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Methodenartikel

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

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DOI:

10.3791/52009

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28. Oktober 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Division of Hematology, The Children's Hospital of Philadelphia, 3Department of Pathology, The Children's Hospital of Philadelphia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.

Zusammenfassung

Diese Handschrift zeigt ein Protokoll für die effiziente Erstellung Integration freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) aus dem peripheren Blut mit episomalen Plasmiden und Histon-Deacetylase (HDAC) Inhibitoren. Die Vorteile dieses Ansatzes sind: (1) die Verwendung einer minimalen Menge von peripherem Blut als Ausgangsmaterial; (2) nonintegrating Umprogrammierung Vektoren; (3) eine kostengünstige Methode zur Erzeugung von Vektor freien iPSCs; (4) einen einzigen Transfektion; und (5) die Verwendung von kleinen Molekülen an epigenetische Neuprogrammierung zu erleichtern. Kurz gesagt, werden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von Routine Phlebotomie Proben isoliert und dann in einem definierten Wachstumsfaktoren kultiviert, um eine hoch proliferativen Erythrozytenvorläuferzellpopulation, die bemerkenswert zugänglich Umprogrammierung ergeben. Nonintegrating, nontransmissible episomalen Plasmiden OCT4, SOX2, KLF4, MycL, LIN28A und eine p53 short hairpin (sh) RNA sind Einfühüber eine einzige Nukleofektion in den abgeleiteten Erythroblasten ced. Kotransfektion Episom das Enhanced Green Fluorescent Protein exprimiert (eGFP) ermöglicht die einfache Identifizierung von transfizierten Zellen. Eine separate replikationsdefizienten Plasmid, Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) ebenfalls zu dem Reaktionsgemisch für eine erhöhte Expression von Proteinen episomal zugegeben. Die transfizierten Zellen werden dann auf eine Schicht aus bestrahlten embryonalen Maus-Fibroblasten (iMEFs) zum fort Umprogrammierung plattiert. Sobald iPSC artige Kolonien erscheinen etwa zwölf Tage nach Nukleofektion, sind HDAC-Inhibitoren zu dem Medium gegeben, um epigenetische Umbau erleichtert. Wir haben gefunden, dass der Einschluss von HDAC-Inhibitoren routine erhöht die Entwicklung vollständig reprogrammiert iPSC Kolonien das 2-fache. Sobald iPSC Kolonien zeigen typischen menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) Morphologie, sie sanft zu einzelnen IMEF beschichteten Gewebekulturplatten für das weitere Wachstum und die Expansion übertragen werden.

Einleitung

iPS-Zellen werden aus somatischen Geweben über ektopische Expression von einem minimalen Satz von Pluripotenz-Gene abgeleitet. Diese Technik wurde ursprünglich von retroviralen Transduktion von humanen Fibroblasten mit OCT4, SOX2, KLF4 und cMYC, die besonders in den pluripotenten Zustand 1 ausgedrückt werden demonstriert. Diese transient exprimiert "Reprogrammierungsfaktoren" alter epigenetische Landschaft und Genexpressionsprofil der Zielzelle analog zu menschlichen embryonalen Stammzellen 2. Einmal erstellt, können iPS-Zellen potenziell in jede Gewebeart zur weiteren Untersuchung differenziert werden. So halten sie versprechen für den Einsatz in der regenerativen Medizin, Krankheitsmodelle und Gentherapieanwendungen. , Stören das Genom mit der Integration von Viren hat jedoch das Potenzial, um die endogene Genexpression beeinflussen zelluläre Phänotyp zu ändern und letztendlich vorspannen wissenschaftlichen Ergebnissen. Darüber hinaus können Zufalls virale Integrationen zu schädlichen Zell e führenUSWIRKUNGEN, einschließlich der Möglichkeit der malignen Transformation 3 oder Wieder Expression der Transgene onkogenen 4. Zukünftige klinische Anwendungen benötigen nicht-integrierenden iPSC Generation.

