Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.

Abstract

Diese Handschrift zeigt ein Protokoll für die effiziente Erstellung Integration freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) aus dem peripheren Blut mit episomalen Plasmiden und Histon-Deacetylase (HDAC) Inhibitoren. Die Vorteile dieses Ansatzes sind: (1) die Verwendung einer minimalen Menge von peripherem Blut als Ausgangsmaterial; (2) nonintegrating Umprogrammierung Vektoren; (3) eine kostengünstige Methode zur Erzeugung von Vektor freien iPSCs; (4) einen einzigen Transfektion; und (5) die Verwendung von kleinen Molekülen an epigenetische Neuprogrammierung zu erleichtern. Kurz gesagt, werden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von Routine Phlebotomie Proben isoliert und dann in einem definierten Wachstumsfaktoren kultiviert, um eine hoch proliferativen Erythrozytenvorläuferzellpopulation, die bemerkenswert zugänglich Umprogrammierung ergeben. Nonintegrating, nontransmissible episomalen Plasmiden OCT4, SOX2, KLF4, MycL, LIN28A und eine p53 short hairpin (sh) RNA sind Einfühüber eine einzige Nukleofektion in den abgeleiteten Erythroblasten ced. Kotransfektion Episom das Enhanced Green Fluorescent Protein exprimiert (eGFP) ermöglicht die einfache Identifizierung von transfizierten Zellen. Eine separate replikationsdefizienten Plasmid, Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) ebenfalls zu dem Reaktionsgemisch für eine erhöhte Expression von Proteinen episomal zugegeben. Die transfizierten Zellen werden dann auf eine Schicht aus bestrahlten embryonalen Maus-Fibroblasten (iMEFs) zum fort Umprogrammierung plattiert. Sobald iPSC artige Kolonien erscheinen etwa zwölf Tage nach Nukleofektion, sind HDAC-Inhibitoren zu dem Medium gegeben, um epigenetische Umbau erleichtert. Wir haben gefunden, dass der Einschluss von HDAC-Inhibitoren routine erhöht die Entwicklung vollständig reprogrammiert iPSC Kolonien das 2-fache. Sobald iPSC Kolonien zeigen typischen menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) Morphologie, sie sanft zu einzelnen IMEF beschichteten Gewebekulturplatten für das weitere Wachstum und die Expansion übertragen werden.

Introduction

iPS-Zellen werden aus somatischen Geweben über ektopische Expression von einem minimalen Satz von Pluripotenz-Gene abgeleitet. Diese Technik wurde ursprünglich von retroviralen Transduktion von humanen Fibroblasten mit OCT4, SOX2, KLF4 und cMYC, die besonders in den pluripotenten Zustand ¹ ausgedrückt werden demonstriert. Diese transient exprimiert "Reprogrammierungsfaktoren" alter epigenetische Landschaft und Genexpressionsprofil der Zielzelle analog zu menschlichen embryonalen Stammzellen ^2. Einmal erstellt, können iPS-Zellen potenziell in jede Gewebeart zur weiteren Untersuchung differenziert werden. So halten sie versprechen für den Einsatz in der regenerativen Medizin, Krankheitsmodelle und Gentherapieanwendungen. , Stören das Genom mit der Integration von Viren hat jedoch das Potenzial, um die endogene Genexpression beeinflussen zelluläre Phänotyp zu ändern und letztendlich vorspannen wissenschaftlichen Ergebnissen. Darüber hinaus können Zufalls virale Integrationen zu schädlichen Zell e führenUSWIRKUNGEN, einschließlich der Möglichkeit der malignen Transformation ³ oder Wieder Expression der Transgene onkogenen ^4. Zukünftige klinische Anwendungen benötigen nicht-integrierenden iPSC Generation.

