Hocheffiziente Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen durch Nucleofection

Unter den zellulären Komponenten des Immunsystems sind Makrophagen von großer Bedeutung für die angeborene Immunantwort. Ihre Aufgaben sind vielfältig; sie in die Phagozytose von Pathogenen und nekrotischen Materials beteiligt sind, spielen sie eine wichtige Rolle bei der Gewebe Homöostase und produzieren und sezernieren eine Vielzahl von Zytokinen zu regulieren und zu orchestrieren die Immunantwort ^ein. Daher Makrophagen integral in vielen physiologischen Prozessen und pathophysiologischen Bedingungen beteiligt. Aufgrund der Vielfalt ihrer Aufgaben sind Makrophagen eine sehr heterogene und vielfältige Zelltyp. Dies wird durch unterschiedliche Polarisationen erreicht; abhängig von äußeren Reizen Makrophagen kann in verschiedene Phänotypen ² zu entwickeln. Makrophagen Variabilität und Einfluss auf die Immunantwort machen sie zu einem sehr interessanten Forschungsgegenstand. Um ihre komplexe Stoffwechsel-und Regulierungsfunktionen sollte Makrophagen in vitro-Modelle aufzuklären sind required die korrekt widerspiegeln Makrophagen Heterogenität und Variabilität.

Transfektion von Zellen mit Plasmid-DNA-Vektoren oder small interfering RNAs (siRNAs), um zelluläre Genexpression zu verändern hat sich zu einem weit verbreiteten und leistungsfähiges Werkzeug in der Zellbiologie zur Untersuchung sowohl der Genregulation und Genfunktion. Derzeit gibt es eine große Auswahl an verschiedenen Tools für die Transfektion von eukaryontischen Zellen zur Verfügung. Diese Werkzeuge umfassen die Anwendung von viralen Vektoren, mechanische Verfahren (wie Genpistolen), chemische Ansätze (die auf Polymeren oder Lipide, die Komplexe mit Nukleinsäuren zu bilden, verlassen können), und die Elektroporation von Zellen ^3. Alle diese Ansätze haben ihre Vorteile und Nachteile, und die Auswahl der am besten aus dieser Vielzahl für einen bestimmten Zelltyp und Anwendung kann eine schwierige und zeitraubender Prozess sein.

Makrophagen sind notorisch schwierig, da fast alle etablierten transfe Transfektionction Ansätze Makrophagen Lebensfähigkeit drastisch zu reduzieren oder zu stören mit ihrem Verhalten, dh Differenzierung und insbesondere Polarisation. Deshalb präsentieren wir hier eine effiziente, nicht-virale Protokoll der menschlichen THP-1-Makrophagen mit Hilfe der Elektroporation basierenden Nucleofector-Technologie, die eine optimierte Elektroporation Vorgehen erfordern geringere Mengen von DNA stellt transfizieren. Für empfindliche Zellen, wie Monozyten und Makrophagen Nukleofektion gut geeignet ist. Dieses Protokoll ist eine Anpassung der bisher veröffentlichten Versionen ^4,5.

Kurz, Phorbol 12-Myristat-13-Acetat (PMA) verwendet, um menschliche THP-1 Monozyten für 48 h in eine vorzeitige Makrophagen vor der Transfektion mit siRNA oder Plasmid-DNA zu unterscheiden. Für die Transfektion die prädifferenziert Makrophagen werden enzymatisch durch Behandlung Accutase ich abgelöst. Die Transfektion wird unter Verwendung einer Nucleofector 2b Vorrichtung zur Elektroporation der Zellen. Nach der Transfektion unterscheidenzierung wird weitere 24 bis 48 Stunden fortgesetzt, wie erforderlich. Schließlich werden reife Makrophagen transfiziert mit verschiedenen Arten von Verbindungen für funktionelle Studien inkubiert.

