Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Zusammenfassung

Oberflächenplasmonresonanz (SPR) ist eine markierungsfreie Verfahren zur Detektion biomolekularer Wechselwirkungen in Echtzeit. Hierin wird ein Protokoll für ein Membranprotein: Rezeptor-Interaktion Experiment beschrieben, bei der Diskussion der Vor- und Nachteile der Technik.

Zusammenfassung

Protein-Wechselwirkungen sind für die meisten, wenn nicht sogar alle physiologischen Prozesse von zentraler Bedeutung, und das Verständnis der Natur solcher Wechselwirkungen ist ein zentraler Schritt in der biologischen Forschung. Die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) ist eine empfindliche Detektionstechnik für die markierungsfreie Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen in Echtzeit. In einem typischen SPR-Experiment wird eine Komponente (in der Regel ein Protein, das als "Ligand" bezeichnet wird) auf einer Sensorchipoberfläche immobilisiert, während die andere Komponente (der "Analyt") in Lösung frei ist und über die Oberfläche injiziert wird. Die Assoziation und Dissoziation des Analyten vom Liganden werden gemessen und in Echtzeit in einem Diagramm dargestellt, das als Sensogramm bezeichnet wird und aus dem Vorgleichgewichts- und Gleichgewichtsdaten abgeleitet werden. Da sie markierungsfrei ist, geringe Mengen an Material verbraucht und kinetische Daten vor dem Gleichgewicht liefert, ist SPR oft die Methode der Wahl, wenn es darum geht, die Dynamik von Proteininteraktionen zu untersuchen. Man muss jedoch bedenken, dass die gewonnenen Daten aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Methode sorgfältig analysiert und durch andere biochemische Methoden unterstützt werden müssen.

SPR eignet sich besonders für die Untersuchung von Membranproteinen, da es kleine Mengen an gereinigtem Material verbraucht und mit Lipiden und Detergenzien kompatibel ist. Dieses Protokoll beschreibt ein SPR-Experiment, das die kinetischen Eigenschaften der Wechselwirkung zwischen einem Membranprotein (einem ABC-Transporter) und einem löslichen Protein (dem verwandten Substratbindungsprotein des Transporters) charakterisiert.

Einleitung

Protein-Protein-Interaktionen (PPI); die Bildung und Dissoziation von Proteinkomplexen, sind Schlüsselereignisse in vielen biologischen Prozessen (zum Beispiel der Replikation, Transkription, Translation, Signalisierung, Zell-Zell-Kommunikation). Semi-quantitative Studien der PPI sind oft unter Verwendung von Pull-Down-oder Immunpräzipitation Experimente. Jedoch sind diese (und ähnliche) Techniken im Bereich von Affinitäten, die gemessen werden kann (niedrigen mikromolaren und höhere Affinität) durch die Waschschritte, die bei einem solchen Verfahren sind beschränkt. Solche "Endpunkt" Techniken nicht identifizieren kann vorübergehend oder geringe Affinität W....

Protokoll

1. Proteinproben und Buffer Vorbereitung

1. Probenvorbereitung: Reinigung der Proteine ​​von Interesse und sicherzustellen, dass alle Aggregate entfernt werden, durch Injizieren des Proteins vor dem Experiment auf eine Gelfiltrationssäule oder durch Ultrazentrifugation (üblicherweise 10 Minuten bei 100.000 xg genügt).
   HINWEIS: Obwohl wünschenswert, hochreinen Proteinpräparate sind kein Muss. SPR wurde erfolgreich mit weniger-als-perfekte Reinigungen und sogar mit Gesamtextrakt ^8,9 verwendet.
2. Buffer Zubereitung:
   1. Bereiten des Puffers des Experiments (als "Laufpuffer" oder RB). Für das hier beschriebene Protokoll verwendet 50....

Ergebnisse

In dem hier beschriebenen System wird eine NiNTA Chip verwendet, um die His-markierte Membrantransporter ^6,7 immobilisieren. Wobei ein Homodimer ist jedes Transporters doppelt markiert, die Verbesserung seiner Bindung zum NiNTA-Chip. Nach Nickelbeladung, Liganden A (der Transporter von Interesse) auf Fc = 2 immobilisiert, bis ~ 3500 RU (Protokoll Zyklus 2, 2A black label). Dann werden mit dem gleichen Strömungs und Einspritzdauer, Ligand B (Kontrollliganden) an Fc = 1 eingespritzt wird, zunäc.......

Diskussion

SPR ist ein hochempfindliches Verfahren, um molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen, und ist oft der einzige Ansatz, der Echtzeit-Überwachung von vorübergehenden (noch wichtiger) Wechselwirkungen liefert. Ein Beispiel ist die vorübergehende Wechselwirkung hierin dargestellt, die nicht durch ein anderes Verfahren (Pull-down-Assays, Liposomen Sedimentation Assays ⁶⁾ festgestellt werden konnte. Darüber hinaus, während andere Verfahren sind begrenzt, um Messungen Gleichgewicht (ob quantitativ oder qualitativ) .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01
Sensor-Chip NTA	GE Healthcare	14100532
BIAevaluation	GE Healthcare
Biacore T200 Software	GE Healthcare
Nickelchlorid	Sigma	N6136
Natriumwolframatdihydrat	Sigma	T2629
Natriumchlorid	Bio-Lab GmbH
Trizma base	Sigma	T1503
Ethyldiamin-tetraessigsäure Dinatriumsalzdihydrat (EDTA)	Sigma	E5134
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranosid (DDM)	Affymetrix	D310
Natriumdodecylsulfatlösung	Sigma	05030
Kimwipes KIMTECH	Kimberly-Clark	34120
Salzsäure	GADOT	7647-01-0
Nylon (NY) Membranfilter	Sartorius	25007--47------N
ModBC ABC-Transporter	Lewinson-Labor
RbsBC-ABC-Transporter	Lewinson-Labor
ModA-Substrat-bindendes Protein	, Lewinson-Labor

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