Die Aufzeichnung von Ca2+-Strömen an der präsynaptischen Freisetzungsgesichtsmembran ist der Schlüssel zu einem präzisen Verständnis des Ca2+-Eintritts und der Neurotransmitterfreisetzung. Wir präsentieren eine akute Dissoziation des Neunauge-Rückenmarks, die funktionelle isolierte retikulospinale Axone liefert, die eine Aufzeichnung direkt von der Freisetzungsgesichtsmembran einzelner präsynaptischer Endungen ermöglichen.
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Methodenartikel
Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Synaptischen Übertragung ist ein extrem schnelles Verfahren. Aktionspotential angetrieben Einstrom von Ca 2 + in den präsynaptischen Terminal durch spannungsabhängige Kalziumkanäle (VGCCs) in der Trennfläche Membran befindet, ist der Auslöser für die Fusion von Vesikeln und die Freisetzung von Neurotransmittern. Entscheidend für die Schnelligkeit der synaptischen Übertragung ist die räumliche und zeitliche Synchronität zwischen der Ankunft des Aktionspotentials, VGCCs und der Neurotransmitter-Freisetzung Maschinen. Die Möglichkeit, direkt aufzeichnen Ca2 + Ströme von der Trennfläche Membran der einzelnen präsynaptischen ist zwingend notwendig für eine genaue Verständnis der Beziehung zwischen präsynaptischen Ca2 + und die Freisetzung von Neurotransmittern. Zugang zu der präsynaptischen Membran Trennfläche für elektrophysiologische Aufzeichnung ist nicht verfügbar in den meisten Präparaten und präsynaptischen Ca2 +-Eintrag wurde mit bildgebenden Techniken und makroskopischen Strom MeasureMe gekennzeichnetNTS - Techniken, die nicht über ausreichende zeitliche Auflösung zu Ca 2 +-Eintrag zu visualisieren. Die Charakterisierung der VGCCs direkt an einzelnen präsynaptischen war nicht in zentralen Synapsen möglich und wurde bisher erfolgreich nur in der Kelch-Typ-Synapse des Kükens Ciliarganglion und in Ratten Kelche erreicht. Wir haben erfolgreich in der Riesensynapse retikulospinale der Neunauge Rückenmark durch die Entwicklung einer akut dissoziierten Vorbereitung des Rückenmarks, die isoliert retikulospinale Axone mit funktionellen präsynaptischen frei von postsynaptischen Strukturen ergibt adressiert dieses Problem. Wir können fluoreszenzkennzeichnen und zu identifizieren einzelnen präsynaptischen und Ziel sie für die Aufnahme. Mit dieser Vorbereitung, wir haben VGCCs direkt an der Trennfläche der einzelnen präsynaptischen Enden mittels Immunhistochemie und Elektro Ansätze aus. Ca 2 + Ströme wurden direkt an der Trennfläche Membran o aufgezeichnetf einzelnen präsynaptischen Terminals, die erste derartige Aufnahme an zentralen Synapsen durchgeführt werden.
Einleitung
Synaptischen Übertragung ist eine extrem schnelle und präzise Prozess. Aktionspotential Invasion der präsynaptischen Terminal führt zum Öffnen VGCCs in der Trennfläche Membran, die daraus resultierende Erhöhung der präsynaptischen Ca2 + als Auslöser für die Fusion von Vesikeln und die Freisetzung von Neurotransmittern 1 wirkenden entfernt. Alle diese Schritte werden innerhalb von hundert Mikrosekunden 2, und erfordern daher enge räumliche Kopplung von VGCCs auf die Fusion von Vesikeln Maschinen 3. Präsynaptischen Ca2 + Flüsse wurden in erster Linie durch bildgebende Ansätze mit Ca2 +-sensitiven Farbsto....
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Protokoll
1. Herstellung von Poly-D-Lysin-Hydrobromid
- Vorbereitung 1 mg / ml Poly-D-Lysin-Hydrobromid in 0,1 M Boratpuffer (pH 8,5).
- Aliquoten und bei -20 ° C.
2. Poly-Lysin-Beschichtung von Deckgläser
Hinweis: Führen Sie alle Reinigungs und Beschichtungsschritte in einer laminaren Strömungskammer.
- Deck Ort in eine Petrischale mit 1 N Salzsäure (HCl) für 2 Stunden.
