Methodenartikel

Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau

DOI:

10.3791/52021

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6. November 2014

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1Department of Biological Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir einen robusten biologischen Assay zur Quantifizierung der relativen Rate der Proteolyse durch das Ubiquitin-Proteasom-System. Die Assay-Auslesung ist die Hefewachstumsrate in Flüssigkulturen, die von den zellulären Konzentrationen eines Reporterproteins abhängt, das ein Abbausignal enthält, das mit einem essentiellen Stoffwechselmarker fusioniert ist.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Proteinabbau durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein wichtiger Regulationsmechanismus für Proteinhomöostase in allen Eukaryonten. Die Standardmethode zur Bestimmung der intrazellulären Proteinabbaus beruht auf biochemischen Assays für folgende die Kinetik der Proteinniedergang. Solche Verfahren sind oft umständlich und zeitaufwendig und daher nicht zugänglich sind Versuche zur Beurteilung mehrere Substrate und Abbaubedingungen ab. Als Alternative wurden Zellwachstum basierenden Assays entwickelt worden, die sich in ihrer herkömmlichen Format Endpunktassays, die nicht quantitativ relativen Veränderungen in der Proteinspiegel zu bestimmen können.

Hier beschreiben wir eine Methode, die originalgetreu bestimmt Veränderungen in der Proteinabbauraten durch Kopplung an Hefezelle-Wachstumskinetik. Das Verfahren basiert auf einem System, in dem festgelegten Auswahl Uracil-Auxotrophie des URA3 -deleted Hefezellen durch eine exogen exprimierten Reporterproteins gerettet basierend, Einer Fusion zwischen dem wesentlichen URA3-Gen und einem Abbau Determinante (Degron) besteht. Das Reporterprotein ist so ausgelegt, dass ihre Syntheserate konstant ist, während seine Abbaurate wird durch die Degron bestimmt. Zellwachstum in Uracil-defizientem Medium proportional zu der relativen Pegel Ura3 sind Wachstumskinetik völlig abhängig von der Reporter-Protein-Abbau.

Diese Methode misst genau Veränderungen der intrazellulären Proteinabbau Kinetik. (A) Die Beurteilung der relative Beitrag der bekannten Ubiquitinkonjugierenden Faktoren Proteolyse (b) E2 konjugierende Enzym Struktur-Funktions-Analysen (c) Identifizierung und Charakterisierung von neuen degrons: Es wurde angewandt. Anwendung des degron- URA3 -basierten System überwindet die Abbaufeld Protein, wie es auch zur Überwachung von Veränderungen der Proteinspiegel mit Funktionen der anderen zellulären Wege angepasst zu werden.

Einleitung

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Das Ubiquitin-Proteasom-Abbausystem ist ein Hauptregulierungs Maschine, die bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Protein in Eukaryoten beteiligt ist. Der UPS-Konjugate zunächst mehrere Ubiquitin-Moleküle an ein Zielprotein nach der die Poly-Ubiquitin-markierten Protein durch das 26S Proteasom abgebaut. In den meisten Fällen ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Ubiquitin-vermittelten Abbau Substrat Ubiquitinierung von E2 konjugierenden Enzyme und Liga E3-Enzymen (E3 Ligasen) 1. Folglich intrazelluläre Stabilität spezifischer Proteine ​​spiegelt ihre Anfälligkeit für Ubiquitin-Konjugation und die Aktivität ihres zugehörigen Ubiquitinierung Enzyme.

E3-Ligasen sind die Hauptsubstraterkennung Komponenten des UPS. Als solche sind diese Enzyme erkennen degrons innerhalb ihrer Substrate, die entweder nicht vorhanden oder nicht in ihrer stabilen Gegen 2 ausgesetzt sind. Zum Beispiel sind viele Regulatoren des Zellzyklus must synthetisiert und in einer zeitlich bestimmten Weise, um die Zellzyklusprogression in Ordnung zu halten abgebaut werden. Der Abbau dieser Proteine ​​wird häufig durch Phosphorylierung gesteuert durch zelluläre Signale regulierte Kinasen 3,4 vermittelt. Auf der anderen Seite, sind aberrant-gefaltete Proteine ​​durch kryptische degrons anerkannt. Dies sind Bereiche, die normalerweise in der nativen Struktur verborgen sind und werden beim Aufbau Störung ausgesetzt. Solche degrons gehören hydrophoben Domänen 5-7 und intrinsisch ungeordneten Segmente 8.

