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Der Proteinabbau durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein wichtiger Regulationsmechanismus für Proteinhomöostase in allen Eukaryonten. Die Standardmethode zur Bestimmung der intrazellulären Proteinabbaus beruht auf biochemischen Assays für folgende die Kinetik der Proteinniedergang. Solche Verfahren sind oft umständlich und zeitaufwendig und daher nicht zugänglich sind Versuche zur Beurteilung mehrere Substrate und Abbaubedingungen ab. Als Alternative wurden Zellwachstum basierenden Assays entwickelt worden, die sich in ihrer herkömmlichen Format Endpunktassays, die nicht quantitativ relativen Veränderungen in der Proteinspiegel zu bestimmen können.
Hier beschreiben wir eine Methode, die originalgetreu bestimmt Veränderungen in der Proteinabbauraten durch Kopplung an Hefezelle-Wachstumskinetik. Das Verfahren basiert auf einem System, in dem festgelegten Auswahl Uracil-Auxotrophie des URA3 -deleted Hefezellen durch eine exogen exprimierten Reporterproteins gerettet basierend, Einer Fusion zwischen dem wesentlichen URA3-Gen und einem Abbau Determinante (Degron) besteht. Das Reporterprotein ist so ausgelegt, dass ihre Syntheserate konstant ist, während seine Abbaurate wird durch die Degron bestimmt. Zellwachstum in Uracil-defizientem Medium proportional zu der relativen Pegel Ura3 sind Wachstumskinetik völlig abhängig von der Reporter-Protein-Abbau.
Diese Methode misst genau Veränderungen der intrazellulären Proteinabbau Kinetik. (A) Die Beurteilung der relative Beitrag der bekannten Ubiquitinkonjugierenden Faktoren Proteolyse (b) E2 konjugierende Enzym Struktur-Funktions-Analysen (c) Identifizierung und Charakterisierung von neuen degrons: Es wurde angewandt. Anwendung des degron- URA3 -basierten System überwindet die Abbaufeld Protein, wie es auch zur Überwachung von Veränderungen der Proteinspiegel mit Funktionen der anderen zellulären Wege angepasst zu werden.