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Methodenartikel

Echtzeit-Zytotoxizitätsassays in menschlichem Vollblut

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DOI:

10.3791/51941

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7. November 2014

 ,  ,  , 
1Research and Development, Adheren, Inc, 2Research and Development, Eureka Therapeutics

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Vollblut Zytotoxizitätsassay (WCA) ist ein Zytotoxizitätstest durch Einbau Hochdurchsatz-Zellpositionierungstechnologie mit Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte Bildverarbeitung entwickelt. Hier beschreiben wir, wie Lymphom-Zellen mit einem anti-CD20-Antikörper behandelt werden können, in Echtzeit in menschlichem Vollblut zur quantitativen Analyse bereitzustellen zelluläre Zytotoxizität untersucht werden.

Zusammenfassung

Ein Live-zellbasierten Vollblut Zytotoxizitätstest (WCA), die Zugriff auf Zeitinformation des gesamten Zell-Cytotoxizität kann mit Hochdurchsatz-Zellpositionierungstechnologie entwickelt. Die gezielten Tumorzellpopulationen werden zuerst die Immobilisierung in ein Array-Format vorprogrammiert und mit grün fluoreszierenden cytosolischen Farbstoffen markiert. Im Anschluss an die Zellenanordnung Bildung werden Antikörper-Medikamenten in Kombination mit menschlichem Vollblut zugegeben. Propidiumiodid (PI) wird dann zugegeben, um den Zelltod zu bewerten. Die Zellenanordnung ist mit einem automatischen Abbildungssystem analysiert. Während cytosolischen Farbstoff beschriftet die gezielte Tumorzellpopulationen, Etiketten PI die toten Tumorzellpopulationen. Somit kann der Anteil der Ziel-Krebszelltötung durch die Berechnung der Anzahl der überlebenden Zellen gezielt auf die Anzahl der toten Zielzellen zu quantifizieren. Mit diesem Verfahren können die Forscher zeitabhängig und dosisabhängige Zell-Cytotoxizität Informationen zuzugreifen. Bemerkenswert ist, keine gefährliche RadioChemikalien verwendet werden. Die hier vorgestellte WCA hat mit Lymphom, Leukämie und soliden Tumorzelllinien getestet. Daher ermöglicht WCA Forscher Wirksamkeit von Medikamenten in einem hoch relevanten ex vivo Zustand zu beurteilen.

Einleitung

Jüngste Fortschritte in der Pharmaindustrie haben zu einem erhöhten Interesse an der Verwirklichung der spezifischen Identifikationen von Tumorzell-Antikörper und personalisierte Krebstherapien führten; sind jedoch mehrere Hindernisse in dem Verfahren auftreten. Nur 5% der Mittel, die Antikrebsaktivität in der präklinischen Entwicklung haben werden, nachdem dafür ausreichende Wirksamkeit in Phase II-III Test 1,2 lizenziert. Die vorklinische Strategien (sowohl in vitro als auch in vivo) sind suboptimal, wie viele Beispiele wurden aufgrund ihrer unterschiedlichen Blutkomponenten 3-5 gezeigt, dass die Antitumor-Arzneimittel in der Human- und vor allem in Labortieren unterschiedlich verhalten.

Um die Notwendigkeit eines Antitumor Wirkstoff-Screening-Plattform zu wenden und eine Check-Punkt vor kostspielige Tierversuche und klinische Studien zu schaffen, ist eine menschliche Vollblut Zytotoxizitätsassay (WCA) zur Auswertung antitumorale Wirksamkeit von Medikamenten in einer relevanten biologischen Umgebung vorgeschlagen. DieVollblut-Zytotoxizitätstests können verwendet werden, um die Reaktion einzelner Zellen, Antikörper und andere Wirkstoffkandidaten in menschlichem Vollblut zu bewerten.

