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Methodenartikel

Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

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DOI:

10.3791/51964

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16. Februar 2015

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1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der Begriff Anastase bezieht sich auf das Phänomen, bei dem sterbende Zellen einen Zellselbstmordprozess in einem späten Stadium rückgängig machen, sich selbst reparieren und schließlich überleben. Hier demonstrieren wir Protokolle zum Nachweis und zur Verfolgung von Zellen, die einer Anastasierung unterzogen werden.

Zusammenfassung

Anastasis (griechisch für "Rising to life") bezieht sich auf die Wiederherstellung von sterbenden Zellen. Bevor diese Zellen zu gewinnen, sie durch wichtige Kontrollpunkte der Apoptose, einschließlich mitochondriale Fragmentierung, Freigabe der mitochondrialen Cytochrom c in das Zytosol, Aktivierung von Caspasen, Chromatin-Kondensation, DNA-Schäden, Kernfragmentierung, Plasmamembran Blasenbildung, Zellschrumpfung, Zelloberflächenexposition bestanden haben Phosphatidylserin und Bildung von apoptotischen Körpern. Anastasis kann auftreten, wenn apoptotische Reize vor dem Tod entfernt, wodurch sterbenden Zellen zur Apoptose und möglicherweise anderen Todesmechanismen umzukehren. Daher erscheint anastasis physiologischen Heilungsprozesse, die auch beschädigte Zellen zu erhalten könnte unangemessen einzubeziehen. Die Funktionen und Mechanismen der Rekonvaleszenz sind noch unklar, zum Teil durch die begrenzte Tools zur Erkennung Ereignissen der Vergangenheit nach der Wiederherstellung der scheinbar gesunden Zellen behindert. Strategien zur Anasta erkennensis werden Studien über die physiologischen Mechanismen, die Gefahren von Untoten Zellen in Krankheitspathologie und potenziellen Therapeutika ermöglichen anastasis modulieren. Hier beschreiben wir effektive Strategien mit Lebendzellmikroskopie und eine Säugetier Caspase Biosensor zur Identifikation und Verfolgung anastasis in Säugerzellen.

Einleitung

Apoptose (griechisch für "fallen in den Tod") wird im Allgemeinen angenommen, dass ein einseitiger Prozess endet in Zelle Selbstmord 1-7 sein. Genetische Störung der pro-Tod Gene Ergebnisse in der Überlebensrate von zusätzlichen Zellen, die sonst in ganzen Tieren sterben würde, einschließlich Zellen, die bereits die Apoptoseweg 8,9 eingeleitet haben. Auch genetische Manipulationen ermöglichen gesunden Säugetierzellen, die künstlich Anzeige "essen mich" Signale oder die Haftfähigkeit zu verlieren, ihre extrazellulären Matrix zum Tod durch Ganzzell-Phagozytose oder entosis bzw. 10,11 entkommen. Jedoch haben wir und andere gezeigt, dass ohne genetische Manipulation normalen gesunden Säugetierzellen und Zelllinien, können auch aus den frühen Stadien der Apoptose 12-15 erholen. Mit Werkzeugen, einzelne Zellen zu verfolgen, haben wir weiter gezeigt, sich nach späten Stadien der Apoptose 12,13, nachdem Zellen wichtige Kontrollpunkte, dass typische gebenly markieren den "point of no return" 2-6. Diese Checkpoints Stufe Apoptose spät schließen mitochondrialen Freisetzung von Cytochrom c, Aktivierung von Caspasen, eine Kernfragmentierung und Bildung von apoptotischen Körpern. Wir nahm eine griechische gesetztes Wort "Anastasis", das bedeutet "stieg auf Leben", um diese Umkehrung der Apoptose am Rande der Zelltod 2-6 beschreiben.

Es sei denn, die gesamte Sterbe-Recovery-Prozess wird von lebenden Zellen beobachtet wird, wird es eine Herausforderung, Zellen, die anastasis aus Zellen, die nie apoptotischen Ereignisse erlebt unterzogen haben zu unterscheiden. Die jahrzehntelange Arbeit haben gezeigt, dass die morphologischen Merkmale der Zelltod durch Apoptose durch evolutionär konservierte biochemischen und molekularen Ereignisse 16-19 angetrieben. Diese Veranstaltungen fördern die Selbstzerstörung der Zellen, Entwicklungs- und homöostatischen Prozesse in einzelligen und mehrzelligen Organismen durch die Beseitigung beschädigter oder d zu regelnangerous Zellen 16-19. Während apoptotischen Zellen können leicht durch standardisierte morphologischen, biochemischen und molekularen Manifestationen Apoptose 1,5,6,16,20 unterschieden werden, gibt es bisher keine bekannte Marker spezifisch anastasis 12,13. Wichtig ist, dass Zellen, die anastasis laufen haben scheinen normale gesunde Zellen und Zellen, die gerade beginnen Umkehr Apoptose erscheinen als apoptotische sterbenden Zellen 12,13 sein. Damit neue Werkzeuge erforderlich sind, um mit Gewissheit, dass ein bestimmter überlebenden Zellen zuvor erlebt aktiven apoptotischen Prozessen abzuschließen.