Episomen, die zusätzliche chromosomale zirkuläre DNA-Moleküle sind, bieten eine Strategie, um kostengünstige, Integration freien IPSCs 5 zu erzeugen. Die Kombination von in Tabelle 1 gezeigt episomalen Vektoren auszudrücken das Reprogrammierungsfaktoren OCT4, SOX2, KLF4, MycL und LIN28A. Die pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F-Plasmid enthält auch eine p53 shRNA für temporäre Unterdrückung der TP53 an zelluläre Reprogrammierung 6 verbessern. Die replikationsdefizienten pCXWB-EBNA1-Vektor fördert Amplifikation Reprogrammierungsfaktoren und erhöhte Effizienz Neuprogrammierung durch eine vorübergehende Erhöhung der Expression EBNA1 7. Die pCXLE_EGFP Plasmid kann zum Nukleofektion Gemisch zum Zwecke der dete hinzugefügt werdenrmining die Transfektionseffizienz oder zur Zellsortierung. Mit Ausnahme von p-CXWB EBNA1, die episomalen Plasmiden in diesem Protokoll verwendet werden, enthalten den Epstein-Barr-Virus Ursprung der viralen Replikation und EBNA1-Gen, das die Replikation und Teilung des Episom während der Teilung der Wirtszelle 8 zu vermitteln. Die Episomen spontan verlor aufeinander iPSC Expansion 7. Subklonierung und Charakterisierung von iPS-Zellen mit episomalen Vektor Verlust, die aus dem Verlust von eGFP Expression geschlossen werden kann, kann vollständig Integration kostenlos IPSCs für zukünftige klinische Anwendungen führen.

Inhärente dem Verfahren iPSC Generation Unterdrückung von linienspezifischen Genen und Reaktivierung von Pluripotenz-assoziierten Genen. Regulation der Genexpression erfolgt auf mehreren Ebenen innerhalb des Ringes, einschließlich Modifikationen an DNA und Chromatin Transkriptionsfaktoren erlauben, regulatorische DNA-Elemente, und die RNA-Polymerase den Zugang zu ZielGene. Umbau des epigenetischen Landschaft über weltweite Chromatinmodifikationen ist eine Schlüsselkomponente erneut Ausdruck der Pluripotenz genetische Programm. Eine spezifische Chromatin Modifikation, bei der Regulation der Genexpression wichtig ist, ist die Acetylierung von Histonen in bestimmten Lysinreste, die den Zugriff ermöglicht, um Gene durch die verringerte Spannung der Histon-DNA Spule Ziel. HDAC-Inhibitoren sind kleine Moleküle, die gezeigt haben, um iPSC Umprogrammierung und hESC Selbsterneuerung 9,10 erweitern, die wahrscheinlich auf die Unterstützung der acetylierten Zustand 11. Die nachfolgend beschriebene Protokoll aus einer früheren Veröffentlichung mit Integration Lentiviren 12 angepasst, bietet eine Schritt-für-Schritt-Methode zur optimierten iPSC Generation aus dem peripheren Blut mit Episomen und HDAC-Inhibitoren. Die HDAC-Inhibitor-Konzentrationen werden dabei die Hälfte derjenigen von Ware et al. 9 und routinemäßig in eine 2-fache Zunahme in vollständig umprogrammiert iPSC Kolonien über Standard führtenepisomaler Umprogrammierung Protokolle ohne HDAC-Inhibitoren. Dieses Niveau der Umprogrammierung ist auf Augenhöhe mit der Effizienz beobachten wir mit lentiviralen Methoden. Mit diesem Protokoll haben wir effizient erzeugt iPSC von Einzelpersonen so alt wie 87 Jahre alt.

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Protokoll

Eine schriftliche Einverständniserklärung, wie sie durch die Institutional Review Boards des Fred Hutchinson Cancer Research Center und die Kinder "s Hospital von Philadelphia genehmigt wurde von Patienten vor dem Sammeln peripheren Blutproben erhalten. Alle institutionellen Richtlinien festgestellt. Alle Tierversuche einschließlich MEF Erzeugung und Teratom Bildung wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Ficoll Separation von PBMCs und Ausbau der Erythroblasten - Tag 0

