Ein Verfahren zur Mikroinjektion von Patiria Minata Zygotes

Zusammenfassung

Methoden, die morphanten Embryonen sind unerlässlich, um Entwicklungsmechanismen und Gen-regulatorische Netzwerke zu studieren. Das Sea Star Patiria miniata ist ein aufstrebendes Modellsystem für diese Studien. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Erhalt von Gameten erzeugende Kulturen von Embryonen und schnelle Mikroinjektion von Zygoten von dieser Spezies.

Zusammenfassung

Stachelhäuter haben lange für die Untersuchung von Gen-Regulation und Evolution von Entwicklungsprozessen ein beliebtes Modellsystem für die Untersuchung der Fortpflanzung und Entwicklung, und in jüngerer Zeit. Das Sea Star, Patiria miniata, gewinnt Prävalenz als Modellsystem für diese Art von Studien, die bisher fast ausschließlich in den Seeigel, Strongylocentrotus purpuratus und Lytechinus variegatus durchgeführt wurden. Ein Vorteil dieser Modellsysteme ist die Leichtigkeit der Herstellung von modifizierten Embryonen, bei denen ein bestimmtes Gen ist nach oben oder unten reguliert, Markierung einer Gruppe von Zellen, oder Einführen eines Reportergens. Eine einzelne Mikroinjektionsverfahren ist in der Lage eine Vielzahl von solchen modifizierten Embryonen. Hier stellen wir ein Verfahren zur Gewinnung von Gameten aus P. miniata, Herstellung Zygoten, und die Einführung von störenden Reagenzien über die Mikroinjektion. Gesunde morphanten Embryonen werden anschließend für die quantitative und qualitative Studien von GE isoliertne Funktion. Die Verfügbarkeit von Genom und Transkriptom Daten für diesen Organismus die Arten von Untersuchungen, die durchgeführt werden und die Leichtigkeit der Ausführung von ihnen erhöht.

Einleitung

Das Sea Star, Patiria miniata, (allgemein als die Fledermaus Stern) ist als eine interessante und vielseitige Modellsystem Schwellen für eine Vielzahl von Mobil ^1-3, Entwicklungs ^4,5, Evolutions ^{6 bis 8} und ^{9 bis 11} ökologische Studien. Erwachsene P. miniata entlang der Pazifikküste von Sitka, Alaska nach Baja, Kalifornien ¹² verteilt sind und leicht in Meerwasseraquarien gehalten. Eizellen sind erhältlich jährig und jedes Weibchen kann Zehntausende von Eiern zu vergießen. Eizellen sind leicht gereift und außen ¹³ befruchtet. Die daraus resultierenden Embryonen sind durchsichtig erlau....

Protokoll

Bewahren Sie alle Meerwasser oder künstlichem Meerwasser (SW), erwachsenen Tieren und Kulturen bei 15 ° C, so viel wie praktisch. Stellen Sie sicher, Eier und Zygoten sind in SW eingetaucht gehalten.

Kommerziell hergestellte Meersalz mit destilliertem oder Umkehrosmose Wasser wiederhergestellt dient auch als Quelle der SW. Überprüfen Sie den Salzgehalt mit einem Hydrometer und stellen Salze oder Wasser, um ein optimales Niveau zu erreichen. Halten spezifische Gewicht Niveaus zwischen 1,020 bis 1,025. Bewahren Sie alle Glas-und Kunststoffprodukte getrennt von dem übrigen Laborgeräte, um eine Kontamination mit Chemikalien zu vermeiden. Embr....

Ergebnisse

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Reagenzien in Embryonen vor. Wir zeigen die Wirksamkeit des Protokolls durch die Injektion eines DNA-Reporterkonstrukt, das die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) antreibt. Injizierten Embryonen exprimieren GFP in klonalen Patches (4A-B), da die DNA enthält im frühen Spaltung. Viele Reagenzien, die wünschenswert, in Embryonen einzuführen sind, sind in hohen Mengen und zu suboptimalen Chargen von Embryonen toxisch. Toxizität manifestiert durch Verzögeru.......

Diskussion

Es gibt zwei wichtige Schritte, die schwierig für unerfahrene Anwender dieser Technik sind aber unerlässlich für die erfolgreiche Schaffung morphanten Embryonen. Die erste ist die Auswahl gesunder Eizellen, die reifen und richtig düngen wird. Der Prozentsatz der normalen Entwicklung in einer Kultur hängt von der Jahreszeit, der Gesundheit des Tieres, und die Anzahl der Male, die Oozyten wurden aus einem einzigen Individuum geerntet. Eizellen sind in der Regel von besserer Qualität von April bis Oktober. Es ist wichtig, .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1-Methyladenin	Acros Organics (Fisher Scientific)	AC20131-1000
190 Mikron Nitex Nylon Filter	Kleinteile (ursprünglich Sefar)	CMN-0185-C/5PK-05
100 Mikron Nitex Nylon Filter	Kleinteile (ursprünglich Sefar)	CMN-0105-C/5PK-05
Petrischalen aus Polystyrol, 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Kapillarschlauch	FHC, Inc	30-30-0	Zum Ziehen von Mikroinjektionsnadeln
Modell P-97 Nadelabzieher	Sutter Instruments	P-97
Dextran, Rhodamin Green	Life Technologies	D7163	Bei der Injektion eines GFP-Expressionsreporters ist es hilfreich, Texas Red Dextran als Injektionstracer zu ersetzen
Instant Ocean Sea Salt	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Auch in vielen Zoohandlungen erhältlich
Microloader Spitzen	Eppendorf	5242 956.003