- Saugen Sie alle HCl und spülen mit 70% Ethanol (EtOH) 2-3 x.
- Lassen Sie in 70% EtOH für 1 Stunde.
- Saugen Sie alle 70% EtOH und spülen Sie mit 100% EtOH 2-3x.
- Lassen Sie in 100% EtOH....
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Ergebnisse
Diese Dissoziation Protokoll Erträge gesunde und funktionelle isoliert retikulospinale Axonen frei von Projektionen postsynaptischen 2f, die aber dennoch behalten funktionellen präsynaptischen Enden der Lage, hervorgerufen synaptischen Vesikel Exo-und Endozytose 4c und 4d. Abschnitte der isolierten Regionen der retikulospinale Axone kann unter Lichtmikroskopie eindeutig identifiziert werden klar von anderen neuronalen Prozesse ermöglicht uneingeschränkten Zugriff auf da.......
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Diskussion
Unsere Dissoziation Protokoll ist durch Abgabe isoliert retikulospinale Axonen frei von Projektionen postsynaptischen 2f signifikant, aber dennoch funktionellen präsynaptischen 4c und 4d zu behalten. Das Fehlen von postsynaptischen Prozesse gegen die präsynaptischen Terminal ermöglicht den direkten Zugriff auf die Aufnahme der präsynaptischen Membran Trennfläche bei Einzel präsynaptischen Terminals, die zuvor in zentralen Synapsen nicht möglich ist und in nur zwei präsy.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt von NINDS, RO1NS52699 und MH84874 to SA.
Wir möchten Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) dafür danken, dass er uns den Nahtkleber zur Verfügung gestellt hat, der in der immunhistochemischen Arbeit verwendet wurde. Wir danken Michael Alpert für seine Kommentare und das Korrekturlesen des Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,2 &Mikro; m Spritzenvorsatzfilter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Deckgläser | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Frostschutzmittel | Prestone | ||
| Borsäure | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Hellfeld-Lichtquelle | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Calciumchlorid | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Kollagenase Typ IA aus Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Deckglas | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Digitale CCD-Kamera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Präparierzange feine Zange | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Präparierzange | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Seziermikroskop | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Sezierschere | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Sezierschere fein | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Sezierschere ultrafein | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Glycin | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Hochvakuumfett | Dow-Corning | ||
| Salzsäure | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Tauchöl | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Stickstoffgastank in Industriequalität | Praxair | UN1066 | |
| Insektenstifte | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Flüssiger Nahtkleber | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | Der Nahtkleber, den wir in unseren Experimenten verwendet haben, wurde uns von einem anderen Labor zur Verfügung gestellt. Es wird nicht mehr hergestellt. Wir haben einen Histoacryl-Nahtkleber für die zukünftige Verwendung von Aesculap (Ts1050071FP) beschafft |
| Magnesiumchlorid | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| Fettfreie Trockenmilch | Cell Signaling Technology | 9999S | |
| P-87 Mikropipettenabzieher | Sutter Instruments | ||
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Perfusionspumpe | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| Petrischale 100 x 15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Petrischale 35 x 10 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Poly-D-Lysinhydrobromid | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300.000 |
| Kaliumchlorid | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Kaliumphosphat monobasisch | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Primärantikörper R-Typ Calciumkanal | Alomone Labs | ACC-006 | |
| Protease Typ XIV aus Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Skalpellklingen | World Precision Instruments | 500240 | |
| Schot Duran Druckflasche | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Silikonschlauch für den Leimauftrag | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Schneidegrundplatte | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Schneidekammer | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Natriumhydroxid | S8045 | ||
| Natriumphosphat zweibasisch | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Natriumtetraborat | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Silikonelastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | Vorbereitung Elastomer A und Elastomer B 10:1 nach Gewicht |
| mischen Sylgard 184 Silikonelastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | Zur Vorbereitung Elastomer und Härter 10:1 Gew.-% mischen |
| Teflonbeschichtete Pinzette | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Tricain-Methansulfonat | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vibratom-Klingen | World Precision Instruments | BLADES | |
| Xenon-Lampe | Nikon |
Referenzen
- Katz, B., Miledi, R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission. Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain. Nature. 384 (6605), 17....
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Nachdrucke und Genehmigungen