Da der Samen Entdeckung des Ubiquitin-Proteinabbau und Charakterisierung der Grundlagen in Retikulozyten-Lysaten 9 war Hefegenetik an der Entdeckung von vielen der Komponenten des Ubiquitin-Systems 10. Der Erfolg von Hefe als Modellorganismus für die systematische Analyse von Proteinabbau durch die USV ist vor allem aufgrund der Tatsache, dass die USV ist hochly konserviert in allen Eukaryoten 4, verbunden mit ihrer Zugänglichkeit als Versuchssystem. Tatsächlich werden auf Hefe basierenden Systemen üblicherweise verwendet, um die Wirkmechanismen der Ubiquitinierung Maschinen entziffern.

Studieren Proteinabbau durch biochemische Mittel erfordert in der Regel Herstellung von Zellextrakten. Während tierische Zellproteinen kann unter relativ milden Bedingungen, die Proteinwechselwirkungen und Funktion zu erhalten extrahiert werden, das Vorhandensein eines robusten Zellwand der Hefe 11 benötigt deutlich härteren Bedingungen, die Störung der Proteingewinnung beeinflussen können. Tatsächlich unterschiedliche Verfahren für Hefe Zellaufschluss variieren erheblich in ihrer Fähigkeit, intakte Proteine ​​in Mengen, die ihre relative Zellüberfluss korrekt darstellen zu erholen. Weitere Ungenauigkeit ist inhärent in den verschiedenen zur Bestimmung Abbauraten von spezifischen Proteinen angewandten Methoden: Metabolische Markierung basierten 'Pulse-Chase-Experimente, gefolgt von immunoprecipitation, um spezifische Proteine ​​12 zu isolieren, ist häufig nicht streng quantitativ. Somit wird, wenn Proteinabbau wird durch dieses Verfahren im Vergleich, extra Vorsicht bei der Interpretation der Ergebnisse geboten. Um diesen Nachteil zu umgehen, kann eine alternative Cycloheximid (CHX) chase Assay verwendet werden 12. In diesem Assay wird die Übersetzung Inhibitor-Zellkulturen und zeitlichen Veränderungen der Protein stationären Ebenen hinzugefügt werden anschließend überwacht. Dennoch ist die Verwendung von CHX Proteine ​​mit relativ kurzen Halbwertszeiten (<90 min), als langfristige Hemmung der Proteinsynthese ist zytotoxisch beschränkt. Bemerkenswert ist, beide der oben genannten Tests erfordern die Verwendung von Protein-spezifischen Antikörpern, die nicht immer verfügbar sind.

Um diese technischen Einschränkungen zu überwinden, haben die Forscher mehrere Ansätze, die nicht Zellextraktion und direkte Protein Handhabung erfordern entwickelt. Ein Ansatz basiert auf der Einrichtung von auxotrophen yea basiertst Stämme, durch die Deletion von Genen wesentlichen metabolischen Enzyme codieren, erhalten werden. Solche Gene umfassen HIS3, LEU2, LYS2 und TRP1, kodierend für Enzyme, die für die Aminosäure-Biosynthese erforderlich ist, als auch URA3, die OMP-Decarboxylase codiert (Ura3), ein essentielles Enzym der Pyrimidin-Biosynthese Ribonukleotid. Ura3 wurde vielfach in der Proteinabbaustudien eingesetzt. In diesen Assays rettet konstitutive Expression Ura3 Wachstum von Zellen in ura3 Uracil-Mangelmedium 13. Folglich Destabilisierung Ura3 durch die Fusion einer Degron kann das Zellwachstum auf Minimalmedium ohne Uracil verringern. Diese Methode wurde in verschiedenen Proteinabbaustudien eingesetzt, einschließlich der Festlegung von Abbaufaktoren 5, E3 Ligasen 14 und Hilfs Ubiquitinierung Faktoren 15 und die Entdeckung von neuen USV degrons 16. Alle diese Verfahren verwendet das Zellwachstum auf Agarplatten als Testanzeige. Jedoch ter Wachstumskriterium (positive / negative Wachstum), während robuste und effiziente, ist meist qualitative und nicht quantitative Informationen, die wichtig für die Bewertung Potenz eines Degron oder den relativen Beitrag der verschiedenen Hilfsabbaufaktoren ist.