Apoptose ist im Allgemeinen als eine irreversible Kaskade angenommen, weil es eine schnelle und massive Zerstörungsprozess. Man könnte zwar Minuten bis Tage dauern für einige Zellen, die Apoptose auslösen, sobald Mitochondrien apoptogene Faktoren wie Cytochrom c in das Cytosol freigesetzt 21,22 kann Caspasen innerhalb von 5 Minuten 23,24 aktiviert werden, gefolgt von cytoplasmatischen undKernkondensation innerhalb von 10 Minuten 25 bis 27, und Zelltod kurz danach 25-27. Aktivierte Caspasen dirigieren Apoptose durch Spaltung und Inaktivierung wichtigsten strukturellen und funktionellen Komponenten für die Zwecke der zellulären Abbruch 2,28, wie die Endonuklease-Inhibitor DFF45 / ICAD 29,30. Caspasen aktiviert auch pro-apoptotischen Faktoren wie BCL-2-Familienmitglied BID, die Mitochondrien transloziert mitochondriale Freisetzung von Cytochrom c 31,32 fördern. Caspase-Aktivität führt auch zu Zelloberflächenexposition von Phosphatidylserin als "essen mich" Signal für die Förderung der Phagozytose von sterbenden Zellen durch Makrophagen oder Nachbarzellen durch Phagozytose 33. Außerdem apoptotische Vorgänge machen Mitochondrien dysfunktional, Störung zellulärer Bioenergetik und Stoffwechsel 34,35,36. So scheint Erholung von solchen Zerstörung intuitiv unwahrscheinlich.

Entgegen der ursprünglichen erwartentionen können Zellen die Apoptose Prozess noch in einem späten Stadium umzukehren. Durch die kontinuierliche Überwachung das Schicksal der sterbenden Zellen in Kultur, beobachteten wir die Reversibilität der Bühne Apoptose spät in einem Spektrum von primären Zellen und Zelllinien 12,13. Die Entfernung der Tod Reizes Erholung von den offenkundigen Eigenschaften der Apoptose, wie mitochondriale Fragmentierung, Chromatin-Kondensation, DNA-Schäden, Plasmamembran Blasenbildung, Zelloberflächenexposition von Phosphatidylserin, Freigabe der mitochondrialen Cytochrom C, Caspase-Aktivierung, Kernfragmentierung, Zellschrumpfung, und Bildung von apoptotischen Körpern. Diese Beobachtungen werfen unbeantwortete Fragen zu den Funktionen, Folgen und Mechanismen der Rekonvaleszenz. Um diese Fragen anzugehen, ist eine Voraussetzung, um zuverlässig zu identifizieren Zellen, anastasis unterzogen wurden. Hier beschreiben wir Live-Mikroskopieverfahren und eine Caspase Biosensor zum Nachweis von Zellen, die zuvor rückgängig gemacht haben, spät Apoptose und then überlebt.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen für das Live Cell Imaging