  1. Verdünnte peripheren Blut 1: 1 mit Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS). In einem 15 ml Rundbodenpolystyrolröhrchen vorsichtig Schicht 7 ml des verdünnten Blutes auf 3 ml Raumtemperatur Ficoll-Hypaque.
  2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 g für 30 min.
  3. Die PBMCs werden in die Grenzfläche zwischen dem Plasma und dem Ficoll-Hypaque, als trübe weiße Schicht gesehen niedergelassen haben. Mit einer sterilen Transferpipette, sammeln die PBMCs in einem 15 ml konischen Röhrchen. Bringen Sie die Lautstärke auf 10 ml mit DPBS.
  4. Mit einem Hämazytometer, zähle die PBMCs.
  5. Pipette 2 × 10 6 PBMCs in einen separaten 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. Spin-down die restlichen Zellen und Einfrieren bei einer Konzentration von 2 × 10 6 PBMC / ml in 90% fötalem Rinderserum (FBS) / 10% Dimethylsulfoxid (DMSO).
  6. Bereiten Expansion Medium: QBSF-60 Serum freiem Medium (vor Licht schützen) + Penicillin / Streptomycin (1%) + Ascorbinsäure (50 ng / ml) + Stammzellfaktor (SCF, 50 ng / ml) + Interleukin 3 (IL 3, 10 ng / ml) + Erythropoietin (EPO, 2 U / ml) + Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + Dexamethason (1 uM; vor Licht schützen; auftauen einem anderen aliquoten Teil jedes Medium ändern).
  7. Resuspendieren 2 × 10 6 PBMCs in 2 ml frisch zubereitete Expansionsmedium und in eine Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte legen und inkubieren in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2.
  8. An Tag 3 und Tag 6, ersetzen Medien.
    1. Sammeln Sie die Zellen und waschen die gut mit 2 ml QBSF-60, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln.
    2. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 xg für 5 min und saugen Sie den Überstand.
    3. Die Zellen in 2 ml neue Expansionsmedium und bringt sie auf den gleichen 12-Well-Platte.

2. Reprogrammierung Zellen durch Nucleofection - Tag 9

  1. Pipettieren Sie die Umprogrammierung Plasmide in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen (Tabelle 1).
  2. Mischen Sie die Nukleofektion Lösung mit Supplement (vom Hersteller mitgeliefert) und Pipette in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
  3. Pipette 2 ml des Expansionsmediums in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte und in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC (5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2) für die Äquilibrierung vor der Zugabe von Zellen.
  4. Sammeln Sie diekultivierten Zellen und waschen Sie die gut mit 2 ml QBSF-60, um die verbleibenden Zellen zu sammeln.
  5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 xg für 5 min und saugen Sie den Überstand.
  6. Die Zellen werden durch Resuspendieren in 5 ml DPBS und Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min.
  7. Saugen Sie den Überstand.
  8. Zellpellet in 100 ul Nukleofektion Lösung + Beilage, wobei darauf zu Erzeugen von Blasen zu vermeiden.
  9. Pipettieren der Zellsuspension in die Röhre, die die Neuprogrammierung Plasmide, Pipette auf und ab sofort, und pipettieren die Probe in den unteren Bereich des Nukleofektion Küvette.
  10. Setzen Sie die Küvette in die Nukleofektion Maschine und Programm ausführen T-019.
  11. Übertragen Sie 100 ul der vorgewärmten Expansionsmedium (von der ausgleichenden Platte in Schritt 2.3) in die Nukleofektion Küvette.
  12. Sofort sammeln Sie das gesamte Probe und Einzahlung in den Brunnen der vorgewärmten Expansionsmedium. Vermeiden Sie das Sammeln der weiß, schwimm toten Zelltrümmer.
  13. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC (5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2) zu wachsen.

3. Überzug Feeder-Zellen - Tag 10 oder 11

  1. Am Tag 10, Platte Feeder-Zellen.
    1. Coat ein 6-Well-Gewebekulturplatte mit Gelatine.
      1. Pipette 1 m von 0,1% Gelatine in Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) in jede Vertiefung der Platte.
      2. Die Platte wird in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator für mindestens 5 min.
      3. Unmittelbar vor dem Gebrauch absaugen Gelatinelösung von der Platte.
    2. Auftauen einer Ampulle von 2 × 10 6 embryonalen Maus-Fibroblasten mit 3000 cGy bestrahlt, in 10 ml vorgewärmtem MEF Medien (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (10%) + Penicillin / Streptomycin (1%)).
    3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 xg für 5 min und saugen Sie den Überstand. Die Zellen in 12 ml MEF Medien und Pipette 2 ml inin jeder Vertiefung der mit Gelatine beschichtete 6-Well-Platte. Die Platte wird in einem befeuchteten 37 ° C-Inkubator (5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2), bis 12. Tag.

