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Methodenartikel

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

8.3K Aufrufe

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DOI:

10.3791/52022

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20. Oktober 2014

 ,  ,  , 
1Harper Cancer Research Institute, 2Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 3Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Manipulation der temporalen Genexpression in differenzierenden embryonalen Stammzellen (ESCs) kann mit induzierbaren Gensystemen erreicht werden. Die Erzeugung dieser Zelllinien ist jedoch kostspielig und zeitaufwändig. Dieses Protokoll erreicht eine schnelle Expression eines Transgens bei der Differenzierung von ES-abgeleiteten Zellen und die anschließende Analyse der nachgeschalteten hämatopoetischen Differenzierung.

Zusammenfassung

Embryonale Stammzellen (ESCs) sind ein hervorragendes Modell zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der zellulären Differenzierung. Sie sind besonders nützlich, um die Entwicklung von frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPCs) zu untersuchen. Die Genexpression in ESCs kann durch verschiedene Techniken manipuliert werden, die es ermöglichen, die Rolle einzelner Moleküle in der Entwicklung zu bestimmen. Eine Schwierigkeit besteht darin, dass die Expression bestimmter Gene oft unterschiedliche phänotypische Effekte hat, die von ihrer zeitlichen Expression abhängen. Dieses Problem kann durch die Erzeugung von ESCs umgangen werden, die ein Gen von Interesse induzierbar exprimieren, indem Technologien wie das Doxycyclin-induzierbare Transgensystem verwendet werden. Die Erzeugung dieser induzierbaren Zelllinien ist jedoch kostspielig und zeitaufwändig. Hier wird ein Verfahren beschrieben, um ESC-abgeleitete Embryoidkörper (EBs) in Einzelzellsuspensionen zu zerlegen, die Zellsuspensionen retroviral zu infizieren und dann die EBs durch hängenden Tropfen neu zu reformieren. Die Downstream-Differenzierung wird dann mittels Durchflusszytometrie ausgewertet. Mit Hilfe dieses Protokolls konnte gezeigt werden, dass die exogene Expression eines microRNA-Gens zu Beginn der ESC-Differenzierung die HPC-Generierung blockiert. Wenn das microRNA-Gen jedoch in EB-abgeleiteten Zellen exprimiert wird, nachdem naszierendes Mesoderm produziert wurde, verbessert es die hämatopoetische Differenzierung. Diese Methode ist nützlich, um die Rolle von Genen nach der Gewinnung von spezifischem Keimblattgewebe zu untersuchen.

Einleitung

Maus embryonale Stammzellen (ESCs) sind pluripotent, bleiben undifferenziert und erneuern sich selbst, wenn das Zytokin Leukemia Inhibitory Factor (LIF)1 vorhanden ist. Nach Entzug der LIF differenzieren sie sich spontan in 3-dimensionale (3D) Strukturen, die als Embryoidkörper (EBs) bezeichnet werden2. Die 3D-Architektur ermöglicht die Entwicklung der drei Keimblätter Ektoderm, Endoderm und Mesoderm, aus denen später reife Gewebetypenentstehen 3. ESCs sind ein hervorragendes Modell zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der zellulären Differenzierung, insbesondere zur Untersuchung der Entwicklung früher hämatopoetischer Vorläuferzellen (HPCs)4.

Die Genexpression in ESCs kann durch verschiedene Techniken manipuliert werden, die es ermöglichen, eine Rolle für einzelne Moleküle in der Entwicklung zu bestimmen. Eine der gebräuchlichsten Techniken ist die homologe Rekombination zur Erzeugung von ESC-Linien, denen ein interessierendes Gen fehlt5,6. Es gibt auch eine Reihe von Techniken, die verwendet wurden, um Gene zu überexprimieren. Die erste Technik, die zur Modifikation der Genexpression in ES-Zellen verwendet wurde, bestand darin, sie mit rekombinanten Retroviren zu infizieren7,8. Das interessierende Gen wird jedoch oft zum Schweigen gebracht, da sich die ESCs in Vorläuferzellen und reife Zelltypen differenzieren. Die Verwendung von Lentiviren hat sich als erfolgreich erwiesen, um das Silencing von viral exprimierten Genen zu begrenzen9. Andere virale Vektoren, die für die Überexpression verwendet werden, sind das Adenovirus und das Adeno-assoziierte Virus10. Darüber hinaus werden Standard-Transfektionstechniken zur stabilen Einführung von Expressionsplasmiden häufig für die ESC-Transgenexpressionverwendet 11. Eine Schwierigkeit bei diesen Systemen besteht darin, dass die Expression eines bestimmten Gens oft je nach zeitlicher Expression unterschiedliche Auswirkungen hat. Zum Beispiel beeinflusst das Smad1-Protein die Entwicklung hämatopoetischer Zellen in verschiedenen Stadien der EB-Entwicklung unterschiedlich12,13.