Episomen, die zusätzliche chromosomale zirkuläre DNA-Moleküle sind, bieten eine Strategie, um kostengünstige, Integration freien IPSCs ⁵ zu erzeugen. Die Kombination von in Tabelle 1 gezeigt episomalen Vektoren auszudrücken das Reprogrammierungsfaktoren OCT4, SOX2, KLF4, MycL und LIN28A. Die pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F-Plasmid enthält auch eine p53 shRNA für temporäre Unterdrückung der TP53 an zelluläre Reprogrammierung ⁶ verbessern. Die replikationsdefizienten pCXWB-EBNA1-Vektor fördert Amplifikation Reprogrammierungsfaktoren und erhöhte Effizienz Neuprogrammierung durch eine vorübergehende Erhöhung der Expression EBNA1 ^7. Die pCXLE_EGFP Plasmid kann zum Nukleofektion Gemisch zum Zwecke der dete hinzugefügt werdenrmining die Transfektionseffizienz oder zur Zellsortierung. Mit Ausnahme von p-CXWB EBNA1, die episomalen Plasmiden in diesem Protokoll verwendet werden, enthalten den Epstein-Barr-Virus Ursprung der viralen Replikation und EBNA1-Gen, das die Replikation und Teilung des Episom während der Teilung der Wirtszelle ⁸ zu vermitteln. Die Episomen spontan verlor aufeinander iPSC Expansion ^7. Subklonierung und Charakterisierung von iPS-Zellen mit episomalen Vektor Verlust, die aus dem Verlust von eGFP Expression geschlossen werden kann, kann vollständig Integration kostenlos IPSCs für zukünftige klinische Anwendungen führen.

Inhärente dem Verfahren iPSC Generation Unterdrückung von linienspezifischen Genen und Reaktivierung von Pluripotenz-assoziierten Genen. Regulation der Genexpression erfolgt auf mehreren Ebenen innerhalb des Ringes, einschließlich Modifikationen an DNA und Chromatin Transkriptionsfaktoren erlauben, regulatorische DNA-Elemente, und die RNA-Polymerase den Zugang zu ZielGene. Umbau des epigenetischen Landschaft über weltweite Chromatinmodifikationen ist eine Schlüsselkomponente erneut Ausdruck der Pluripotenz genetische Programm. Eine spezifische Chromatin Modifikation, bei der Regulation der Genexpression wichtig ist, ist die Acetylierung von Histonen in bestimmten Lysinreste, die den Zugriff ermöglicht, um Gene durch die verringerte Spannung der Histon-DNA Spule Ziel. HDAC-Inhibitoren sind kleine Moleküle, die gezeigt haben, um iPSC Umprogrammierung und hESC Selbsterneuerung ^9,10 erweitern, die wahrscheinlich auf die Unterstützung der acetylierten Zustand ^11. Die nachfolgend beschriebene Protokoll aus einer früheren Veröffentlichung mit Integration Lentiviren ¹² angepasst, bietet eine Schritt-für-Schritt-Methode zur optimierten iPSC Generation aus dem peripheren Blut mit Episomen und HDAC-Inhibitoren. Die HDAC-Inhibitor-Konzentrationen werden dabei die Hälfte derjenigen von Ware et al. ⁹ und routinemäßig in eine 2-fache Zunahme in vollständig umprogrammiert iPSC Kolonien über Standard führtenepisomaler Umprogrammierung Protokolle ohne HDAC-Inhibitoren. Dieses Niveau der Umprogrammierung ist auf Augenhöhe mit der Effizienz beobachten wir mit lentiviralen Methoden. Mit diesem Protokoll haben wir effizient erzeugt iPSC von Einzelpersonen so alt wie 87 Jahre alt.

Protocol

Eine schriftliche Einverständniserklärung, wie sie durch die Institutional Review Boards des Fred Hutchinson Cancer Research Center und die Kinder "s Hospital von Philadelphia genehmigt wurde von Patienten vor dem Sammeln peripheren Blutproben erhalten. Alle institutionellen Richtlinien festgestellt. Alle Tierversuche einschließlich MEF Erzeugung und Teratom Bildung wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Ficoll Separation von PBMCs und Ausbau der Erythroblasten - Tag 0