  1. Um den Nachweis von morphologischen Veränderungen zu erleichtern, wählen adhärenten Zellen wie HeLa (humane Zervixkarzinom-Zellen), die flach auf dem Substrat zur Änderung der Plasmamembran und intrazellulären Organellen besser zu visualisieren.
    Hinweis: Umkehr der Apoptose in verschiedenen Säugetierzellen 12,13, einschließlich primären Mausleberzellen, primären Maus-Makrophagen, primären Ratten-Kardiomyozyten beobachtet und auch Zelllinien wie menschliche embryonale Nieren HEK-293T-Zellen, der afrikanischen grünen Meer Nierenepithelzellen COS -7 Zellen, Maus Herzmuskel HL-1-Zellen, Maus NIH 3T3 Fibroblasten, Frettchen (Mustela putoris furo) Gehirn CRL1656-Zellen, menschliche Hautkrebs A375-Zellen, menschliche Hodenkrebs CRL1973 Zellen, menschlichen kleinzelligen Lungenkarzinoms H446-Zellen, menschliche Leberkrebs HepG2-Zellen, menschliche Brustkrebs MCF7-Zellen, menschlichen Prostatakrebs PC3-Zellen und humanen Neuroblastom-SH-SY5Y-Zellen.
  2. Vorwäsche Deckgläser der Glasboden-Zellkulturschalen mit absolutem Ethanol zur Reinigung und Sterilisation.
    Hinweis 1: Die Verwendung von Glasbodenschalen ist für hochwertige Interferenzkontrast (DIC) Mikroskopie und hoher Vergrößerung konfokalen oder Epifluoreszenzmikroskopie (siehe Diskussion) empfohlen.
    Anmerkung 2: Für hohen Vergrößerungen (40x, 60 / 63X oder 100X Ziele und hohe numerische Aperturen 1.3 oder 1.4), stellt die Verwendung von Zellkulturschalen mit dünneren Glasboden (Dicke von 0,085 bis 0,16 mm) größere Arbeitsabstände für die Bildgebung (siehe Protokoll 3 ).
  3. Je nach Zelltyp können Glasboden-Kulturschalen-Beschichtung mit Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml), Collagen (0,01% ige Lösung in 0,01 M Essigsäure) und / oder Fibronectin (5 ug / ml) vor der Aussaat erfordern Zellen.
    Anmerkung: Die Optimierung der Art und Konzentration der Beschichtungsmittel für verschiedene Zelllinien erforderlich. HeLa-Zellen können direkt auf Glas ohne Beschichtung haften. Jedoch können einige Zellen, such als Maus Herzmuskel HL-1-Zellen, können nicht direkt haften an Glasflächen, sondern erfordern spezifische Kultur und Beschichtungsprotokolle 37.
  4. Samen ~ 2-3 x 10 5 Zellen auf 35 mm vorbeschichtetes Glasboden-Zellkulturschalen und bei 37 Grad Celsius (° C) mit 5% CO 2 für einen Tag auf 80% Konfluenz erreichen.
    Anmerkung 1: Die optimalen Bedingungen der Zelldichte, Inkubationszeit und Kulturbedingungen können variieren, je nach dem Zelltyp. Zellkonfluenz können die apoptotische Antwort von Zellen (siehe Protokoll 2) beeinflussen. Bei hohen Konfluenz könnten Zellen weniger empfindlich gegenüber den gleichen Konzentrationen von apoptotischen Stimuli.
    Anmerkung 2: Vermeiden Sie zu konfluenten Zellen, wie hohe Zelldichte können morphologische Veränderungen einzelner Zellen und ihre Organellen zu verschleiern.