Dieses Problem kann durch die Erzeugung von ESCs umgangen werden, die induzierbar ein interessierendes Gen exprimieren. Das gebräuchlichste System zur induzierbaren Expression von Transgenen in ESCs verwendet das Tetracyclin-Resistenz-Operon aus E. Coli (Escherichia coli). Es wurden mehrere verschiedene Tetracyclin-Systeme entwickelt. Eine der beliebtesten Strategien wurde von Kyba und Kollegenentwickelt 14. Sie erzeugten eine ESC-Linie (Ainv15), in die das reverse Tetracyclin-Transaktivator-Gen in den konstitutiv aktiven ROSA26-Locus eingefügt ist. Ein Tetracyclin-Response-Element (TRE), eine nachgeschaltete LoxP-Stelle (Locus von X-over P1 aus dem Bakteriophagen P1) und eine promotorlose Neomycin-Kassette wurden in den HPRT-Locus (Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase) auf dem X-Chromosom eingeführt. Mit Hilfe eines CRE-Rekombinationsansatzes kann ein interessantes Gen zusammen mit einem eukaryotischen Promotor zur Steuerung der Expression des Neomycin-Resistenzgens in die LoxP-Stelle eingefügt werden. Korrekt ausgerichtete Regler werden durch G418-Selektion isoliert. Diese Zielklone müssen dann auf die Doxycyclin- (oder Tetracyclin)-induzierbare Expression des Transgens getestet werden. Dieser Ansatz hat erfolgreich ESC-Linien generiert, die induzierbar HoxB4, Stat5, SCL und Smad714-17 exprimieren. Die Generierung dieser induzierbaren Zelllinien ist jedoch zeitaufwändig. Hier wird eine Methode beschrieben, um ESC-abgeleitete Embryoidkörper (EBs) in Einzelzellsuspensionen zu zerlegen, die Zellsuspensionen an verschiedenen Entwicklungstagen retroviral zu infizieren und dann die EBs durch hängenden Tropfen neu zu reformieren. Die Downstream-Differenzierung wird später durch Durchflusszytometrie bewertet. In diesem Artikel wird ein Beispiel dafür gezeigt, wie sich die miRNA-Expression in EB-abgeleiteten Zellen auf die hämatopoetische Differenzierung auswirkt. Diese Methode ist nützlich, um die Rolle von Genen nach der Gewinnung von spezifischem Keimblattgewebe zu untersuchen.