1. Verdünnte peripheren Blut 1: 1 mit Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS). In einem 15 ml Rundbodenpolystyrolröhrchen vorsichtig Schicht 7 ml des verdünnten Blutes auf 3 ml Raumtemperatur Ficoll-Hypaque.
2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 g für 30 min.
3. Die PBMCs werden in die Grenzfläche zwischen dem Plasma und dem Ficoll-Hypaque, als trübe weiße Schicht gesehen niedergelassen haben. Mit einer sterilen Transferpipette, sammeln die PBMCs in einem 15 ml konischen Röhrchen. Bringen Sie die Lautstärke auf 10 ml mit DPBS.
4. Mit einem Hämazytometer, zähle die PBMCs.
5. Pipette 2 × 10 ⁶ PBMCs in einen separaten 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. Spin-down die restlichen Zellen und Einfrieren bei einer Konzentration von 2 × 10 ⁶ PBMC / ml in 90% fötalem Rinderserum (FBS) / 10% Dimethylsulfoxid (DMSO).
6. Bereiten Expansion Medium: QBSF-60 Serum freiem Medium (vor Licht schützen) + Penicillin / Streptomycin (1%) + Ascorbinsäure (50 ng / ml) + Stammzellfaktor (SCF, 50 ng / ml) + Interleukin 3 (IL 3, 10 ng / ml) + Erythropoietin (EPO, 2 U / ml) + Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + Dexamethason (1 uM; vor Licht schützen; auftauen einem anderen aliquoten Teil jedes Medium ändern).
7. Resuspendieren 2 × 10 ⁶ PBMCs in 2 ml frisch zubereitete Expansionsmedium und in eine Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte legen und inkubieren in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% O _2, 5% CO ₂ und 90% N _2.
8. An Tag 3 und Tag 6, ersetzen Medien.
   1. Sammeln Sie die Zellen und waschen die gut mit 2 ml QBSF-60, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln.
   2. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 xg für 5 min und saugen Sie den Überstand.
   3. Die Zellen in 2 ml neue Expansionsmedium und bringt sie auf den gleichen 12-Well-Platte.

2. Reprogrammierung Zellen durch Nucleofection - Tag 9

1. Pipettieren Sie die Umprogrammierung Plasmide in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen (Tabelle 1).
2. Mischen Sie die Nukleofektion Lösung mit Supplement (vom Hersteller mitgeliefert) und Pipette in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
3. Pipette 2 ml des Expansionsmediums in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte und in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC (5% O _2, 5% CO ₂ und 90% N ₂₎ für die Äquilibrierung vor der Zugabe von Zellen.
4. Sammeln Sie diekultivierten Zellen und waschen Sie die gut mit 2 ml QBSF-60, um die verbleibenden Zellen zu sammeln.
5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 xg für 5 min und saugen Sie den Überstand.
6. Die Zellen werden durch Resuspendieren in 5 ml DPBS und Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min.
7. Saugen Sie den Überstand.
8. Zellpellet in 100 ul Nukleofektion Lösung + Beilage, wobei darauf zu Erzeugen von Blasen zu vermeiden.
9. Pipettieren der Zellsuspension in die Röhre, die die Neuprogrammierung Plasmide, Pipette auf und ab sofort, und pipettieren die Probe in den unteren Bereich des Nukleofektion Küvette.
10. Setzen Sie die Küvette in die Nukleofektion Maschine und Programm ausführen T-019.
11. Übertragen Sie 100 ul der vorgewärmten Expansionsmedium (von der ausgleichenden Platte in Schritt 2.3) in die Nukleofektion Küvette.
12. Sofort sammeln Sie das gesamte Probe und Einzahlung in den Brunnen der vorgewärmten Expansionsmedium. Vermeiden Sie das Sammeln der weiß, schwimm toten Zelltrümmer.
13. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC (5% O _2, 5% CO ₂ und 90% N ₂₎ zu wachsen.

3. Überzug Feeder-Zellen - Tag 10 oder 11

1. Am Tag 10, Platte Feeder-Zellen.
   1. Coat ein 6-Well-Gewebekulturplatte mit Gelatine.
      1. Pipette 1 m von 0,1% Gelatine in Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) in jede Vertiefung der Platte.
      2. Die Platte wird in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator für mindestens 5 min.
      3. Unmittelbar vor dem Gebrauch absaugen Gelatinelösung von der Platte.
   2. Auftauen einer Ampulle von 2 × 10 ⁶ embryonalen Maus-Fibroblasten mit 3000 cGy bestrahlt, in 10 ml vorgewärmtem MEF Medien (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (10%) + Penicillin / Streptomycin (1%)).
   3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 xg für 5 min und saugen Sie den Überstand. Die Zellen in 12 ml MEF Medien und Pipette 2 ml inin jeder Vertiefung der mit Gelatine beschichtete 6-Well-Platte. Die Platte wird in einem befeuchteten 37 ° C-Inkubator (5% O _2, 5% CO ₂ und 90% N _2), bis 12. Tag.

