Regeneration nach der Beschädigung. Um diese Beobachtung haben wir Sehschärfe Messungen im erwachsenen Zebrafisch eingesetzt quantifizieren. Dabei wurde die optokinetischen Reflex verwendet, um funktionelle Veränderungen in nicht-narkotisierten Fische folgen. Dies wurde mit der Histologie sowie immunhistochemischen staini ergänztng für die Apoptose (TUNEL) und Proliferation (PCNA), die Entwicklungs morphologischen Veränderungen zu korrelieren.
Zusammenfassend, die Apoptose von Photorezeptoren erfolgt drei Tage nach MNU Behandlung, die durch eine deutliche Verringerung der Zellen in der äußeren Körnerschicht (ONL) folgt. Danach wird die Proliferation von Zellen in der inneren Kernschicht (INL) und ONL beobachtet. Hier offenbaren wir, dass nicht nur eine vollständige histologische sondern auch eine funktionelle Regeneration über einen Zeitraum von 30 Tagen auf. Jetzt zu veranschaulichen wir die Methoden zur Quantifizierung und Follow-up Zebrafisch Netzhaut De- und Regeneration mit MNU in einem Video-Format.
Einleitung
Vision ist der wichtigste Sinn für den Menschen und seine Wertminderung hat einen hohen sozioökonomischen Auswirkungen. In der entwickelten Welt sind degenerativer Netzhauterkrankungen die häufigste Ursache für Sehverlust und Erblindung bei älteren Erwachsenen 1. Die Ursache der meisten degenerativen Netzhauterkrankungen ist nur teilweise verstanden und therapeutische Lösungen, um verlorene Vision wieder sehr eingeschränkt. Retinitis pigmentosa ist ein typisches Beispiel einer degenerativen Netzhauterkrankungen mit primären Photorezeptorverlust 2-3. N-Methyl-N -nitrosourea (MNU) induziert Degeneration der Netzhaut und ist deshalb weit v....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle Versuche der Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen und Vision Research von der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) eingehalten werden.
1. Tiere
- Pflegen Sie die Wildtyp-Zebrafisch (Danio rerio) der AB (Oregon) Spannung zwischen 6-12 Monaten unter Standardbedingungen in Wasser mit einer Temperatur von 26,5 ° C und einem 14/10 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus 15 Jahren.
- Befolgen Sie die Tierpflege-Richtlinien der beteiligten Institutionen für die Tierversuche nach Genehmigung durch die kantonalen Veterinäramt.
2. MNU-Behandlung ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Sehschärfe:
Der Versuchsaufbau [Ortsfrequenz: 0,042 Kreise / Grad (C / D); Kontrast: 100%; Driftgeschwindigkeit: 20 Grad / Sekunde (d / src); Hintergrundbeleuchtung Helligkeit: 152 cd / m 2] der Studie aktiviert OKR Beurteilung der erwachsenen Zebrafisch. Die mittlere Dauer der VA Messung war etwa 5 - 10 Minuten für jeden Zebrafisch, die das Verfahren gut vertragen. Sehschärfe vor MNU Exposition war 0,577 ± 0,014 Zyklen / Grad (c / d). Abbildung 1 zeigt den Verlau.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Bisher hat unsere Gruppe die MNU Modell der Photorezeptordegeneration von Nagetieren in den Zebrafisch-System 9 übertragen. Die folgenden Ereignisse wurden beschrieben und anschließend für bis zu 30 Tage. In dieser Zeit trat vollständige Netzhaut morphologischen Degeneration und Regeneration nach der ersten Behandlung. Erstens zeigt die Histologie eine reduzierte Stange Zellzahl von Tag 3 auf mit einem Minimum an Tag 8. Entsprechend identifiziert TUNEL-Färbung Apoptose von Stäbchen-Photorezeptoren 3 Tage nach.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken Monika Kilchenmann, Federica Bisignani und Agathe Duda für ihre hervorragende technische Unterstützung.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Essigsäure | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | A6283 | |
| Ammoniak | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | 294993 | 0,80 |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI Eindeckmedium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | ED | |
| Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | E10521 | Tricain |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | 3989 | |
| Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Schweiz | A11012 | |
| Normales Serum für Ziegen | Dako, Glostrup, Dänemark | X0907 | |
| Salzsäure | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | 320331 | 0,20 |
| In situ Kit zur Feststellung des Zelltods | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Schweiz | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's Hämalum Lösung | Merck, Darmstadt, Deutschland | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | N4766 | Toxische |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Kanada | n.a.Paraformaldehyd | |
| (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | P6148 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Kaninchen Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus Objektträger | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Deutschland | 10149870 | |
| Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | P5912 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | P1379 | |
| Xylol | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | 534056 | |
| Zebrafisch (Danio rerio) AB (Oregon) Stamm | Universität Fribourg, Abt. für Biologie | n.a.Eigene | Fischanlage |
Referenzen
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, a....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