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Protokoll

1. Embryoidkörper (EB) Bildung

  1. Gelatine-Anpassung WSR, die auf Mausembryo-Fibroblasten (MEF) gehalten wurden. Passage WSR 3 mal am 6. Gewebekulturplatte mit 0,1% Gelatine beschichtet, um MEFs entfernen.
    1. Wachsen Zellen im ESC Wartung Medien mit LIF, um die Zellen undifferenziert (Tabelle 1) zu halten. Stellen Sie sicher, Zellen 80% Konfluenz nie überschreiten. Verwenden Sie niedrige Durchgang (10 oder weniger Stellen nach dem Entfernen von MEF-Zellen) für die Differenzierung.
  2. Am Tag vor WSR sind für EB Differenzierung kultiviert, Durchgang die Zellen, so dass sie etwa 50-70% konfluent am nächsten Tag. Weiter Kultivieren von Zellen in Erhaltungsmedium ESC zu Zelle Pluripotenz behalten.
  3. Am Tag der Differenzierung, absaugen ESC Erhaltungsmedium und Waschen mit 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 11,9 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) pro Vertiefung einer 6-Well-Platte.
    1. Geben Sie 200 ul von 0,25% trypsin / EDTA zu jeder Vertiefung und bei 37 ° C für 3 min.
    2. Inaktivierung des Trypsin / EDTA mit 800 ul der Differenzierung Medien. Pipette auf und ab in einem 2 ml-Pipette mit einer serologischen p200 Spitze gegen Aufbruch der Zellen in einer Einzelzellsuspension. Sicherzustellen, dass die p200 Spitze passt genau auf das Ende so Medien geht nicht zwischen der Pipettenspitze und Schnittstelle.
    3. Pipette auf und ab ca. 5-10 mal. Achten Sie darauf, Blasen beim Pipettieren erstellen.
  4. Übertragungszellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Um das Volumen auf 10 ml mit PBS. Zentrifuge bei 315 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
  5. Überstand entfernen. Zweimal waschen mit 5 ml PBS Reste enthält, LIF entfernen. Zentrifuge nach Schritt 1.4 für jede Waschung.
    1. Resuspendieren endgültige Zellpellet in 2 ml Differenzierungsmedium (Tabelle 2).
  6. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer oder Zellzähler und Platte 6.000-10.000 Zellen / ml in einer 10 cm Petrischale(Nicht-Gewebekultur-behandelten).
    1. Bestimmen Sie die genaue Zellen / ml empirisch für jede Zeile ESC. Sterile Petrischalen in der Regel für die bakterielle Arbeit oder geringe Haftung Platten verwendet.
      HINWEIS: Die besten Ergebnisse Differenzierung, sollte das EBS Kugeln, die in Suspension bleiben, ohne Befestigung an der Platte zu bilden. Testen Sie mehrere Marken von Platten, um diejenigen mit der geringsten Einhaltung zu finden.
    2. Die Differen WSR inkubieren bei 37 ° C Brutschrank mit 5% CO 2.
Reagens Lager Endkonzentration Volumen Firma Katalognummer
DMEM 1x 410 ml S igma / Aldrich D5796
FBS (ES abgeschirmt) 100% 15% 75 ml Hyclone SH30070.03E
Nicht-essentielle Aminosäuren 100x 1x 5 ml Life Technologies 11140
L-Glutamin 100x 1x 5 ml Life Technologies 35050
Penncillin / Streptomycin 100x 1x 5 ml Life Technologies 15070
β-Mercaptoethanol 14,3 M 114 uM 4 ul Sigma / Aldrich M3148
Leukemia Inhibitory Factor (LIF) 10 7 Einheiten / ml 1.000 Einheiten / ml 50 ul Millipore ESG1107
NHALT "> Tabelle 1: ESC Wartung Medien.

Reagens Lager Endkonzentration Volumen Firma Katalognummer
DMEM 1x 410 ml Sigma / Aldrich D5796
FBS (User Abgeschirmte für optimale Differenzierung) 100% 15% 75 ml Hyclone SH30070.03E
Nicht-essentielle Aminosäuren 100x 1x 5 ml Life Technologies 11140
L-Glutamin 100x 1x 5 ml Leben TechnoloGies 35050
Penncillin / Streptomycin 100x 1x 5 ml Life Technologies 15070
β-Mercaptoethanol 14,3 M 114 uM 4 ul Sigma / Aldrich M3148

Tabelle 2: Differenzierung Medien.

2. Vorbereitung EB Zellen für Virus-Infektion

  1. Bei der gewünschten Ausbaustufe (zwischen Tag 2 und Tag 3), übertragen Sie die EVG aus der Petrischale 10 cm bis 15 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte mit 5 ml PBS und fügen Sie den zu waschen, um die konische Röhre.
  2. Pellet die EVG bei 315 × g bei Raumtemperatur für 5 min. Mit 5 ml PBS waschen Sie die EB-Zellen.
  3. 1 ml der aufgetauten Zellablösung Lösung (mit proteolytischen Enzymen und kollagenolytischen) und legen Sie die Röhrchen in einem 37 ° C warmen Wasserbad (oder Inkubator) für 30 min mit occasional Agitation (von schnippen oder Licht Vortex).
  4. 1 ml Differenzierungsmedium. Pipette auf und ab mit einer 2-ml-Pipette mit einem p200 Pipettenspitze. Das Röhrchen wird in 37 ° C warmen Wasserbad wieder für 30-60 min.
  5. Spin-Down der Zellen bei 315 xg für 5 min und waschen Sie die Zellen mit PBS.