4. Plattierzellen auf Feeder-Zellen und ändern Medium - Tag 12

1. Sammeln Sie die nucleofected Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen und sammeln Sie alle restlichen Zellen durch Waschen der gut mit 2 ml QBSF-60. Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 xg für 5 min.
2. Bereiten Reprogrammierung Medium: Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) + FBS (10%) + nicht-tierischen L-Glutamin (1 mM) + nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA, 1%) + Penicillin / Streptomycin (1%) + β Mercaptoethanol (0,1 mm) + basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, fügte frisch bei Fütterung, 10 ng / ml) + Ascorbinsäure (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 50 ug / ml).
3. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 12 ml Reprogrammierung Medium. Pipette 2 ml pro Vertiefung der Zellsuspension inder 6-Well-Platte von Feederzellen (wie in Abschnitt 3 hergestellt). Zentrifugieren Sie die Platte bei 50 g für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC (5% O _2, 5% CO ₂ und 90% N ₂₎ zu wachsen. Ändern Sie die Umprogrammierung Medium jeden zweiten Tag, bis iPSC Kolonien beginnen erscheinen (1-2 Wochen).
5. Bereiten hESC Medium: DMEM / F12 1: 1 + Knockout Serum Replacement (20%) + Penicillin / Streptomycin (1%) + NEAA (1%) + nicht-tierischen L-Glutamin (1 mM) + Natriumpyruvat (1%) + Natriumbicarbonat (0,12%) + β-Mercaptoethanol (0,1 mM) + bFGF (aufgenommen bei frischen Zufuhr, 10 ng / ml)
6. Bereiten HDAC-Inhibitoren: Natriumbutyrat (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 100 uM), suberanilohydroxamic Säure (SAHA, fügte frisch bei Fütterung, 200 Nm). Sobald iPSC Kolonien erscheinen, beginnen Fütterung der Zellen mit hES Medium + HDAC-Inhibitoren, wechselnde Medium jeden Tag.
   HINWEIS: Sodium Butyrat ist ein kleines Molekül, das in Kunststoffröhrchen adsorbiert ist, therefore speichern sie in einer Borosilikatglas Rohr bei 4 ° C.

5. Isola iPSC Clones

1. Sobald iPSC Kolonien groß genug sind, um isoliert werden (20-25 Zellen), holen sie mit einem P20-Pipette.
2. Bereiten HDAC-Inhibitoren: Natriumbutyrat (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 100 uM), Sacha (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 200 nM)
3. Legen Sie die isolierte Kolonien auf iMEFs in einzelnen 35 mm Schalen mit hESC Medium + HDAC-Inhibitoren + Cloning & Recovery Supplement.
4. Der Tag nach der Ernte die Kolonien, ändern Sie das Medium, um hESC Medium + HDAC-Inhibitoren.
5. Ändern Sie das Medium täglich bis iPSC Kolonien sind bereit für das Passagieren.
6. Entfernen HDAC-Inhibitoren aus dem Medium einmal Kolonien Stabilisierung bei Passage 2-3.

Results

Drei Tage nach Nukleofektion und vor dem Ausplattieren der Zellen auf nucleofected iMEFs sollte die Effizienz der erfolgreichen Nukleofektion durch Fluoreszenzmikroskopie für eGFP geschätzt werden. Figur 1 zeigt einen typischen Nukleofektion Experiment mit etwa 5-10% der Gesamtzellpopulation exprimiert eGFP.

Reprogrammed iPSC Kolonien beginnen, etwa zwei Wochen nach Nukleofektion erscheinen. Die Kolonien sind in der Regel kreisförmig mit gut definierten Grenzen und können du...