Dieser Ansatz erlaubt die Transfektion von Zelllinien, wie humanen THP-1 Monozyten und Makrophagen und wurde in der Vergangenheit erfolgreich angewendet ^6-10. Im Gegensatz zu den meisten chemischen Transfektion Ansätze ergibt unserer modifizierten Nucleofection Verfahren mit vorzeitiger Makrophagen hohe Transfektionseffizienzen in Kombination mit der Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigt, ohne dass virale Vektoren verwenden oder weitere Träger Verbindungen mit unbekannten Nebenwirkungen. Darüber hinaus sind die Makrophagen behalten ihre volle Potenzial zur Differenzierung sowie Polarisierung so dass ungehindert funktionelle Untersuchungen nach der Transfektion ^11.

Darüber hinaus sind die nach Nucleofection angewendet Zellkulturmedium stark beeinflusst funktionelle Studien folgende transfection; Insbesondere kann die Fähigkeit der Makrophagen zur Polarisation in Abhängigkeit von der angewandten Kulturmedium beeinflusst. Hier vier verschiedene Arten von Zellkulturmedien (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 und Maus-T-Zellen Nucleofector Medium) wurden unter Deaktivierung Bedingungen mit Interleukin getestet (IL) 10. Mit THP-1-Makrophagen, beobachteten wir, dass Zellen gegenüber IL10 ist am stärksten, wenn der Maus-T-Zell-Nucleofector Medium im Vergleich zu den anderen oben erwähnten Kulturmedien verwendet. Diese Ergebnisse zeigen, dass entsprechende Optimierung aller Zellkulturbedingungen notwendig für eine erfolgreiche Transfektion und anschließende funktionelle Untersuchungen, da diese deutlich experimentellen Ergebnisse zu verbessern.

Makrophagen sind in verschiedenen menschlichen Krankheiten beteiligt sind, wird viel Forschung auf Aufklärung Makrophagen Verhalten sowie regulative Mechanismen beeinflussen Makrophagen oder wiederum durch Makrophagen gesteuert konzentriert. Daher ist von Bedeutung dieses Protokoll invielen verschiedenen Forschungsbereichen.

1. Vordifferenzierung von THP-1-Makrophagen

1. Kultivieren THP-1-Zellen in RPMI-1640-Medium mit 10% (v / v) fötalem Kälberserum (FCS) und 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin / L-Glutamin (PSG) in einer CO ₂ ergänzt (5% ) Inkubator bei 37 ° C aufweist.
2. Vor der Transfektion aufgeteilt Zellen und übertragen sie an die frische RPMI-Medium wie zuvor. Kultivieren Zellen für 24 Stunden.
3. Samen 1,0-1,5 × 10 ⁷ Zellen in einer 75 cm² Gewebekulturkolben oder 2,5 x 10 ⁷ Zellen in eine 150-cm² Gewebekulturkolben in RPMI-1640-Medium und füge 10% (v / v) FCS, 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) Natriumpyruvat, 1% (v / v) nicht-essentielle Aminosäuren, 10 ng / ml PMA und 50 uM β-Mercaptoethanol für 48 Stunden.