4. Plattierzellen auf Feeder-Zellen und ändern Medium - Tag 12

  1. Sammeln Sie die nucleofected Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen und sammeln Sie alle restlichen Zellen durch Waschen der gut mit 2 ml QBSF-60. Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 xg für 5 min.
  2. Bereiten Reprogrammierung Medium: Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) + FBS (10%) + nicht-tierischen L-Glutamin (1 mM) + nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA, 1%) + Penicillin / Streptomycin (1%) + β Mercaptoethanol (0,1 mm) + basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, fügte frisch bei Fütterung, 10 ng / ml) + Ascorbinsäure (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 50 ug / ml).
  3. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 12 ml Reprogrammierung Medium. Pipette 2 ml pro Vertiefung der Zellsuspension inder 6-Well-Platte von Feederzellen (wie in Abschnitt 3 hergestellt). Zentrifugieren Sie die Platte bei 50 g für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
  4. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC (5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2) zu wachsen. Ändern Sie die Umprogrammierung Medium jeden zweiten Tag, bis iPSC Kolonien beginnen erscheinen (1-2 Wochen).
  5. Bereiten hESC Medium: DMEM / F12 1: 1 + Knockout Serum Replacement (20%) + Penicillin / Streptomycin (1%) + NEAA (1%) + nicht-tierischen L-Glutamin (1 mM) + Natriumpyruvat (1%) + Natriumbicarbonat (0,12%) + β-Mercaptoethanol (0,1 mM) + bFGF (aufgenommen bei frischen Zufuhr, 10 ng / ml)
  6. Bereiten HDAC-Inhibitoren: Natriumbutyrat (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 100 uM), suberanilohydroxamic Säure (SAHA, fügte frisch bei Fütterung, 200 Nm). Sobald iPSC Kolonien erscheinen, beginnen Fütterung der Zellen mit hES Medium + HDAC-Inhibitoren, wechselnde Medium jeden Tag.
    HINWEIS: Sodium Butyrat ist ein kleines Molekül, das in Kunststoffröhrchen adsorbiert ist, therefore speichern sie in einer Borosilikatglas Rohr bei 4 ° C.

5. Isola iPSC Clones

  1. Sobald iPSC Kolonien groß genug sind, um isoliert werden (20-25 Zellen), holen sie mit einem P20-Pipette.
  2. Bereiten HDAC-Inhibitoren: Natriumbutyrat (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 100 uM), Sacha (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 200 nM)
  3. Legen Sie die isolierte Kolonien auf iMEFs in einzelnen 35 mm Schalen mit hESC Medium + HDAC-Inhibitoren + Cloning & Recovery Supplement.
  4. Der Tag nach der Ernte die Kolonien, ändern Sie das Medium, um hESC Medium + HDAC-Inhibitoren.
  5. Ändern Sie das Medium täglich bis iPSC Kolonien sind bereit für das Passagieren.
  6. Entfernen HDAC-Inhibitoren aus dem Medium einmal Kolonien Stabilisierung bei Passage 2-3.

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Ergebnisse

Drei Tage nach Nukleofektion und vor dem Ausplattieren der Zellen auf nucleofected iMEFs sollte die Effizienz der erfolgreichen Nukleofektion durch Fluoreszenzmikroskopie für eGFP geschätzt werden. Figur 1 zeigt einen typischen Nukleofektion Experiment mit etwa 5-10% der Gesamtzellpopulation exprimiert eGFP.

Reprogrammed iPSC Kolonien beginnen, etwa zwei Wochen nach Nukleofektion erscheinen. Die Kolonien sind in der Regel kreisförmig mit gut definierten Grenzen und können du...