Wir haben daher entwickelt und verwendet Hefevektoren und Screeningverfahren zur systematischen und quantitativen Analyse der Proteinabbau durch das URA3 -degron Fusionssystem. Das Protokoll basiert auf einer einfach zu handhabenden Test, der Wachstumskinetik misst in Flüssigkultur unter selektiven Bedingungen (GIL) und auf der Erzeugung von Standardwachstumskurven. Lag die exponentielle (log) und der stationären Phase - Hefe Wachstumskinetik werden durch drei Hauptphasen gekennzeichnet. Berechnung der Hefe-Replikations Kinetik während der log-Phase unter selektiven Bedingungen, die durch die Höhe der Expression des URA3-Degron bestimmt wird, liefert eine objektive quantitative Messung of Proteinabbau. Dieses Verfahren kann zum Messen und Vergleichen Abbauraten von mehreren UPS Substrate gleichzeitig in mehrere Stämme und unter verschiedenen Bedingungen verwendet werden.

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Protokoll

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1. Zellkultur

  1. Transformation der geeigneten auxotrophen Hefe-Zellen, wie Try467 (Tabelle 2), die mit einem Plasmid, enthaltend (a) ein URA3 -degron Fusion und (b) einer zusätzlichen Stoffwechselmarker für Plasmidselektion und Wartung.
    HINWEIS: Ein Beispiel für ein geeignetes Plasmid ist YDpK-MET25p-deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Dies ist eine Hefe integrative Plasmid ein Fusionsprotein bestehend aus deg1 enthält - eine Degron aus der Hefe-Transkriptions abgeleitet. Faktor Mat2 17, FLAG-Epitop - zur Detektion durch Immunoblotting Vma12 - einem stabilen ER-Protein und Ura3 15,18 (Abbildung 3A). (Siehe Tabelle 3 für die Plasmide in dieser Studie und zusätzliche Beispiele für geeignete Plasmide verwendet.)
  2. Für Plasmid Auswahl und Wartung, halten Zellen in Agar-Platten unter einem geeigneten Kunst Defined (SD) Medium ohne Aminosäure Selektionsmarker 19 (beispielsweise deg1 -UV ausgewählt und unter SD-LYS selektiven Medium gehalten).
  3. Wachsen Zellen O / N bei 30 ° C in einem geeigneten selektiven Medium für SD Plasmids, bis eine stationäre Phase erreicht ist. Wachsen die Zellen in Teströhrchen oder in einer Platte mit 96 Vertiefungen, abhängig von der Anzahl von Proben (Abschnitt 2) untersucht werden.

2. Zellpräparation für Analysis

  1. Wenn eine kleine Anzahl von Proben (N≤15) werden untersucht werden, verdünnt, die Zellen und Ersetzen des Mediums wie folgt:
    1. Verdünnte 50 ul Zellen aus einem O / N-Kultur mit 150 & mgr; l SD-Medium pro Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen (clear bottom). Beachten, die erste Probe bezeichnet als Leer enthält nur Medium.
    2. Bestimmen Sie die OD 600 Werte der Proben in der 96-Well-Platte mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader.
    3. Berechnung des tatsächlichen OD 600 in jeder Vertiefung durch Multiplizieren der OD 600 Lesen durch den Verdünnungsfaktor (x4), von whICH den Wert der Blindwert subtrahiert. Normalisierung der resultierenden Werte durch Dividieren durch 0,55, um eine berechnete Pfadlänge von 1 cm nach dem Beer-Lambert Gesetz erhalten. Hinweis, dieser Wert konstant ist, wenn die Messung der OD 600 von 200 ul der Zellen in einem Standard-96-Well-Platte.
    4. Berechnet das genaue Volumen zum Erhalten Hefezellen bei äquivalenten Menge bis zu einer OD 600 von 0,25 und sie auf ein Eppendorf-Röhrchen benötigt.
    5. Spin-down der Zellen bei hoher Geschwindigkeit (12.000 xg) für 1 min.
    6. Entfernen Sie den Überstand und die Zellen resuspendieren in 1 ml des entsprechenden Selektionsmedium (siehe Abschnitt 3.1), um OD erhalten 600 von 0,25.
    7. Transfer 200 ul der verdünnten Stämme zu einer neuen Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen.
  2. Wenn eine große Anzahl von Proben (N> 15) getestet werden soll, verdünnt, die Zellen und das Medium ohne vorherige OD 600 Messung ersetzt, wie folgt:
    1. Transfer 10 ul stationären Zellengrown O / N in einer 96-Well-Platte in eine neue 96-Well-Platte mit 190 ul (Verdünnung 1:20) der geeigneten selektiven Medien (siehe Abschnitt 3.1).