2. Herstellung von Nucleofection

1. Zeigen Accutase I und alle Medien in Wasserbad bei 37 ° C.
2. Absaugen Kulturmedium aus Kolben und mit 6 ml (75 cm² Kolben) oder 12 ml (150 cm² Kolben) von ersetzenAccutase ich und Inkubation für 30 min bei 37 ° C für volle Ablösung von Zellen. Beachten Zellmorphologie nach Accutase I-Behandlung, um sicherzustellen, dass die Zellen einen runden Auftritt. Wenn einige Zellen erscheinen noch angebracht werden, die Flasche vorsichtig mit einer Mikropipette spülen oder klopfen Sie leicht es zu einer Ablösung abzuschließen. Verwenden Sie keine Zellschaber, da dies einen negativen Effekt auf die Vitalität der Zellen zu haben. Übertragen Zellsuspension in ein 15 ml Röhrchen.
3. Während ich Accutase Behandlung, bereiten Sie die folgenden Medien:
   1. Vorbereitung Transfektionsmedium: Ergänzung Zellkulturmedium mit 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) nicht-essentielle Aminosäuren, 1% (v / v) Natriumpyruvat und 5% (v / v) Humanserum (für siRNA) oder 20% (v / v) Humanserum (für Plasmid-DNA); bereiten ein Gesamtvolumen von entweder 3 ml / Probe für eine 6-Well-Platte oder 4 ml / Probe für zwei 12-Well-Platten.
   2. Vorbereitung Kultivierungsmedium: Kulturmedium Ergänzung mit 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) nicht-essentielle Aminosäuren, 1% (v / v) Natriumpyruvat und 5% (v / v) huMensch-Serum (für siRNA) oder 20% (v / v) Humanserum (für Plasmid), 2,5 ng / ml PMA und 50 uM β-Mercaptoethanol; bereiten ein Gesamtvolumen von entweder 3 ml / Probe für eine 6-Well-Platte oder 4 ml / Probe für zwei 12-Well-Platten.
4. Zentrifuge Zellsuspension für 5 min bei 300 × g bei Raumtemperatur.
5. Aspirat Accutase I und Zellen in 1 ml RPMI-Medium auf 37 ° C vorgewärmt; Zählen von Zellen auf die Zellzahl zu bestimmen.
   HINWEIS: Bei der schnellen automatischen Zellzählung Verfahren verwendet werden, die Schritte 2.4 und 2.5 kann verzichtet werden, und die Zellen gezählt werden sofort nach der Ablösung der Maßgabe, dass über längere Zeit Accutase ich vermieden.
6. Für jede Transfektion Probe herzustellen Aliquots in Zentrifugenröhrchen, die 2,0-2,5 x 10 ⁶ Zellen.

3. Nucleofection von THP-1-Makrophagen

1. Zentrifuge alle Aliquots für 10 min bei 250 × g bei Raumtemperatur.
2. Verdünnen Plasmid-DNA oder siRNA in nukleasefreiesWasser oder einem geeigneten Puffer. Halten Sie das erforderliche Volumen der Plasmid-DNA oder siRNA so klein wie möglich.
3. Vorbereitung einer Nucleofector Küvette mit entweder 1 ug von siRNA oder 0,5 ug Plasmid-DNA für jede Transfektion.
4. Führen Sie eine Transfektion zu einem Zeitpunkt. Absaugen Überstand aus Zell aliquoten.
5. Resuspendieren pelletierten Zellen in Nucleofector Lösung, um ein Gesamtvolumen von 100 ul DNA / siRNA und Nucleofector Lösung ergeben. Halten Sie die Zeit der Exposition zu reinen Nucleofector Lösung auf ein Minimum und gewährleisten, dass die Belichtungszeit nicht mehr als 15 min nicht überschreiten.
6. Mischen resuspendierten Zellen und DNA / siRNA in Nucleofector Küvette durch leichtes Klopfen.
7. Transfizieren Zellen durch Ausführen Programm Y-001 in Nucleofector 2b Gerät.
8. Übertragen transfizierten Zellen in ein Reaktionsgefäß mit Einweg-Kunststoff-Pasteur-Pipetten.
9. Sofort im 500 ul bereit Transfektion Medium.
10. Wiederholen Sie die Schritte 3,4-3,9 für jede Transfektion Probe.

