マウス副腎クロマフィン細胞における細胞 - 添付容量測定のための方法

Introduction

シナプス伝達は、神経伝達物質を含むシナプス小胞のエキソサイトーシスによって媒介され、これらの小胞は、長期的にはニューロンの通信を維持する神経末端内のローカルエンドサイトーシスのリサイクルを受けなければならない。脳内のシナプス伝達の重要な役割を考えると、シナプス小胞サイクルを構成している分子機構を理解することは、全体としてセルラ通信でより良い理解に向けて不可欠な基盤である。細胞モデル系の中では、副腎髄質細胞は、シナプス小胞のリサイクルの根底にある分子機構に最も決定的な洞察のいくつかを提供してきました。エキソサイトーシス、神経伝達物質放出の最終段階は、非常に学び、副腎クロマフィン細胞^1,2を使用することによって検討されている。実際には、分泌顆粒の形成、ターゲティング、ドッキングおよび融合を調整する分子の選手のほとんどが原因のdivの適用に同定されているクロマフィン細胞¹におけるERSEテクニック。さらに、エキソサイトーシスに関与するタンパク質合成機構の単一小胞の解決を可能にする機会を提供することにより、クロム親和性細胞は、小胞融合³の問題に対処するための強力なモデルのままです。

細胞結合型の静電容量の測定は、第³エキソサイトーシスの間に単一小胞の融合を解決に利用した。直径60nmのセル接続構成^4-7のパッチクランプ技術を用いて細胞膜アドミタンス測定によって検出されることが実証されている〜と小さい小胞のエキソサイトーシス。アドミタンスは、回路またはデバイスは、電流が流れることを可能にする方法を簡単の尺度として定義される。それは、インピーダンスの逆数である。このように、アドミタンス測定値は、膜キャパシタンスの理解を提供する。これは、原形質膜への小胞の膜を組み込むことによって達成される。この取り込みは、表面の変化を明らかにエリア^8。各融合する小胞は、膜キャパシタンス^9,10段階的増加を引き起こす。また、このアドミタンス測定は、膜コンダクタンスとエキソサイトーシス事象³時の融合孔コンダクタンスを提供しています。この技術は、エキソサイトーシスの間に単一小胞の動態を同定することをユニークなツールを提供してきたように、私たちの研究室は最近、単一の小胞^11,12のエンドサイトーシスを検出するために、この概念を適用しております。

私たちの具体的な関心は、多くの細胞の基本的なハウスキーピング部品¹³として、および神経端子^14,15におけるシナプス小胞エンドサイトーシスのための主要な経路と考えられてきたクラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）、である。 CMEは、生物学的に重要であることが知られているが、その動態は、単数エンドサイトーシスイベントを監視する技術的な制限のためによく理解されていないままである。マフィン細胞と神経細胞¹との間のエキソサイトーシスの機構の類似性を考えると、PLはクロマフィン細胞での分裂メカニズムはおそらくニューロンにシナプス小胞エンドサイトーシスに適用することができることがausible。細胞結合型の静電容量の測定は、個別のエンドサイトーシスイベントを監視し、ほとんどの方法は、解決できない核分裂反応速度を分析するために利用されてきた。私達のセルに接続された記録では、20kHzの正弦波は、保持電位上に重畳され、出力電流は、二相ロックインアンプから他のチャネルでのチャネル及び膜キャパシタンスに膜コンダクタンスに分離される^{16 18。}膜コンダクタンスと静電容量の変化から、人はおそらく小胞ピンチオフする前に細胞膜に内在化小胞をつなぐ管状膜ネックに対応核分裂細孔の動態を計算することができます。総称して、この技術は私たちにCMEの中に小胞分裂の調節メカニズムを検討する機会を与えてくれます。

Protocol

注：イリノイ大学シカゴ校の動物実験委員会によって承認された全体の手順は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施した。

1。ソリューションおよび培養培地の準備

1. 6ヶ月までのために-20℃で、すべてのソリューションにしてください。 3ヶ月まで4℃で培養培地にしてく​​ださい。
2. DMEM中で100mlにITSX（インスリン - トランスフェリン - セレンサプリメント）1ペン連鎖球菌溶液および1ミリリットルを混合することにより、培養培地100mlのを準備します。
3. 100のCaCl _2、および50mM EDTAを2.5ミリリットルの2.5ミリリットル、250ミリリットルのDMEMを混合して酵素溶液を調製します。
4. DMEMを225ミリリットル、FBSを25ミリリットル、アルブミン625 mg及び625 mgのトリプシン阻害剤を混合して不活性化溶液を調製する。
5. 154のNaCl、5.6のKCl、5.0mMのHEPES、3.6 mMの炭酸水素ナトリウム、5.6 mMグルコースのロックのソリューションを準備します。 NaOHで7.3にpHを調整する。
6. 50 mg / mlののポリ-D-リジン（PDL）溶液を調製する。被覆カバースリップに1mg / mlの最終濃度を使用する。
7. 140mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのCaCl _2を 、1mMのMgCl _2、10mMのHEPES-NaOHを、および10 mMグルコースの細胞外溶液を調製する。 〜310ナノモル/ kgで浸透圧をNaOHで7.3にpHを調整する。
8. 50のNaCl、100mMのTEACL、5mMのKCl、2mMの_塩化カルシウム、1mMのMgCl _2、および10mMのHEPESのピペット溶液を調製します。 〜290ナノモル/ kgで浸透圧をNaOHで7.3にpHを調整する。