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Diskussion

Für eine erfolgreiche iPSC Generation, wenn Sie dieses Protokoll, gibt es mehrere wichtige Einschränkungen, die berücksichtigt werden sollten. Während der Erythroblasten Ausbaustufe sollte die Medienwechsel Zeitplan strikt eingehalten werden, da Abweichungen können zu einer ineffizienten Stimulation des Zielvorläuferzellpopulation und einer niedrigeren Effizienz iPSC Generation führen. Es ist wichtig, neue Expansionsmedium mit frischem Dexamethason mit jedem Medienwechsel zu machen; und die QBSF-60 Basismedium und Dexam...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Die Autoren möchten die folgenden Zuschüsse aus dem NIH für die Unterstützung dieser Forschung zu bestätigen: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS) und K12HL0806406 (SKS); und die JP McCarthy Foundation (AR).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ficoll-Paque PLUSFisher Scientific45-001-750Bei 4 °C lagern. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.
DPBSLife Technologies14190-250Store at 4 °C.
RPMI 1640Life Technologies11875-093Lagern bei 4 >C.
fötales Rinderserum (FBS)Life Technologies10437028Lagern bei -20 & Grad; C bis zur Nötigung. Auftauen, aliquotieren, bei 4 °C lagern.
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-Aldrich154938Bei Raumtemperatur lagern.
QBSF-60 serumfreies MediumFisher Scientific50-983-234Bei 4 & Grad C lagern.
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15140122Lagern bei 4 & Grad.
Cell Line Nucleofector Kit VLonzaVCA-1003Bei 4 & Grad C lagern.
2%ige GelatinelösungSigma-AldrichG1393Bei 4 Grad lagern; C, verflüssigen in 37 & Grad; C Wasserbad vor Gebrauch.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)Life Technologies14175-103Lagern bei 4 & Grad.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies11965-092Store bei 4 >C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Life Technologies12440-061Lagern bei 4 & Grad.
L-Glutamin, 200 mMLife Technologies25030-081Aliquot, einfrieren bei -20 °C.
nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 100XLife Technologies11140-050Bei 4 > C, weg von Licht.
DMEM/Ham's F12, 1:1Fisher ScientificSH30023.02Lagern bei 4 & Grad.
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828-028Aliquot, einfrieren bei -20 °C.
Natriumpyruvat, 100 mMLife Technologies11360-070Bei 4 & °C lagern.
Natriumbicarbonat, 7,5 %Life Technologies25080094Bei 4 °C lagern.
basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)Life TechnologiesPHG026310 mg/ml Brühe in DPBS herstellen, aliquotieren, bei -20 °C einfrieren. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
Natriumbutyrat Sigma-AldrichB5887-1GHerstellung 2000x Rohmaterial (400 mM) in DPBS, aliquot, einfrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
hES-Zellklonierung & RegenerationsergänzungsmittelStemgent01-0014-500Bei -20 > lagern; C bis zur Nötigung. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
ESC-qualifiziertes BD-MatrigelBD Biosciences35-4277Tauwetter über Nacht auf Eis bei 4 Grad; C, aliquotiert in vorgekühlte Röhrchen mit vorgekühlten Pipettenspitzen. Bei -20 Grad lagern; C bis zur Nötigung. Tauwetter bei 4 Grad; C, sofort verwenden.
StemSpan SFEM STEMCELL Technologies9650Aliquot, einfrieren bei -20 °C.
Ascorbinsäure, pulverisiertSigma-AldrichA4403-100MG5 mg/ml Vorrat in DPBS, Sterilfilter, bei 4 μC lagern.
rekombinanter humaner Stammzellfaktor (SCF)R & D Systems255-SC-010Fabrikat 100 μ g/m-Lagerbestand in SFEM, aliquot, eingefroren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
rekombinantes humanes Interleukin 3 (IL-3)R & D Systems203-IL-010Fabrikat 100 μ g/ml Bestand in SFEM, aliquot, einfrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
Erythropoietin (EPO)R & D Systems287-TC-500Herstellung von 1000 U/ml Rohmaterial in SFEM, aliquot, einfrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
rekombinanter humaner insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1 (IGF-1)R & D Systems291-G1-200Fabrikat 100 μ g/ml Bestand in SFEM, aliquot, einfrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
β-mercaptoethanolSigma-AldrichM75221000x (100 mM) in DPBS herstellen.
DexamethasonSigma-AldrichD4902-25MGFabrikat 50x Lagerbestand (50 μ M) in DPBS, Sterilfilter, bei 4 °C lagern.
SAHA (Vorinostat)Cayman Chemical149647-78-9Herstellung von 2.000x Rohmaterial (400 mM) in DPBS, aliquot, Gefrieren bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C lagern.
12-Well-GewebekulturplatteFisher Scientific08-772-29
15 ml konisches RöhrchenSarstedt62553002
1,5 ml Eppendorf-RöhrchenFisher Scientific05-408-129
6-Well-GewebekulturplatteFisher Scientific08-772-1B
35 mm Tisue-KulturplattenBD Biosciences353001
10 ml serologische EinwegpipettenFisher Scientific13-675-20
5 ml serologische EinwegpipettenFisher Scientific13-675-22
2 ml serologische EinwegpipettenFisher Scientific13-675-17
20 μ l Pipettenspitzen, BarrierespitzenGenessee24-404
Glas PasteurpipettenFisher Scientific13-678-20D
PipettenhilfeFisher Scientific13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-FAddgene27077
pCXLE-hSKAddgene27078
pCXLE-hULAddgene27080
pCXLE-EGFPAddgen27082
pCXWB-EBNA1Addgen37624

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Episomale Plasmideperiphere mononukleäre BlutzellenErythrozyten-VorläuferzellenNukleofektionembryonale Maus-Fibroblastenintegrationsfreie iPSCsReprogrammiermediumFluoreszenzmikroskopie
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