Der WCA wird durch den Einbau von Hochdurchsatz-Zellpositionierungstechnologie mit hohem Durchsatz und High-Content-Imaging-6 entwickelt. Durch Verwendung eines automatischen Abbildungssystem kann sowohl die Anzahl der lebenden und toten Zellen, die mit einem hohen Grad an Genauigkeit bestimmt werden. Aufgrund der Tatsache, dass die Zielzellen auf der gleichen Brennebene immobilisiert ist WCA Lage, quantitative Zytotoxizität Analyse in Echtzeit ohne die Entfernung der roten Blutzellen bereitzustellen. Darüber hinaus stellt die automatische Abbildungssystem mehrere Vorteile, wie dass nur Zielzellen, die die angegebenen Kriterien erreicht haben (z. B. fluoreszenzmarkierten Zellen und Zellmorphologie) sind geschlossene und verarbeitet. Auch ermöglicht es die Produktion von 144 Platten pro Tag. Folglich diese Abbildungsfähigkeit und Durchsatz ermöglicht Betrieb von High-cNHALT und Hochdurchsatz-Experimenten gleichzeitig. Durch die Kombination von WCA und der Automated Imaging System können hohe Durchsatz quantitative Zellcytotoxizität Analyse innerhalb einer biologisch relevanten Umwelt erreicht werden.

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Protokoll

1. Zielzellpräparation

  1. Aufrechtzuerhalten Zielzellen (z. B. Raji-Lymphomzellen) in Wachstumsmedium (RPMI 1640-Kulturmedium, das mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 4 nM L-Glutamin und 500 IU / ml Penicillin / Streptomycin) bei 37 o C in einer 5% CO 2 -Inkubator.
  2. Zentrifugieren Sie die Probe auf die Zielzellen zu pelletieren in einer 15 ml Tube. Zentrifugation Zeit schwankt mit verschiedenen Zelltypen; Zentrifuge für 3 Minuten bei 468 × g für Raji-Zellen.
  3. Zuerst absaugen alle Blasen auf der Oberfläche des Überstandes gebildet, und entfernen Sie das gesamte Überstand.
  4. 10 ml PBS auf die Röhre. Re-suspend die Zellen durch Pipettieren der Lösung nach oben und unten mehrmals zum Aufbrechen der Zellklumpen.
  5. Zentrifugen die Probe für 3 Minuten bei 468 x g.
  6. Saugen Sie keine Blasen an der Oberfläche des Überstandes gebildet, und entfernen Sie das gesamte Überstand.

2. Herstellung von Zellmikroarrays

  1. Obtain Zellhaftung 96er Platte Kits oder Einzelzellenanordnung 8 auch Kammer-Objektträgern (siehe Tabelle der Werkstoffe / Reagenzien).
  2. Gelten 1,2 & mgr; l des Aktivators zu der DNA-Reagens aus dem Satz. Verschließe das Röhrchen, invertieren, und schütteln, um die Lösung zu mischen.
  3. Die Lösung wird für 20 min bei RT reagieren.
  4. Anwendung der gemischten Lösung auf den Zielzellen Pellet (in der 15-ml-Röhrchen).
  5. Hinzufügen grüne Fluoreszenz cytosolischen Farbstoffe in einer Endkonzentration von 500 nM.
  6. Inkubieren der Zielzellen mit der gemischten Lösung und des Farbstoffs 30 Minuten lang bei RT auf einem Orbitalschüttler.
  7. Mit 5 ml PBS Waschen Sie die Zellen zweimal, und die Zellen resuspendieren in 10 ml Wachstumsmedium.
  8. Anwendung 100 ul der Lösung aus Schritt 2.7 in jede Vertiefung. Zählen Sie die Zellzahl durch Verwendung eines Hämacytometers. Sicherstellen Zellzahlen im Bereich zwischen 5 x 10 4 bis 1 × 10 6 Zellen pro Vertiefung.
  9. Nach 10-15 min Inkubation bei RT, vorsichtig waschen die Proben zweimal mit 200-300 ul Wachstumsmedien, um alle ungebundenen Zellen zu entfernen.
    HINWEIS: Über 5-10 ul Wachstumsmedien bleibt in jeder Vertiefung nach dem Waschen.