1. Bereiten Sie entweder 6-Well-oder 12-Well-Platten für transfizierte Zellen. Pipette 2,5 ml Transfektion Medium in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte (1 gut / Transfektion) oder 1,75 ml der Transfektion Medium in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte (2 Wells / Transfektion).
2. Mischen Zellsuspensionen gründlich mit einer Mikropipette.
3. Übertragen Sie die transfizierten Zellen in die vorbereiteten Bohrlöcher (entweder man gut in einem 6-Well-Platte oder zwei in einem 12-Well-Platte).
4. Platten für 4 Stunden inkubieren in einem befeuchteten Inkubator (5% CO _2, 37 ° C).
5. Wiederbefestigung von Zellen mikroskopisch zu überprüfen.
   HINWEIS: Die Mehrheit der Zellen sollten wieder haftend sein. Gelegentlich Verlängerung der Inkubationszeit von 1 Stunde erhöht die Anzahl der adhärenten Zellen bei ungenügender Wiederbefestigung.
6. Transfektionsmediums sorgfältig absaugen mit einer Mikropipette und ersetzen mit der gleichen Menge von Kultivierungsmedium. Nur ein gut absaugen zu einer Zeit.
<li> Zellen für erforderliche Zeitraum für maximale Wirkung von Plasmid-oder siRNA (24-72 h) inkubiert. Wenn Inkubationszeiten mehr als 48 Stunden, ersetzen Medium nach 48 Stunden.
7. Für zusätzliche Behandlung mit Effektoren (zB., Zytokine, Agonisten, Antagonisten und Inhibitoren) verwenden Serum-freiem Medium ohne PMA und β-Mercaptoethanol. Zeit am Ende der Inkubationszeit des Effektors mit der Zeit der maximalen Wirkung des Plasmids oder siRNA und planen die Änderung des Mediums und Zugabe der Effektorzellen entsprechend. Zellen unter Serum-freien Bedingungen aufrecht zu erhalten sollte er nicht länger als 24 Stunden.

Unter Verwendung dieses Protokolls für die Transfektion von THP-1 Makrophagen mit siRNA wir normalerweise erreichen Transfektion Raten von über 90% ohne signifikante Reduktion der Zellvitalität. Abbildung 1 zeigt repräsentative Daten, die den Zustand der Zellen 24 h nach der Transfektion mit Fluoreszenz im Vergleich zu einer nicht transfizierten markierte siRNA Kontrolle, die nicht mit Nucleofection Reagenzien behandelt wurden und Puls oder siRNA erhielt aber alle Änderungen von Kulturmedien, wie transfizierten Proben. In 1A der Zellmorphologie wird nach durchflusszytometrischen Messung gezeigt. Mikroskopische Aufnahmen sind in Abbildung 1B 1C und 1D stellen die niedrigen Preise für die Apoptose (Kontrolle: 1,5%; Nucleofection: 5,4%). Und Nekrose (Kontrolle: 2,0%; Nucleofection: 3,2%), die die Vitalität der Zellen unberührt. Nekrose und Apoptose sind die transfizierten Probe etwas höher als transfiziert THP-1 Makrophagen sindschwer zu lösen ist als nicht-transfizierte Zellen, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Zellschäden beim Ablösen zunimmt. Schließlich Transfektionseffizienz ist in 1E dargestellt. Da die gesamte transfizierten Population gegen den Steuer verschoben wird, zeigt dies an, dass alle Zellen transfiziert, welche durch fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (2B) bestätigt wird. Sowohl durchflusszytometrischen Daten sowie fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zeigen, daß alle Zellen einheitlich mit homogener Verteilung von siRNA unter den Zellen als auch in Zellen transfiziert. Dies steht im Gegensatz zu vielen chemischen Transfektionsreagenzien zum Vergleich 2A und 2B zeigen die jeweiligen durchflusszytometrischen Daten und fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen für eine chemische Transfektionsmittel unter Verwendung einer Lipid-basierten Ansatz. Diese Zahlen zeigen, daß zwei unterschiedliche Populationen von transfizierten Zellen festgestellt werden kann. Die erste Population ist ähnlich zu den transfizierten Zellen foFlügel Nucleofection. Sie sind durch niedrige Gesamt Fluoreszenz und homogene Verteilung von siRNA in den Zellen aus. Die zweite Population ist durch eine intensivere Fluoreszenz, die von sehr hellen intrazellulären Agglomerate von siRNA stammt markiert. Die zelluläre Morphologie bleibt unberührt für beide Ansätze Transfektion durch Differential-Interferenz-Kontrast in 2C gezeigt. Transfektionen mit Plasmid-DNA-Ausbeute effektiv ähnliche Ergebnisse für die Beispiele finden Sie in Robenek et al. (2009) 9 oder Xie beziehen et al. (2006) 7.