2. Anwendung und Entfernung von apoptotischen Stimuli

  1. Kurz vor Gebrauch vormischen Apoptose induzierende Agens mit 37 ° C Zellkulturmedium. Ethanol (3,6-4,5% Vol / vol) diente als Apoptose-Induktor in der vorliegenden Demonstration.
    Anmerkung 1: Die unveröffentlichte Daten zeigen, dass Zellen können auch Rückwärts Apoptose, die durch andere apoptotische Stimuli 12,13 ausgelöst wird, wie beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO, 8% vol / vol 24 h), Staurosporin (STS, 0,5 uM für 1 h), und Taxol (1 uM für 12 h). Optimierung der Dosierung für das Auslösen von Apoptose ist für verschiedene Arten von Zellen erforderlich ist, um die Minimaldosis, welche die Mehrzahl der Zellen in der Population auslösen kann zur Apoptose zu erzielen.
    Anmerkung 2: Vormischen Apoptose-induzierende Mittel mit Zellkulturmedium ist wichtig, um ungleichmäßige Belichtung der Zellen auf Stimuli apoptotische vermeiden.
  2. Bild eine Gruppe von Gesundheits Zellen in der Zellkulturschale, bevor die Apoptose-induzierende Mittel zum Ausgangs Morphologien herzustellen.
  3. Entfernen des ursprünglichen Mediums aus der Zellkulturschale und dann 2 ml vorgemischt Apoptose induzierende Mittel gelten für die Schale zuTriggerzellen Apoptose. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 (oder anderen normalen Kulturbedingungen).
  4. Nach der Inkubation wurden die Zellen zu beobachten durch das Licht, Epi-Fluoreszenz oder konfokale Mikroskopie, um die Progression von apoptotischen Eigenschaften überwachen.
    Anmerkung 1: Die Zellen, die einer Apoptose wird morphologischen, biochemischen und molekularen Kennzeichen der Apoptose, die durch Mikroskopie und Fluoreszenz-basierten Biosensoren detektiert werden kann an (siehe Protocols 3 und 4).
    Anmerkung 2: Die Inkubationszeit der Zellen mit verschiedenen Apoptose induzieren kann variieren, je nach Zelltyp, Zellbedingungen (wie Konfluenz und Nährstoffzustand), und die Dosis des Todes Stimulus. Sorgfältige Titration erforderlich.
  5. Wenn Zellen anzuzeigen Kennzeichen der Apoptose, entfernen apoptoseinduzierende Mittel durch Waschen der Zellen einmal mit warmem (37 ° C, oder andere normale Kulturtemperatur) frisches Zellkulturmedium.
    Anmerkung 1: Als apoptotischen Zellen werden mehr lose auf befestigtdie Kulturplatte ist es wichtig, anzuwenden und zu entfernen Medium vorsichtig, so dass die Zellen nicht weggeschwemmt werden.
    Anmerkung 2: Phasen suspendierten Zellen können aus dem Überstand durch leichtes Zentrifugieren (160 × g für 1 min) wiedergewonnen und wieder in die Kulturschale gegeben.
  6. Zellen bei 37 ° C mit 2 ml / 35 mm-Schale mit frischem Zellkulturmedium in 5% CO 2. Alternativ können Sie konditionierte Medium (zellfreier von gesunden Zellen gesammelt Kulturmedium) zur weiteren Verbesserung der Überlebensrate von apoptotischen Zellen.
    Hinweis: Waschen und Inkubieren von Zellen mit frischem Medium ermöglichen die Mehrheit der Zellen gegenüber Ethanol-induzierten Apoptose nach Ethanol Exposition 12,13 umzukehren. Jedoch Wiederholen dieses Waschschritt erforderlich, wenn die Zellen auf andere apoptotische Stimuli ausgesetzt werden (siehe Diskussion).

3. Live Cell Microscopy

  1. Wir empfehlen die Verwendung eines invertierten konfokalen oder Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop mit Umweltkontrolle (37 ° C,5% CO 2) für lebende Zellen, Mikroskopie.
    Hinweis: Es ist auch möglich, Bild die Zellen mit aufrechten Mikroskopen mit einem Wassertauchziel. Tauchen Sie das Ziel direkt in das Kulturmedium zur Bildzellen. Jedoch können die Zellen durch das Tauchziel beim Fokussieren zerkleinert werden.
  2. Pre-warm das Mikroskop (wie Umweltsteuerraum, Bühne Inkubator und Ziel Heizung) mindestens 2 Stunden vor der Bildgebung.
    Anmerkung: Dies ermöglicht Mikroskopkomponenten thermo Gleichgewicht aufgrund der thermischen Expansion und Kontraktion der Komponenten zu erreichen, so dass er die Drift des Fokus und der Verschiebung der xy-Ebene zu vermeiden.
  3. Legen Sie eine 35 mm Glasbodenschale von kultivierten Zellen (siehe Protokoll 1) auf der Bühne einem inversen Mikroskop und erfassen Zelle von Bildern mit einem 40X oder 63X-Plan-Apochromat Objektiv mit einer numerischen Apertur (NA) 1.3 oder 1.4 für die Bildgebung von Zellen aus der Boden der Schale durch Deckgläser.
    Hinweis: Vermeiden Sie die Anwendung mehr als 2 ml Mediumbis 35 mm Glasbodenschale, wie das Gewicht des Mediums konnte Krümmung der Glasboden verursachen, was es schwierig macht Bild ein Feld von Zellen mit der gleichen Brennebene.
  4. Pflegen Zellen bei 37 ° C oder der entsprechenden normalen Temperatur während des gesamten Abbildungsprozesses.
    Hinweis: Der Prozess der Apoptose, und wahrscheinlich die Umkehrung der Apoptose abhängig von Temperatur empfindlichen Enzymaktivitäten. Daher sollte die Zellen bei 37 ° C (zB mit einem Mikroskoptisch oberen Inkubators) ist während der gesamten Versuchs wichtig. Verminderte Temperatur könnte sich die apoptotische Reaktion und die Wieder Reaktion nach der Entfernung von apoptotischen Stimulus verlangsamen.
  5. Verwenden Sie eine Feuchtigkeitsschutzeinrichtung oder lag eine transparente Folie (siehe Materialien) auf der Kulturschale um den Wasserverlust durch Verdunstung aus dem Medium zu reduzieren.
    Hinweis: Die Folie kann die Polarität von Licht für DIC-Mikroskopie unterbrechen. Wiederherstellen Polarität durch Anpassung der Polarisator im Strahlengang.
  6. Pflegen pH-Wert in derZellkulturmedium (pH 6.8 -7.3) durch Inkubation in 5% CO 2 mit einem Umgebungssteuerkammer auf dem Mikroskop.
    Anmerkung: Wartung der pH-Wert in einem Kulturmedium kann auch durch Zugabe HEPES-Puffer erreicht werden, oder durch die Verwendung von kommerziellen CO 2 -unabhängigen Medium (siehe Materialien). Optimale Bedingungen können variieren, je nach dem Zelltyp.
  7. Minimieren Fluoreszenz / Laser (Anregungslichtintensität) Exposition von Zellen während des Abbildungsprozesses Phototoxizität durch Verringern der Fluoreszenzintensität zu den niedrig, qualitativ hochwertige Bilder von Zell / subzellulären Strukturen oder exprimiert Biosensoren (Details des Protokolls 4) zu erhalten, zu vermeiden.