3. Wachstum Kinetics in Flüssigkultur unter selektiven Bedingungen (GIL)

  1. Verwenden Sie die folgenden Medien für Wachstum Messungen mit dem Ura3-Degron Reporter:
    1. Für positive Kontrollen von Hefe Wachstum unter Nicht restriktiven Bedingungen, die Verwendung Plasmid selektive SD-Medien (siehe Abschnitt 1.2). Wenn keine Plasmid-Selektion erforderlich ist, beispielsweise bei Verwendung eines integrativen Plasmid wie deg1 -UV, SD-Medium, das alle erforderlichen Aminosäuren (SD vollständig) können verwendet werden.
    2. Für experimentelle Proben Mess Wachstum unter restriktiven Bedingungen, verwenden Sie SD-URA Medium.
  2. Stellen Sie einen Multimode-Mikroplatten-Reader zu:. Einer Inkubationstemperatur von 30 ° C, OD 600 Messintervallen von 15 min und einer Orbital und lineare Schütteln Zyklen von 1 min alle sieben min
    Hinweis: Diese Dual-Mode-Schütteln wurde optimiert, um eine homogene Verteilung der Zellen zu erhalten; jedoch können auch andere Modi Schütteln oder sogar kein Schütteln so gut funktionieren.
  3. Inkubieren der Zellen bei 30 ° C in einem Mikroplattenleser O / N oder bis die Zellen die stationäre Phase (12-24 h) erreicht.
  4. Exportieren Sie die Rohdaten in ein Tabellenkalkulationsdatei.
  5. Bestimmen Sie das Wachstum der Hefe Kinetik mit MDTcalc, eine maßgeschneiderte Software, die die minimale Zeit berechnet (in h) für Zellen, ihre Populationsgröße verdoppeln (Minimal Verdopplungszeit (MDT); für Details siehe Abschnitt 4).

4. Berechnung des Minimal-Verdopplungszeit (MDT): Grundsätze der MDTcalc Algorithm

HINWEIS: Grundsätze der MDTcalc Algorithmus unter Verwendung einer repräsentativen Auswahl von Try467 Hefezellen (Tabelle 2) in SD-Medium gezüchtet abgeschlossen, sind in Tabelle 1 und Figur 1 dargestellt, die eine Datentabellenkalkulation und Wachstumsgrund, respectiv.

  1. Subtrahieren OD 600 Blindwerte in die entsprechende Wanne erhalten wird, von jeder der in der Probenwerte erhalten. Teilen die resultierenden Differenzen von 0,55 (für 96-Well-Platten), um die Lichtpfadlänge zu korrigieren. Zeichnen Sie die endgültigen Werte (Tabelle 1, Trans.) Gegen die Zeit, um die tatsächliche Hefe Wachstumskurve (OD 600 / h) (1A) zu produzieren.
  2. Log 2 (OD 600) für jeden der transformierten Werten zu berechnen, um die logarithmische Wachstumsphase in eine lineare Kurve (1B) zu konvertieren.
  3. Berechnen der Steigung einer 10 Zeitpunkte Intervall (N = 10), beginnend bei der Zeit 0 und Bewegen von einem Zeitpunkt, zu einer Zeit, bis N <10 (Tabelle 1, Slope; 1C).
  4. Berechnung der inversen Wert jeder Steigung, die Zeit für die Zellpopulation erforderlich ist, um doppelt zu erhalten (Tabelle 1, 1 / Steigung; 1C). Berechnen Sie die minimale1 / Slope-Wert, um die MDT (; 1C Tabelle 1, schwarzes Rechteck) zu bestimmen. Entpacken Sie die berechnete MDT für Zellen in der Probe (Tabelle 1, 1 / Slope, schwarzes Rechteck) aus dem gewählten Zeitintervall (Tabelle 1, durch rotes Rechteck skizziert, 1B, 1D).
    HINWEIS: Die Geschwindigkeit des Zellwachstums auf SD-URA Medium ist umgekehrt proportional zu der MDT.