Discussion

Für eine erfolgreiche iPSC Generation, wenn Sie dieses Protokoll, gibt es mehrere wichtige Einschränkungen, die berücksichtigt werden sollten. Während der Erythroblasten Ausbaustufe sollte die Medienwechsel Zeitplan strikt eingehalten werden, da Abweichungen können zu einer ineffizienten Stimulation des Zielvorläuferzellpopulation und einer niedrigeren Effizienz iPSC Generation führen. Es ist wichtig, neue Expansionsmedium mit frischem Dexamethason mit jedem Medienwechsel zu machen; und die QBSF-60 Basismedium und Dexam...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Bei 4 °C lagern. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Store at 4 °C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Lagern bei 4 >C.
fötales Rinderserum (FBS)	Life Technologies	10437028	Lagern bei -20 & Grad; C bis zur Nötigung. Auftauen, aliquotieren, bei 4 °C lagern.
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Bei Raumtemperatur lagern.
QBSF-60 serumfreies Medium	Fisher Scientific	50-983-234	Bei 4 & Grad C lagern.
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122	Lagern bei 4 & Grad.
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003	Bei 4 & Grad C lagern.
2%ige Gelatinelösung	Sigma-Aldrich	G1393	Bei 4 Grad lagern; C, verflüssigen in 37 & Grad; C Wasserbad vor Gebrauch.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Lagern bei 4 & Grad.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Store bei 4 >C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Lagern bei 4 & Grad.
L-Glutamin, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Aliquot, einfrieren bei -20 °C.
nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Bei 4 > C, weg von Licht.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Lagern bei 4 & Grad.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Aliquot, einfrieren bei -20 °C.
Natriumpyruvat, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Bei 4 & °C lagern.
Natriumbicarbonat, 7,5 %	Life Technologies	25080094	Bei 4 °C lagern.
basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	10 mg/ml Brühe in DPBS herstellen, aliquotieren, bei -20 °C einfrieren. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
Natriumbutyrat	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Herstellung 2000x Rohmaterial (400 mM) in DPBS, aliquot, einfrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
hES-Zellklonierung & Regenerationsergänzungsmittel	Stemgent	01-0014-500	Bei -20 > lagern; C bis zur Nötigung. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
ESC-qualifiziertes BD-Matrigel	BD Biosciences	35-4277	Tauwetter über Nacht auf Eis bei 4 Grad; C, aliquotiert in vorgekühlte Röhrchen mit vorgekühlten Pipettenspitzen. Bei -20 Grad lagern; C bis zur Nötigung. Tauwetter bei 4 Grad; C, sofort verwenden.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Aliquot, einfrieren bei -20 °C.
Ascorbinsäure, pulverisiert	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	5 mg/ml Vorrat in DPBS, Sterilfilter, bei 4 μC lagern.
rekombinanter humaner Stammzellfaktor (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Fabrikat 100 μ g/m-Lagerbestand in SFEM, aliquot, eingefroren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
rekombinantes humanes Interleukin 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Fabrikat 100 μ g/ml Bestand in SFEM, aliquot, einfrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
Erythropoietin (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Herstellung von 1000 U/ml Rohmaterial in SFEM, aliquot, einfrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
rekombinanter humaner insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Fabrikat 100 μ g/ml Bestand in SFEM, aliquot, einfrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	1000x (100 mM) in DPBS herstellen.
Dexamethason	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Fabrikat 50x Lagerbestand (50 μ M) in DPBS, Sterilfilter, bei 4 °C lagern.
SAHA (Vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Herstellung von 2.000x Rohmaterial (400 mM) in DPBS, aliquot, Gefrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
12-Well-Gewebekulturplatte	Fisher Scientific	08-772-29
15 ml konisches Röhrchen	Sarstedt	62553002
1,5 ml Eppendorf-Röhrchen	Fisher Scientific	05-408-129
6-Well-Gewebekulturplatte	Fisher Scientific	08-772-1B
35 mm Tisue-Kulturplatten	BD Biosciences	353001
10 ml serologische Einwegpipetten	Fisher Scientific	13-675-20
5 ml serologische Einwegpipetten	Fisher Scientific	13-675-22
2 ml serologische Einwegpipetten	Fisher Scientific	13-675-17
20 μ l Pipettenspitzen, Barrierespitzen	Genessee	24-404
Glas Pasteurpipetten	Fisher Scientific	13-678-20D
Pipettenhilfe	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgen	27082
pCXWB-EBNA1	Addgen	37624