4. Strategien zur Detektion und Verfolgung Anastasis während und nach der apoptotischen Ereignisse

  1. Plasmamembran-Bläschenbildung, zytoplasmatische Kondensation, Zellschrumpfung und apoptotische Körper-Bildung (siehe 1A - C, E).
    1. Führen Sie Zeitraffer-Live Cell verschierenzInterferenzKontrast (DIC) oder Phasenkontrastmikroskopie, um eine Gruppe von Gesundheits Zellen zu verfolgen und ihre Zellmorphologie (Siehe Protokoll 3 für Lebendzellmikroskopie, und siehe Diskussion) zu beobachten.
      Hinweis 1: Reduzieren Intensität Lichtquelle für DIC / Phasen Vertrag Bildgebung zu Phototoxizität zu den Zellen zu vermeiden.
      Hinweis 2: Wenn DIC und Phasenkontrastmikroskopie nicht verfügbar sind, verwenden Celltracker die Cytosol Fleck, um die Morphologie von lebenden Zellen für die konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie skizzieren und Überwachung der Zellmorphologie.
    2. Anwenden Zelltod Stimulus an Zellen Apoptose auslösen (siehe Protokoll 2 für die Anwendung und Entfernung von apoptotischen Stimuli).
    3. Beobachten behandelten Zellen zur morphologischen Kennzeichen der Apoptose, wie Plasmamembran blebbing cytoplastisches Kondensation Zellschrumpfung und apoptotische Körper Bildung (1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Wegspülen Tod Reize und Nachschub Zellen mit frischem Medium, wenn die Zellen display morphologischen Kennzeichen der Apoptose.
      Hinweis 1: Tragen Sie Zelltod Reiz oder die Änderung der Zellkulturmedium auf dem Mikroskoptisch bei Zeitraffer-Live Cell Imaging kann mit einem Durchblutung Zellkulturkammer erreicht werden kann, oder kann direkt auf die Zellkulturschale durch vorsichtiges Pipettieren ohne Berührung durchgeführt werden die Schale, während der Intervalle zwischen Bildgebung.
      Anmerkung 2: Verwenden Sie die Fokusdrift-Kompensationssysteme zu unscharf der Zellen durch den Verlust der thermo Gleichgewicht des Mikroskopsystems nach der Änderung der Zellkulturmedium (siehe Diskussion) zu vermeiden.
    5. Kontinuierliche Zeitraffer-Bildgebung, um das Schicksal von Zellen, die Kennzeichen der Apoptose angezeigt verfolgen. Zellen, die Apoptose umkehren kann Schaden zu reparieren und wieder normale flache Morphologie (1A, 1B, 1C, 1E).
  2. Die mitochondriale Fragmentierung, DNA / Chromatin-Kondensation und Kernfragmentierung (siehe 1D, 1F, 1G).
    1. Um mitochond visualisierenria, Flecken Zellen mit 50 nM MitoTracker rot / tief rot / grün-fluoreszierenden Farbstoff und gleichzeitig gefärbt den Kern mit 10 ug / ml Hoechst 33342 blau Kernfarbstoff in einem Kulturmedium für 20 min bei 37 ° C mit 5% CO 2.
      Hinweis 1: Reduzieren Sie die Konzentration der Farbstoffe und Dauer der Inkubation zu Zytotoxizität zu vermeiden und zu reduzieren Hintergrundfluoreszenz bei Bedarf. Optimierung der Färbebedingungen ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis mit der minimalen Menge an Farbstoff und der Inkubationszeit auf die Färbung zu erhalten.
      Hinweis 2: Verwenden Fluoreszenzfarbstoffe für Mitochondrien wie MitoTracker Red CMXRos, MitoTracker Deep Red FM oder MitoTracker Grün FM, die nicht auslaufen wird aus den Mitochondrien während der Apoptose. Dies ermöglicht die Visualisierung der mitochondrialen Morphologie während der Apoptose und Rekonvaleszenz. Siehe die Materialien und Geräte-Tabelle für Einzelheiten zu diesen Flecken.
    2. Halten gefärbten Zellen im Dunkeln zu Ausbleichen zu vermeiden.
    3. Überschüssiges Fleck durch Waschen der Zellen3 mal mit 37 ° C phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder frisches Zellkulturmedium mit 1 min Inkubation in frisches Medium zwischen Waschen und dann weiter in frischem Medium, 20 min vor der endgültigen Waschmäßiger zu ermöglichen Flecken, um die Zellen zu verlassen, um zu reduzieren unspezifische Signal Hintergrund für die Bildgebung.
      Hinweis: Kürzen Inkubationszeiten mit Zellmedium nach der Färbung kann in hohen Hintergrund für die Bildgebung führen.