Die Wahl des Zellkulturmedium nach der Transfektion von großer Bedeutung; daher verschiedene Zellkulturmedien wurden im Vergleich getestet. Die ausgewählten Medien sind geeignet für den Anbau von THP-1-Zellen und wurden nach den Empfehlungen von Lonza als zutreffend Medien für Post-Nucleofection Anbau entschieden. Abbildung 3 stellt die siRNA mediated Knockdown Effizienz mit einer siRNA gegen IL10RB (Interleukin 10-Rezeptor β-Kette) mRNA gerichtet. Bei allen getesteten Medien Ausdruck IL10RB signifikant auf etwa 10 bis 20% der Kontrollebene reduziert (Figur 3). Jedoch werden die transfizierten Zellen variieren abhängig vom Kulturmedium in ihrem Potential für die Polarisation. THP-1-Makrophagen entweder mit unspezifischer Kontroll-siRNA oder IL10RB-spezifische siRNA transfiziert wurden in verschiedenen Medien nach der Transfektion kultiviert und mit IL10 behandelt. Anschließend werden die Expressionsniveaus der IL10-induzierte Gen SOCS3 (Suppressor of Cytokine Signaling 3) auf mRNA-Ebene wurden mittels RT-qPCR gemessen. Unterschiede zwischen den Kulturmedien in Bezug auf das Ausmaß der Induktion von SOCS3-mRNA-Expression auf (Abbildung 4), die Induktion für jede der getesteten Medien-Maus T-Zell Nucleofector Medium, LGM3, X-VIVO 20 und IMDM wurden 19,5 [17,7-21,5 ] 11,5 [8,5-15,7], 8,0 [4,6-14,2] und 7,2 [5,6 bis 9,5] fache. Dierefore Anwendung der Maus-T-Zellen Nucleofector Medium ist lebenswichtig. Darüber hinaus waren die Unterschiede in der Wirkung der Knockdown von IL10RB auf SOCS3 Expression nach IL10 Behandlung zu beobachten, wurden die Expressionsniveaus von SOCS3-mRNA auf 9,5 [8,8-10,3] fach in Maus-T-Zellen Nucleofector Medium reduziert, 2,1 [1,1 bis 4,1] falten in LGM3, 4,8 [3,2 bis 7,2] fach in X-VIVO 20 und 3,3 [2,7 bis 3,9] fach in IMDM. Diese Werte entsprechen der Verringerung der SOCS3-Expression in den verschiedenen Medien auf 49%, 18%, 60% und 45% betragen. Reduktion der IL-10-induzierte SOCS3-Expression nach Transfektion von siRNA IL10RB bestätigt die erfolgreiche Herabregulation der IL10RB der Transfektion.