5. Mit MDTcalc

  1. Kopieren Sie die Programmdateien ergänzt in einem bestimmten Ordner auf dem Computer.
  2. Stellen Sie sicher, das Tabellenkalkulationsdatei, die die Wachstumsdaten gespeichert und geschlossen. Öffnen Sie die MDTcalc Anwendungsprogramm, um den Startbildschirm erscheint sehen.
    1. Legen Sie die erforderlichen Informationen, wie in Abbildung 2 gezeigt:
      1. Unter "Dateipfad", klicken Sie auf das Rechteck über das Recht auf die Kalkulationstabelle Datei zu suchen.
      2. Unter "Blattname", schreiben die Tabelle Namen, wo ter Rohdaten befindet.
      3. Unter 'Startposition', legen Sie die Tabellenkalkulation Koordinate Zeitpunkt 0 der ersten Probe.
      4. Unter 'Time Spalte ", legen Sie die Buchstaben die Festlegung des Orts der Zeitpunkt Spalte (Zeit sollte in Sekunden zur Verfügung gestellt werden).
      5. Unter 'Blank Spalte ", legen Sie die Buchstaben definieren die Position der leeren Spalte (in der Regel, aber nicht notwendigerweise in A1 der 96-Well-Platte).
      6. Unter 'OD-Wert ", wählen Sie den minimalen transformiert OD 600-Wert für die Einleitung der MDT Berechnung (in der Regel 0,15-0,25) erforderlich. Wird dieser Wert verhindert Berechnungen der MDT für Kulturen in Lag-Phase wegen zu hoher Verdünnung, so dass MDT ist nur für Proben, die den definierten OD 600-Wert oder höher zu erreichen, berechnet.
    2. Sobald der letzte Wert eingegeben wurde, drücken Sie die "berechnen" -Button am unteren Rand des Bildschirms. Stellen Sie sicher, dass der Fortschrittsbalken auf der rechten Seite allmählich in gReen. Die Kalkulationstabellendatei während des Rechenprozesses nicht öffnen.
    3. Exportieren der zwei Sätze von Daten, die automatisch auf dem Bildschirm bei der Beendigung der Berechnung MDT in ein Arbeitsblatt angezeigt. Stellen Sie sicher, dass die Daten enthält: Start (a) die MDT-Wert für jeden gut, dass die minimale OD-Wert-Test (wie in Abschnitt 5.2.1.6 festgelegt) und (b) den Anfangszeitpunkt des Intervalls aus dem die MDT berechnet gibt ( Zeit).

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Ergebnisse

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Untersuchung der Rolle der Enzyme der Doa10 Weg zum Abbau eines Reportersubstrat

Um die Gültigkeit der GIL Verfahren wurde mit einem herkömmlichen Assay Abbau verglichen zu testen. Dieses Experiment beurteilt die relativen Beitrag der Komponenten der ER-Membran lokalisiert Doa10 E3-Ligase-Komplex 20,21 zum Abbau des Proteins Qualitätskontrolle Reportersubstrat Deg1- VU (3A). Die Deg1- VU Plasmid wurde in Wildtyp-Zellen o...

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Diskussion

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Hier beschreiben wir einen Test auf Basis von Zellwachstum zur Bestimmung der relativen Proteinabbauraten, genannt 'Wachstumskinetik in Flüssigkultur unter selektiven Bedingungen "(GIL). Die Gils Assay hat mehrere Vorteile: Es ist einfach einzurichten, Datenerfassung und Analyse ist einfach und es ist extrem modular ist. Folglich GILS können gleichzeitig mehrere Proben in einer benutzerfreundlichen Multi-Well-Plattenformat, die angepasst werden können, um für Anwendungen mit hohem Durchsatz Automatisierung verw...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Yuval Reiss und Dr. William Breuer für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Omri Alfassy für die Unterstützung bei der Entwicklung des Ura3-GFP-Screen-Assays. Wir danken auch Dr. M. Hochstrasser und Dr. R. Kulka für die Plasmide und Stämme. Diese Arbeit wurde von der Israelischen Akademie der Wissenschaften (Stipendium 786/08) und von der United States-Israel Binational Scientific Foundation (Stipendium 2011253) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Difco Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren und AmmoniumsulfatBD Biosciences233520Für das Hefewachstum auf SD-Minimalmedien. Zu liefernde Aminosäuren sind: Arginin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan
AmmoniumsulfatSigma - AldrichA4418
GlukoseSigma - Aldrich16325
AdeninSigma - AldrichA8626
UracilSigma - AldrichU0750
AminosäurenHöchste Reinheit verfügbar 
96-Well-PlattenNunc167008Jede andere kompatible Marke kann verwendet werden
Cyclohexamid Sigma - AldrichC7698Arbeitskonzentration 0,5 mg/ml
Infinite 200 PRO SerieTecanFür Hefeinkubation und OD600 Messungen. Jedes andere kompatible tempgesteuerte Lesegerät kann verwendet werden.
MDTcalcExperimentelle Software

Referenzen

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HefewachstumsassayURA3 ReportersystemDegron FusionMikroplattenreaderWachstumskinetikminimale VerdopplungszeitUbiquitin ProteasomE2 konjugierende EnzymeIdentifizierung neuartiger Degrons

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