    4. Führen Sie Echtzeit-Live-Cell-konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie für Bild in gesunden Zellen vor apoptotischen Induktions angewendet wird (siehe Protokoll 3 für Lebendzellmikroskopie).
      Hinweis: Gesunde Zellen anzuzeigen Rohr Mitochondrien und runden Kernen in den meisten Zelltypen (1D, 1F, 1G).
    5. Triggerzellen Apoptose (siehe Protokoll 2 für die Anwendung und Entfernung von apoptotischen Stimuli zu den Zellen).
    6. Weiter Zeitraffer-Lebendzellmikroskopie, Änderungen in der mitochondrialen und Kern morpholog beobachtenies unmittelbar nach dem Tod Reiz auf die Zellen aufgebracht. Beachten Zellen Kennzeichen der Apoptose, wie mitochondriale Fragmentierung und Schwellungen, Chromatin-Kondensation und Kernfragmentierung angezeigt, im Gegensatz zu gesunden Zellen, die Mitochondrien und Rohr runden Kernen.
    7. Wenn Zellen anzuzeigen Kennzeichen der Apoptose, waschen und versorgen die Zellen mit frischem Medium, und weiter Zeitraffer-Bildgebung, um das Schicksal von Zellen zu verfolgen. Zellen, die Apoptose wieder rückgängig normalen mitochondrialen und Kernmorphologie (1D, 1F, 1G).
      Anmerkung: Führen DIC-Mikroskopie in parallel, wenn möglich, zusätzliche Informationen für den Zugriff auf die Phasen der Apoptose durch Beobachten der Änderungen der Zellmorphologie in der gleichen Gruppe von Zellen (siehe Protokoll 4.1 für DIC-Mikroskopie) erhalten.
  3. Der Nachweis von mitochondrialen Freisetzung von Cytochrom c unter Verwendung von Zellen eine Cytochrom-c--GFP Fusion pr stabil exprimierenotein (siehe Abbildung 2).
    1. Stain-Zellen, die Cytochrom-c--GFP 23,24 mit MitoTracker Red beschriften polarisierten Zelle Mitochondrien (siehe Schritte 4.2.1 bis 4.2.3 für Live Cell Mitochondrien-Färbung).
    2. Führen Sie Echtzeit-Live-Cell-konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie zu verfolgen gesunde Zellen (Einzelheiten in Protokoll 3 für Live Cell Imaging).
      Anmerkung: Die Cytochrom c-GFP-Signal lokalisiert vornehmlich in den Mitochondrien der gesunden Zellen (2A i, 2B).
    3. Triggerzellen Apoptose (siehe Protokoll 2 für die Anwendung und Entfernung von apoptotischen Stimuli zu den Zellen). Weiter Zeitraffer-Mikroskopie zur Translokation von Cytochrom c aus Mitochondrien -GFP in das Cytosol zu beobachten (Abbildungen 2Aii-iii, 2B).
      Anmerkung: Mitochondrial Freisetzung von Cytochrom c in das Cytosol ein Marker der mitochondrialen Außenmembran Permeabilisierung (MOMP)4 ist ein kritischer Schritt bei der Mitochondrien-abhängige Apoptose 21,22
    4. Wenn Zellen die Cytochrom-c--GFP Signal im Zytoplasma, entfernen Sie den Zelltod Reiz und Versorgungs Zellen mit frischem Medium (siehe Protokoll 2). Weiter Zeitraffer-Bildgebung, um das Schicksal von Zellen mit GFP cytosolische verfolgen.
      Hinweis: Zellen, die Apoptose rückwärts wieder normale Zellmorphologie, und reduzieren ihre zytosolische Cytochrom c -GFP Signal vermutlich durch Abbau oder Verlagerung zurück in den Mitochondrien (Abbildungen 2Aiv-vii, 2B).
    5. Erfassen DIC Bilder parallel, um zusätzliche Informationen für den Zugriff auf die Phasen der Apoptose durch Beobachten Veränderungen in der Zellmorphologie in einzelne Zellen oder Gruppen von Zellen (siehe Protokoll 4.1 für DIC-Mikroskopie) erhalten.
  4. Nachweis von Caspase-Aktivität unter Verwendung eines Caspase-Biosensor (siehe 3)
    1. Transfektion von Zellen mit dem Caspase Biosensor NES-DEVD-YFP-NLS für16 bis 24 Stunden, bevor sie einer einen apoptotischen Stimulus 13.
    2. Färben die transfizierten Kulturen mit Hoechst 33342, um Zellkerne zu kennzeichnen (siehe Schritte 4.2.1 bis 4.2.3 für Lebendzellkernfärbung).
    3. Führen Sie Echtzeit-Live-Cell-konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie zu verfolgen gesunde Zellen (Einzelheiten in Protokoll 3 für Live Cell Imaging).