3. Virus-Infektion

  1. Resuspendieren der Zellen in 1,5 ml Differenzierungsmedium. Übertragen der Zellsuspension auf eine 6-Well-Gewebekultur nicht behandelten Platte.
  2. Bereiten Sie das Retrovirus durch Standardverfahren vor der Zeit. Hinzufügen von 5 bis 100 ul Virusüberstand, um Zellen abhängig von viralen Titer. Sie Polybren nicht hinzufügen, um eine Infektion zu erhöhen, da dies hemmt die spätere Reformation der EVG.
  3. Spinoculate der Zellen mit Virus durch Zentrifugieren bei 2.120 × g für 90 min bei Raumtemperatur.

4. Differenzierung Viral Infizierte EB Zellen in hängenden Tropfen

  1. 2 ml Differenzierungsmedium in jede Vertiefung infected EB Zellsuspension.
  2. Pipette 3,5 ml EB infizierten Zellsuspension in ein steriles Reagenz Reservoir für multipipettors. Verwenden Sie die multipipettor 15-20 Reihen von acht 20 ul Tropfen auf dem umgekehrten Deckel des 15 cm Petrischale pipettieren.
  3. 10 ml steriler PBS oder Wasser auf die untere Hälfte der Petrischale. Dann kehren die Deckel mit den Tropfen und Ort auf die Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die Tropfen auf den Kopf von Deckel mit PBS oder Wasser unten hängen zu halten, der Kammer befeuchtet.
  4. Die Schalen werden in den 37 ° C Brutschrank mit 5,0% CO 2.
  5. Nach 2 Tagen sammeln EBs Tropfen durch Invertieren Deckel und Waschen mit 4,5 ml Differenzierungsmedium im hängenden gebildet.
    1. Übertragungsmedien und EBS zu einem neuen 10 cm nicht-Gewebekulturpetrischale. Mit 3 ml Differenzierungsmedium und Transfer zum 10 cm Teller waschen Sie den Deckel wieder.
  6. Ernten der Zellen für die Analyse durch Durchflusszytometrie nach insgesamt 8Tagen Kultur ausgehend von der anfänglichen Übertragung von Zellen auf Differenzierungsmedium (-LIF).

5. Vorbereitung Zellen für Durchflusszytometer-Analyse

  1. Übertragungszellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen mit einer 10-ml-Pipette. Waschen Sie die Platte mit 5 ml PBS und Transfer zum gleichen konischen Rohr.
  2. Pellet-Zellen bei 315 x g. Pellets mit 10 ml PBS waschen.
  3. 1 ml der aufgetauten Zellablösung Lösung und legen Sie die Röhrchen in einem 37 ° C Wasserbad für 30 min mit gelegentlichem Rühren. Für den Nachweis von bestimmten Zelloberflächenantigenen, kann Trypsin stattdessen verwendet werden.
  4. 1 ml Differenzierung Medien und pipettieren nach oben und unten mit einem 2-ml-Pipette. Verwenden Sie ein p200 Spitze zum Ende der Pipette zu helfen, brechen-up verdaut EB in Einzelzellsuspension.
    1. Das Röhrchen wird in ein 37 ° C Wasserbad für 60 min wieder, damit die integrale Membranproteine ​​auf der Zelloberfläche zu recyceln.
  5. Pellet-Zellen bei 315 × g für 5 min.
  6. Waschen Sie die Zellen with 0,1% Rinderserumalbumin Fraktion V (BSA) in PBS (PBS / BSA) hergestellt und Inkubation der Zellen mit spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern.

