Methodenartikel

Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau

DOI:

10.3791/52021

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6. November 2014

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1Department of Biological Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir einen robusten biologischen Assay zur Quantifizierung der relativen Rate der Proteolyse durch das Ubiquitin-Proteasom-System. Die Assay-Auslesung ist die Hefewachstumsrate in Flüssigkulturen, die von den zellulären Konzentrationen eines Reporterproteins abhängt, das ein Abbausignal enthält, das mit einem essentiellen Stoffwechselmarker fusioniert ist.

Zusammenfassung

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Der Proteinabbau durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein wichtiger Regulationsmechanismus für Proteinhomöostase in allen Eukaryonten. Die Standardmethode zur Bestimmung der intrazellulären Proteinabbaus beruht auf biochemischen Assays für folgende die Kinetik der Proteinniedergang. Solche Verfahren sind oft umständlich und zeitaufwendig und daher nicht zugänglich sind Versuche zur Beurteilung mehrere Substrate und Abbaubedingungen ab. Als Alternative wurden Zellwachstum basierenden Assays entwickelt worden, die sich in ihrer herkömmlichen Format Endpunktassays, die nicht quantitativ relativen Veränderungen in der Proteinspiegel zu bestimmen können.

Hier beschreiben wir eine Methode, die originalgetreu bestimmt Veränderungen in der Proteinabbauraten durch Kopplung an Hefezelle-Wachstumskinetik. Das Verfahren basiert auf einem System, in dem festgelegten Auswahl Uracil-Auxotrophie des URA3 -deleted Hefezellen durch eine exogen exprimierten Reporterproteins gerettet basierend, Einer Fusion zwischen dem wesentlichen URA3-Gen und einem Abbau Determinante (Degron) besteht. Das Reporterprotein ist so ausgelegt, dass ihre Syntheserate konstant ist, während seine Abbaurate wird durch die Degron bestimmt. Zellwachstum in Uracil-defizientem Medium proportional zu der relativen Pegel Ura3 sind Wachstumskinetik völlig abhängig von der Reporter-Protein-Abbau.

Diese Methode misst genau Veränderungen der intrazellulären Proteinabbau Kinetik. (A) Die Beurteilung der relative Beitrag der bekannten Ubiquitinkonjugierenden Faktoren Proteolyse (b) E2 konjugierende Enzym Struktur-Funktions-Analysen (c) Identifizierung und Charakterisierung von neuen degrons: Es wurde angewandt. Anwendung des degron- URA3 -basierten System überwindet die Abbaufeld Protein, wie es auch zur Überwachung von Veränderungen der Proteinspiegel mit Funktionen der anderen zellulären Wege angepasst zu werden.

Einleitung

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Das Ubiquitin-Proteasom-Abbausystem ist ein Hauptregulierungs Maschine, die bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Protein in Eukaryoten beteiligt ist. Der UPS-Konjugate zunächst mehrere Ubiquitin-Moleküle an ein Zielprotein nach der die Poly-Ubiquitin-markierten Protein durch das 26S Proteasom abgebaut. In den meisten Fällen ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Ubiquitin-vermittelten Abbau Substrat Ubiquitinierung von E2 konjugierenden Enzyme und Liga E3-Enzymen (E3 Ligasen) 1. Folglich intrazelluläre Stabilität spezifischer Proteine ​​spiegelt ihre Anfälligkeit für Ubiquitin-Konjugation und die Aktivität ihres zugehörigen Ubiquitinierung....

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Protokoll

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1. Zellkultur

  1. Transformation der geeigneten auxotrophen Hefe-Zellen, wie Try467 (Tabelle 2), die mit einem Plasmid, enthaltend (a) ein URA3 -degron Fusion und (b) einer zusätzlichen Stoffwechselmarker für Plasmidselektion und Wartung.
    HINWEIS: Ein Beispiel für ein geeignetes Plasmid ist YDpK-MET25p-deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Dies ist eine Hefe integrative Plasmid ein Fusionsprotein bestehend aus deg1 enthält - eine Degron aus der Hefe-Transkriptions abgeleitet. Faktor Mat2 17, FLAG-Epitop - zur Detektion durch Immunoblotting Vma12 - einem stabilen ER-Protein und Ura3 15....

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Ergebnisse

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Untersuchung der Rolle der Enzyme der Doa10 Weg zum Abbau eines Reportersubstrat

Um die Gültigkeit der GIL Verfahren wurde mit einem herkömmlichen Assay Abbau verglichen zu testen. Dieses Experiment beurteilt die relativen Beitrag der Komponenten der ER-Membran lokalisiert Doa10 E3-Ligase-Komplex 20,21 zum Abbau des Proteins Qualitätskontrolle Reportersubstrat Deg1- VU (3A). Die Deg1- VU Plasmid wurde in Wildtyp-Zellen o.......

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Diskussion

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Hier beschreiben wir einen Test auf Basis von Zellwachstum zur Bestimmung der relativen Proteinabbauraten, genannt 'Wachstumskinetik in Flüssigkultur unter selektiven Bedingungen "(GIL). Die Gils Assay hat mehrere Vorteile: Es ist einfach einzurichten, Datenerfassung und Analyse ist einfach und es ist extrem modular ist. Folglich GILS können gleichzeitig mehrere Proben in einer benutzerfreundlichen Multi-Well-Plattenformat, die angepasst werden können, um für Anwendungen mit hohem Durchsatz Automatisierung verw.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Yuval Reiss und Dr. William Breuer für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Omri Alfassy für die Unterstützung bei der Entwicklung des Ura3-GFP-Screen-Assays. Wir danken auch Dr. M. Hochstrasser und Dr. R. Kulka für die Plasmide und Stämme. Diese Arbeit wurde von der Israelischen Akademie der Wissenschaften (Stipendium 786/08) und von der United States-Israel Binational Scientific Foundation (Stipendium 2011253) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Difco Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren und AmmoniumsulfatBD Biosciences233520Für das Hefewachstum auf SD-Minimalmedien. Zu liefernde Aminosäuren sind: Arginin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan
AmmoniumsulfatSigma - AldrichA4418
GlukoseSigma - Aldrich16325
AdeninSigma - AldrichA8626
UracilSigma - AldrichU0750
AminosäurenHöchste Reinheit verfügbar 
96-Well-PlattenNunc167008Jede andere kompatible Marke kann verwendet werden
Cyclohexamid Sigma - AldrichC7698Arbeitskonzentration 0,5 mg/ml
Infinite 200 PRO SerieTecanFür Hefeinkubation und OD600 Messungen. Jedes andere kompatible tempgesteuerte Lesegerät kann verwendet werden.
MDTcalcExperimentelle Software

Referenzen

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  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  2. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).....

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Schlagwörter

HefewachstumsassayURA3 ReportersystemDegron FusionMikroplattenleseger tWachstumskinetikminimale VerdopplungszeitUbiquitin ProteasomE2 konjugierende EnzymeIdentifizierung neuartiger Degrons

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