Echtzeit-Zytotoxizitätsassays in menschlichem Vollblut

Zusammenfassung

Das Vollblut Zytotoxizitätsassay (WCA) ist ein Zytotoxizitätstest durch Einbau Hochdurchsatz-Zellpositionierungstechnologie mit Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte Bildverarbeitung entwickelt. Hier beschreiben wir, wie Lymphom-Zellen mit einem anti-CD20-Antikörper behandelt werden können, in Echtzeit in menschlichem Vollblut zur quantitativen Analyse bereitzustellen zelluläre Zytotoxizität untersucht werden.

Zusammenfassung

Ein Live-zellbasierten Vollblut Zytotoxizitätstest (WCA), die Zugriff auf Zeitinformation des gesamten Zell-Cytotoxizität kann mit Hochdurchsatz-Zellpositionierungstechnologie entwickelt. Die gezielten Tumorzellpopulationen werden zuerst die Immobilisierung in ein Array-Format vorprogrammiert und mit grün fluoreszierenden cytosolischen Farbstoffen markiert. Im Anschluss an die Zellenanordnung Bildung werden Antikörper-Medikamenten in Kombination mit menschlichem Vollblut zugegeben. Propidiumiodid (PI) wird dann zugegeben, um den Zelltod zu bewerten. Die Zellenanordnung ist mit einem automatischen Abbildungssystem analysiert. Während cytosolischen Farbstoff beschriftet die gezielte Tumorzellpopulationen, Etiketten PI die toten Tumorzellpopulationen. Somit kann der Anteil der Ziel-Krebszelltötung durch die Berechnung der Anzahl der überlebenden Zellen gezielt auf die Anzahl der toten Zielzellen zu quantifizieren. Mit diesem Verfahren können die Forscher zeitabhängig und dosisabhängige Zell-Cytotoxizität Informationen zuzugreifen. Bemerkenswert ist, keine gefährliche RadioChemikalien verwendet werden. Die hier vorgestellte WCA hat mit Lymphom, Leukämie und soliden Tumorzelllinien getestet. Daher ermöglicht WCA Forscher Wirksamkeit von Medikamenten in einem hoch relevanten ex vivo Zustand zu beurteilen.

Einleitung

Jüngste Fortschritte in der Pharmaindustrie haben zu einem erhöhten Interesse an der Verwirklichung der spezifischen Identifikationen von Tumorzell-Antikörper und personalisierte Krebstherapien führten; sind jedoch mehrere Hindernisse in dem Verfahren auftreten. Nur 5% der Mittel, die Antikrebsaktivität in der präklinischen Entwicklung haben werden, nachdem dafür ausreichende Wirksamkeit in Phase II-III Test ^1,2 lizenziert. Die vorklinische Strategien (sowohl in vitro als auch in vivo) sind suboptimal, wie viele Beispiele wurden aufgrund ihrer unterschiedlichen Blutkomponenten ^3-5 gezeigt, dass die Antitumor-Arzneimittel in der Human- u....

Protokoll

1. Zielzellpräparation

1. Aufrechtzuerhalten Zielzellen (z. B. Raji-Lymphomzellen) in Wachstumsmedium (RPMI 1640-Kulturmedium, das mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 4 nM L-Glutamin und 500 IU / ml Penicillin / Streptomycin) bei 37 ^o C in einer 5% CO ₂ -Inkubator.
2. Zentrifugieren Sie die Probe auf die Zielzellen zu pelletieren in einer 15 ml Tube. Zentrifugation Zeit schwankt mit verschiedenen Zelltypen; Zentrifuge für 3 Minuten bei 468 × g für Raji-Zellen.
3. Zuerst absaugen alle Blasen auf der Oberfläche des Überstandes gebildet, und entfernen Sie das gesamte Überstand.
4. 10 ml PBS au....

Ergebnisse

Anti-CD20-Antikörper und Lymphomzellen (Raji-Zellen und MC / CAR) wurden als Modellsystem, um die Vollblut Zytotoxizitätsassay (WCA) ^7,8 demonstrieren gewählt. Raji-Zellen hatte eine hohe Kopienzahl von CD20 auf der Zelloberfläche, während MC / CAR Zellen hatten niedrige Kopienzahl von CD20 auf ihrer Membran. Zielzellen wurden zunächst grün mit grünen Fluoreszenz cytosolischen Farbstoffen gefärbt und auf der 96-Well-Platte angeordnet. 10,000 - 50,000 Ziellymphomzellen wurden in jede Vertiefung immobilisiert. .......

Diskussion

WCA ist ein kritischer in vitro Anti-Krebs-Screening-Tool mit Einzelzellauflösung ^12-16, idealerweise nach traditionellen Zielvorführungen wie CDC und ADCC-Assays ^9-11, und vor präklinischen Tierversuchen verwendet. Derzeit sind primäre Ziel Screening-Assays wie CDC oder ADCC-Assays alle in einer vereinfachten Medien oder eines Puffersystems durchgeführt. , Wirkstoffkandidaten, die Wirksamkeit in diesen vereinfachten Puffersystem zeigen, sind jedoch nicht immer wirksam in der komplexeren V.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
96-Well-Plattenkits für die Zellanhaftung	Adheren	AP9601
Suspension Einzelzell-Array 8-Well-Kammer-Objektträger	Adheren	SS0801
Adhärent Einzelzell-Array 8-Well-Kammer-Objektträger	Adheren	SS0802
Lymphom-Zelllinie CD20+	ATCC	CCL-86	Raji-Zellen
Lymphom-Zelllinie CD20-ATCC		CRL-8083	MC/CAR
RPMI 1640 mit L-Glutamin	Life Technologies	11875-119
Fötales Rinderserum	Thermo	SH30070.01HI
Peni/Strep	Life Technologies	15070063
Zytosolischer Farbstoff	Life Technologies	C7025	Cell Tracker Grünes
Rituxan (Biosimilar)	Eureka Therapeutics
Menschliches Vollblut	Allcells	WB001
Propidium Iodid	Sigma	P4170-10MG
Automatisches Bildgebungssystem	Molekulare Geräte	Kontakt Anbieter	Cell Reporter
Zellzählprogramm	Molekulare Geräte	Kontakt Anbieter	Cell Reporter