Abbildung 1. Charakterisierung von transfizierten THP-1 Makrophagen. Die charakteristische Status der Zellen nicht beeinflußt, wie durch Lichtmikroskopie ergab durchflusszytometrischen Analysen von untransfizierten Control Zellen gegen THP-1-Makrophagen gemäß der vorgestellten Protokoll transfiziert. THP-1-Makrophagen wurden mit 10 ng / ml PMA für 48 Stunden differenziert und mit Fluoreszenz-markierten (Alexa 488) unspezifische Kontrolle siRNA transfiziert. 24 h nach Transfektion entweder Bilder von lebenden Zellen aufgenommen wurden (B), oder die Zellen wurden durch Behandlung Accutase I gelöst und mittels Durchflußzytometrie (A) analysiert. Apoptose und Nekrose-Färbung wurde durchgeführt unter Verwendung von Annexin V-Phycoerythrin (PE), (C) und 7-Aminoactinomycin (7-AAD) (D). Transfektionseffizienz (E) wurde durch Durchflusszytometrie unter Verwendung der Fluoreszenz-Markierung in die siRNA befestigt bestimmt. Das Fluoreszenzsignal der transfizierten Zellen (schwarz) gegen die Steuersignal (grau) gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2. Vergleich der intrazellulären Verteilung von siRNA nach Nucleofection gegen Lipofektion. THP-1-Zellen wurden für 48 Stunden nach diesem Protokoll unterschieden und dann transfiziert entweder Nucleofection oder Lipofektion. Die dargestellten Ergebnisse wurden erhalten, Lipofektion unter Verwendung des Xtremegene siRNA-Kit nach den Empfehlungen des Herstellers mit einem Ladungsverhältnis von Reagenz zu siRNA von 4: 1 beträgt. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen entweder mit Accutase ich Einfamilienhaus zum Durchflusszytometrieanalyse oder mikroskopisch mit lebenden Zellen ausgewertet. (A) Transfektion Effizienz und Verteilung von siRNA pro Zelle in der Bevölkerung wurde mittels Durchflusszytometrie mit Hilfe der Fluoreszenz-Markierung auf die siRNA befestigt bestimmt wird, werden Kontrollen transfiziert ohne siRNA grau dargestellt, werden die Proben mit siRNA in schwarz dargestellt. (B) FluoreszenzmikroskopieBilder, die intrazelluläre Verteilung von fluoreszenzmarkierten siRNA (Alexa Fluor 488); Der Maßstab entspricht 40 um. (C) Differential-Interferenz-Kontrast-Bild entsprechend dem Fluoreszenzbild; Der Maßstab entspricht 40 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. siRNA-vermittelten Knockdown IL10RB in transfizierten THP-1 Makrophagen. THP-1 Makrophagen wurden nach dem beschriebenen Protokoll transfiziert. Nach Transfektion wurden die Zellen in vier verschiedenen Kulturmedien, Maus-T-Zellen, nämlich Nucleofector Medium (A), IMDM (B) kultiviert, LGM3 (C), und X-VIVO 20 (D) ergänzt werden, wie in dem Protokoll beschrieben. CEllen wurden entweder mit unspezifischer Kontroll-siRNA (Strg) oder IL10RB-spezifische siRNA (IL10RB) transfiziert. Als zusätzliche Kontrollen wurden die folgenden Proben enthalten: Impulssteuerung, dh. Zellen, die in Abwesenheit der Transfektion von siRNA (Impuls), und eine Mediumkontrolle, dh unterzogen. Zellen, die nur die Änderungen von Kulturmedien erhalten, blieb aber sonst unbehandelt. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen in serumfreiem Medium mit oder ohne 50 ng / ml IL-10 für weitere 24 Stunden inkubiert. IL10RB Expression wurde mittels RT-qPCR gemessen; Diagramme zeigen die mittlere von drei unabhängigen Experimenten, die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert; * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 vs Strg. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. IL10 abhängigen Regelung SOCS3 nach Knockdown IL10RB in transfizierten THP-1 Makrophagen. THP-1 Makrophagen wurden nach dem beschriebenen Protokoll transfiziert. Nachdem Transfektion wurden die Zellen in vier verschiedenen Kulturmedien Maus-T-Zellen Nucleofector Medium (A), IMDM (B) kultiviert, LGM3 (C) und X-VIVO 20 (D) ergänzt die in dem Protokoll Abschnitt beschrieben. Die Zellen wurden entweder mit unspezifischen Kontroll-siRNA (Strg) oder IL10RB-spezifische siRNA (IL10RB) transfiziert. Als zusätzliche Kontrollen wurden die folgenden Proben enthalten: Impulssteuerung, das heißt Zellen, die die Transfektion in Abwesenheit von Sinra (Pulse) unterzog, und eine Mediumkontrolle, dh. Zellen, die nur die Änderungen von Kulturmedien erhalten, blieb aber sonst unbehandelt. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen in serumfreiem Medium mit oder ohne 50 ng / ml IL-10 für weitere 24 Stunden inkubiert. SOCS3 expreSpaltung wurde mittels RT-qPCR gemessen; Diagramme zeigen die mittlere von drei unabhängigen Experimenten, die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert; *, # P <0,05; **, ## P <0,01; ***, ### P <0,001 vs Strg und gegen Strg + IL-10 auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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