3. Vollblut Zytotoxizitätsassays

  1. In 180 ul menschlichem Vollblut zu jeder Probe auch.
  2. Erhalten Anti-CD20-Antikörper-Lösung auf 5 mg / ml, und führen serielle Verdünnung um 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 ug / ml Anti-CD20-Antikörper-Lösung in 1,5-ml-Röhrchen. In 20 ul jeder Konzentration der Anti-CD20-Antikörper zu jeder Probe und machen dreifach.
  3. Hinzufügen Propidiumiodid in einer Endkonzentration von 500 nM zu jeder Vertiefung.
  4. Inkubieren der resultierenden Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 16 Stunden.
  5. Bild der Zellen auf dem Objektträger oder 96-Well-Platten mit einer automatischen Bildsystem mit 8-facher Vergrößerung.
  6. Verwenden Sie die Zellzählung Programm des automatischen Imaging-System, um die Ergebnisse zu quantifizieren.
    Hinweis: Die Software des automatischen Imaging-System bietet eine einfacheSchritt-für-Schritt-Operationen zur Zellzählung. Das Protokoll für die Verwendung dieser Software kann auf der Website Anbieters finden.
  7. Wählen Sie [Rückblick Ergebnisse] von der Hauptseite der Software.
  8. Wählen Sie [die gespeicherte für die Proben Datei].
  9. Erstes Tor FITC mittlere Intensität> 50, dann Gate TxRed mittlere Intensität> 20.
  10. Wählen Sie [Teller Übersicht].
  11. Wählen Sie [Tabellen exportieren].
    HINWEIS: Die prozentuale Zellabtötung Formel des Programms ist unten gezeigt:
    % Zielzelle Tötung = (Anzahl der Zellen gefärbt grün und rot / Anzahl der Zellen gefärbt grün) * 100%

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Ergebnisse

Anti-CD20-Antikörper und Lymphomzellen (Raji-Zellen und MC / CAR) wurden als Modellsystem, um die Vollblut Zytotoxizitätsassay (WCA) 7,8 demonstrieren gewählt. Raji-Zellen hatte eine hohe Kopienzahl von CD20 auf der Zelloberfläche, während MC / CAR Zellen hatten niedrige Kopienzahl von CD20 auf ihrer Membran. Zielzellen wurden zunächst grün mit grünen Fluoreszenz cytosolischen Farbstoffen gefärbt und auf der 96-Well-Platte angeordnet. 10,000 - 50,000 Ziellymphomzellen wurden in jede Vertiefung immobilisiert. ...

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Diskussion

WCA ist ein kritischer in vitro Anti-Krebs-Screening-Tool mit Einzelzellauflösung 12-16, idealerweise nach traditionellen Zielvorführungen wie CDC und ADCC-Assays 9-11, und vor präklinischen Tierversuchen verwendet. Derzeit sind primäre Ziel Screening-Assays wie CDC oder ADCC-Assays alle in einer vereinfachten Medien oder eines Puffersystems durchgeführt. , Wirkstoffkandidaten, die Wirksamkeit in diesen vereinfachten Puffersystem zeigen, sind jedoch nicht immer wirksam in der komplexeren V...

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Offenlegungen

Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Wir danken National Cancer Institute IMAT Programm von NIH für die Finanzierung dieser Arbeit [R33 CA174616-01A1].

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-Well-Plattenkits für die Zellanhaftung AdherenAP9601
Suspension Einzelzell-Array 8-Well-Kammer-ObjektträgerAdherenSS0801
Adhärent Einzelzell-Array 8-Well-Kammer-ObjektträgerAdherenSS0802
Lymphom-Zelllinie CD20+ATCCCCL-86Raji-Zellen
Lymphom-Zelllinie CD20-ATCCCRL-8083MC/CAR
RPMI 1640 mit L-GlutaminLife Technologies11875-119
Fötales RinderserumThermoSH30070.01HI
Peni/StrepLife Technologies15070063
Zytosolischer FarbstoffLife TechnologiesC7025Cell Tracker Grünes
Rituxan (Biosimilar)Eureka Therapeutics
Menschliches VollblutAllcellsWB001
Propidium IodidSigmaP4170-10MG
Automatisches BildgebungssystemMolekulare GeräteKontakt AnbieterCell Reporter
ZellzählprogrammMolekulare GeräteKontakt AnbieterCell Reporter

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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