      Hinweis: Das NES-DEVD-YFP-NLS-Biosensor-Signal lokalisiert hauptsächlich im Cytosol von gesunden Zellen aufgrund seiner Kernexportsignal (NES) (3A, 3Bi und 3C finden Diskussion).
    4. Triggerzellen Apoptose (siehe Protokoll 2 für die Anwendung und Entfernung von apoptotischen Stimuli zu den Zellen). Weiter Zeitraffer-Mikroskopie, um nukleäre Translokation von YFP beobachten.
      Hinweis: Die Aktivierung von Caspasen spaltet die DEVD Motiv in der Caspase Biosensor NES-DEVD-YFP-NLS, was zu YFP-NLS Translokation vom Zytosol in den Zellkern (3A, 3Bii-iv, siehe Diskussion).
    5. Wenn Zellen anzuzeigen Kern YFP, entfernen Sie den apoptotischen Stimulus und Versorgungs Zellen mit frischem Medium (siehe Protokoll 2).
      Anmerkung: Die Zellen, die Apoptose wieder normale Zellmorphologie umkehren, aber die Kern YFP Signal (Figuren 3 BV-x, Zellen 1 und 2, und 3D) zu halten.
    6. Weiter Zeitraffer-Bildgebung, um das Schicksal von Zellen, die Kern YFP Anzeige verfolgen.
      Hinweis: Die Kern YFP-Signal wird abgebaut mehrere Stunden werden nach der Zellen Apoptose umgekehrt (3B, vi-x, Cell 1, siehe Ergebnisse und Diskussion) vermutlich durch normale Zellabstand Mechanismen wie Proteasom-Abbau.
    7. Erfassen DIC Bilder parallel, um zusätzliche Informationen für den Zugriff auf die Phasen der Apoptose durch Beobachten Veränderungen in der Zellmorphologie in einzelnen Zellen oder einer Gruppe von Zellen zu erhalten. (Siehe Protokoll 4.1 für DIC-Mikroskopie).
  5. Zelloberflächenexposition von Phosphatidylserin (siehe 4)
    1. Samenzellen auf glass Deckgläser zu 80% Zellkonfluenz (siehe Protokoll 1) zu erzielen.
    2. Co-färben die Zellen mit rot-fluoreszierende MitoTracker und blaue Hoechst 33342-Färbung für Mitochondrien und Zellkerne, bzw. (siehe Schritte 4.2.1 bis 4.2.3 für Live Cell mitochondrialen und Kernfärbung).
    3. Triggerzellen, die Apoptose durch die Verwendung eines Apoptose-Induktor zu unterziehen (siehe Protokoll 2).
    4. Anwenden fluoreszenzmarkierten Annexin V (siehe Materialien), den apoptotischen Zellen bei 37 ° C vor der Entfernung der Apoptose-Induktor, um die Exposition von Phosphatidylserin auf der Oberfläche der apoptotischen Zellen nachzuweisen Fleck 10 min.
      Anmerkung 1: Gesunde Zellen werden nicht mit Annexin V gefärbten weil Phosphatidylserin ist normalerweise auf der inneren Blatt der Plasmamembran der Zelle 38 abgesondert. Apoptotische Zellen werden mit Annexin V, das an Phosphatidylserin an der Zelloberfläche (4A und 4B) bindet gefärbt.
      Hinweis 2: fluoreszenzmarkierten Annexin V kann auch angewendet zu färben apoptotischen Zellen imm werdenediately nach Entfernen der Apoptose-Induktor, mit 10 Minuten Inkubation.
    5. Entfernen Zelltod Stimulus, Waschen der gefärbten Zellen mit warmer PBS oder frisches Medium einmal und dann den Zellen mit frischem Medium, 2 h bei 37 ° C mit 5% CO 2 (siehe Protokoll 2).
      Hinweis 1: Zellen, die Apoptose wieder normale Morphologie und bewahren fluoreszenzmarkierten Annexin V-Signal nach der Wiedererlangung normaler Morphologie umgekehrt (4A und 4B).
      Anmerkung 2: Der Annexin V-Signal mit der Zeit auf gewonnenen Zellen (siehe Diskussion) abnimmt.
    6. Fix Zellen an ausgewählten Zeitpunkten mit 4% Paraformaldehyd, enthaltend 8% Saccharose in 1 × PBS für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur und Waschen der fixierten Zellen mit PBS 3x Paraformaldehyd vor der Montage-Zellen auf Glasobjektträger zu entfernen Deckgläser mit Antibleich mountant (siehe Materialien) für die konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie und beobachten Annexin V an Zellen nach dem Entfernen der Apoptose-Induktor.
      Anmerkung 1: Saccharose in Fixativ bewahrt Zellmembranstruktur während der Fixierung.
      Anmerkung 2: Speichern Sie die Paraformaldehydlösung in Dunkeln bei 4 ° C, um den Abbau zu verhindern.
      Anmerkung 3: Warm up Paraformaldehydlösung auf Raumtemperatur, bevor es zu den Zellen zur Befestigung an Kälteschock zu den Zellen zu vermeiden.