6. Durchflusszytometrie-Analyse für hämatopoetische Vorläufer

  1. Platz 10 6 EB-abgeleiteten Zellen in einem 5 ml 12 x 75 mm Rundrohr unten. Zur Einstellung Durchflusszytometer Korrektureinstellungen verwenden Entschädigung Perlen nach Herstelleranweisungen.
  2. Pellet-Zellen bei 315 x g. Überstand abgießen und Pellet in Rest PBS / BSA-Lösung in der Röhre.
  3. Zum Erfassen ESC HPC, Inkubation der Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörper: anti-Maus-CD41-PE (R-Phycoerythrin) und Anti-Maus-CD117 (CKIT) -APC / CY7 (Allophycocyanin Cyanin 7).
    1. Verdünnte Antikörper 1: 100 in PBS / BSA. 100 ul des verdünnten Antikörpers zu jeder Probe. Bestimmen Sie die richtige Verdünnung des Antikörpers für jeden Lieferanten, Klon und viel oder Antikörper. Bestimmen Sie optimale Verdünnung für die Markierung von Zellen einzeln.
  4. Proben auf Eis inkubieren im Dunkeln für 30 min.
  5. 2 ml PBS / BSA-und Pellet-Zellen bei 315 × g für 5 min.
  6. Überstand wird abgesaugt und das Pellet erneut in 300 ul PBS oder einem isotonischen Puffer.
  7. Filter resuspendierten Zellen durch eine Zelle Sieb Kappe (0,35 uM), um große Zellaggregate zu entfernen.
  8. Analysieren Zellen mit einem Durchflusszytometer.

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Ergebnisse

In diesen Studien verkleistert RW4 (abgeleitet von 129X1 / SVJ Mausstamm) WSR verwendet wurden. EBs wurden nach 3 Tagen der Differenzierung isoliert. Für beste Ergebnisse sollte das EBS kugelförmig und nicht haft (Abbildung 1A, B). Nach spinoculation mit Virus co-exprimieren, die Fluoreszenzmarker GFP zusammen mit einem Gen von Interesse wurden EBs des Hängetropfenverfahren reformiert. EBs wurden erfolgreich aus Zellsuspensionen von 2,0, 2,5 und 3,0 Tage EVG vorbereitet reformiert. Allerdings könnte EVG...

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Diskussion

Wie oben diskutiert, können Klone, die ESC induzierbar ein Gen von Interesse exprimieren mit Doxycyclin Systeme erzeugt werden, jedoch ist die Erzeugung dieser Leitungen zeitaufwendig und arbeitsintensiv. In diesem Protokoll beschrieben ist eine Methode, um ein Gen von Interesse in Einzelzellsuspension von ESC vorbereitet abgeleitet EVG auszudrücken. Diese infizierten Zellen werden dann durch hängenden Tropfen auf nachfolgende Differenzierung zu untersuchen, in EBs reformiert. In dem Beispiel (Figur 3) ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offen zu legen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch ein Pilotprojekt und Feasibility Grants des Indiana University School of Medicine Center (IUSM) for Excellence in Molecular Hematology (NIDDK, 5P30DK090948) unterstützt. Zusätzliche Mittel wurden durch einen Biomedical Enhancement Grant des IUSM bereitgestellt. Wir danken Dr. Karen Cowden Dahl für die Kommentierung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMSigma/AldrichD5796
β-MercaptoethanolSigma/AldrichM3148
FBS (ES gescreent)HycloneSH30070.03E
FBS (definiert)HyklonSH30070.03
Nicht-essentielle AminosäurenLife Technologies11140
L-GlutaminLeben Technologies35050
Penn/StrepLife Technologies15070
Trypsin/EDTALife Technologies25200
LIF ESGROMilliporeESG1107
ACCUMAXMilliporeSCR006
Trypsin/EDTALife Technologies25200
Falcon Gewebekulturplatten 6- well Fisher Scientific08-772-1B
Falcon Unbehandelte Platten 6-wellFisher Scientific08-772-49
Falcon Petrischale 10cm Fisher Scientific08-757-100D
Falcon Petrischale 15 cmFisher Scientific08-757-148
Falcon Tube 5 mlFisher Scientific14-959-11A
Falcon Tube 5 ml mit Cell Strainer CapFisher Scientific08-771-23
Weiße sterile ResevoirsU.S.A. Scientific111-0700
Ratte Anti-Maus CD41 PE-konjugiertBiolegend133906
Ratte Anti-Maus CD117 APC/CY7-konjugiertBiolegend105826
RW4 ReglerATCCCRL-12418

Referenzen

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