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Ergebnisse

Um die Auflösung der Apoptose zu untersuchen, werden Gewebekulturzellen zunächst auf einen Tod Reiz ausgesetzt, die Apoptose auslösen. Wenn die Zellen anzuzeigen Kennzeichen der Apoptose wird frisches Kulturmedium dann angewendet, um abzuwaschen den Reiz und bebrüten die sterbenden Zellen der Besserung (1A) zu ermöglichen. Hier ist die entscheidende Frage angesprochen, wie weit einzelne sterben kultivierten Zellen gegenüber Apoptose Fortschritt und noch anastasis eingehen können. Diese Frage lässt sich ...

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Diskussion

Anastasis bezieht sich auf das Phänomen, bei dem Zellen, Zelltod aktiviert haben danach rückgängig den Sterbeprozess und zu überleben. Hier haben wir gezeigt, dass die Abbildung lebender Zellen verwendet werden, um zu bestätigen, dass die gleichen Einzelzellen in der Tat kann Apoptose-Prozess in einer späten Phase umkehren, und dann weiter überlebende und Wiedergabe werden. Unsere Protokolle beschreiben mehrere optimierte Zelltyp-spezifischen Behandlungsbedingungen, Apoptose zu induzieren und lassen einen großen Anteil ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Rev. Dr. Ralph Bohlmann und Rev. Dr. James Voelz für die Annahme, die das Wort "Anastasis", um Umkehr der Apoptose zu beschreiben; Douglas R. Green für HeLa-Zellen, die Cytochrom-c--GFP; Charles M. Rudin und Eric E. Gardner für H446-Zellen; Heather Lamb für die Unterstützung bei Cartoon-Zeichnung auf dem Video; Yee Hui Yeo für wertvolle Diskussion des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von einem Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), die Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (HLT), Fulbright-Stipendium 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation Fellowship (HLT) unterstützt wird, gewährt NIH NS037402 (JMH) und NS083373 (JMH) und University Grants Committee der Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang ist ein Shurl und Kay Curci Foundation Fellow der Life Sciences Research Foundation.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
LSM780 KonfokalmikroskopieCarl Zeiss
GlasbodenkulturschaleMatTek CorporationP35G-0-14-C
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Referenzen

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