2副腎の分離

1. 大小の解剖ハサミとピンセットの2組のペアをオートクレーブ。全体のプロセスの間に手袋を着用し、氷のバケツに解剖トレイを置きます。
2. 日0-3で取られたマウスを使用してください。断頭続いて加圧CO ₂タンクで動物を安楽死させる。
3. チェルビから背骨以下の子犬の背中を削減するハサミの小さいセットを活用尾側領域にcalは。皮膚の下に表面的に切断され、体腔内に刺していないようにしてください。
4. 離れて背骨から次に、剥離皮膚筋系は脊柱の明確な見解を持って露出するように。ここから、頸髄でtransectionalカットを行い、その後、背骨の両側に沿って2つの平行カットを行う。
5. 動物の本体を保持する鉗子の一組では、脊柱をつかみ、腎臓が露出するまで、背骨をバック剥離する鉗子の他のペアを使用しています。
6. このとき、腎臓の上に副腎を可視化。その後、慎重にロックの溶液を充填したコニカルチューブに各動物から2腺を配置します。
   注：たまに腺が鉗子に固執します。この場合は、静かに鉗子からロックの溶液に腺の除去を助けるために鉗子の別のペアを使用する。腺は、最大2時間この状態に保つことができる。

E "> 3。組織消化

1. 一方、気泡使用前に15分間、5％CO ₂ + 95％のO ₂との酵素溶液。平衡化したソリューションは、ピンクがかった/オレンジ色に鮮やかなピンク色の電源が入るか確認します。
2. 20〜25単位/ mlの最終濃度で新鮮に泡立て酵素液にパパインを追加します。パパイン酵素溶液中、37℃で40〜60分間、各動物から腺の各ペアをインキュベートする。
3. 各チューブに不活性化溶液の75％を加え、さらに10分間37℃でインキュベートする。このインキュベーションは、パパインの酵素活性を不活性化する。
4. 不活性化溶液で10分間インキュベーションした後、穏やかに新たに標識されたチューブに腺を転送して腺を培養培地で3回洗浄する。

4。細胞解離とめっき

1. 洗浄後、培養培地を200μlに2腺を配置し、 静かに腺を滴定し、ダウン200μlのピペットを用いてピペットチップを通して組織の大部分が溶液中にもはや存在するまで。
   NOTE：滴定すると、200μlのピペットの先端から下向きの力でチューブの底腺を維持し、穏やかにゆっくりと組織に係合する。高速または突然のピペッティング決して遅く、連続ストロークを使用するように注意してください。
2. 450μlの最大の培地の全量を、追加の250μlの培養培地を追加します。
3. プレートを60×15mmの培養皿に入れ、7つ12ミリメートルPDLプレコーティングしたカバースリップを、それぞれ上にこの細胞を含む溶液の60μlの。
4. 一度メッキ、細胞生存率のための環境を確保するために30分間、5％CO ₂の定常流/供給しながら37℃に設定され、維持さインキュベーターに皿を置く。インキュベーションの後、静かに培養皿に予め温め培地の5ミリリットルを追加し、24時間インキュベーターに戻し、皿を返す細胞アタッシュケースの前にD録音。
   注：典型的には、細胞は、最大4日間、電気生理学的記録のために使用することができる。

5。細胞の同定およびギガオームシール形成

1. 細胞外液中に12mmのカバーガラスを配置します。全体副腎が細胞調製のために使用されるので、ベージュ/茶色がかったカラーリングと皮質細胞（細胞をクロム親和よりも小さく、調光器）と、培養中の近くの円形のフォーム（ 図1）と非常に明るいクロム親和細胞（通常はを混ぜる。
2. プログラム可能なP-97プラーを使用して、4つの段階でパッチピペットを引き出します。 「ブローアウェイ」をするためにこのワックスをピペットチップの内部から先端をガラスの容量を低減するのに役立ち、その後火ポリッシュれる、溶けたロウにピペットチップを浸し。
   NOTE：パッチピペット溶液で満たされたときに、パッチピペットは、典型的には約2MΩの抵抗を有する。
3. 数m内の細胞に近いパッチピペットアプローチicrons。セルに接続された構成を実現するには、セルに近いパッチピペットのアプローチの間にわずかな細胞変形を探します。 GΩシールが達成されるまで、穏やかな吸引を適用します。

6セル接続型静電容量録音

1. GΩシールが明らかにされると、EPC-7プラスパッチクランプアンプと二相のアナログロックインアンプ（機器の添付の表を参照）を使用することにより、セルに接続された録音を行う。 50 mVの（実効値）の振幅とロックインアンプから20kHzの周波数で正弦波を適用します。
2. 1ミリ秒の時定数と24デシベルで、ロックインアンプの出力フィルタを設定してください。ロックインアンプなどの穏やかな吸引パルスによって生成される過渡的な静電容量の変化のみパッチコンダクタンス（再）トレースになし投影とパッチ容量（イム）トレースに表示されている（ 図2）の位相を設定します。
   注：再、システムのキャリブレーションの詳細をご覧下さいference 19。
3. 「下」の手順（ 図3）によって、一般的な静電容量の変化を識別します。
   注：固体記録は、単一の小胞を内在化を示している多くの下向きの手順で「階段」タイプの似ている、と見ることになります。動作電流は典型的には、ほとんどの細胞から記録することができるので、パッチ適用プロセスは、機械的刺激として働く。
4. そのファイル内の/月/年、自身の個別の番号（XX）として、各セルに接続された記録：個別の日を含むフォルダなど、ファイルに名前を付けます。

Representative Results

細胞生存率およびギガオームのシールの質は、細胞結合型静電容量記録の品質を決定する上で重要である。したがって、前の電気生理学的記録に効果的かつ効率的な細胞培養を調達することが重要であり、典型的な生細胞は、 図1に示されている。練習時間が高品質でギガオームのシールを達成するのに役立つであろう。プロトコルステップ5.3で説明したようにパッチピペットが細胞に近づいたときに一つは、明らかに、細胞の変形を見ることができれば、高品質のシールを得るための良いチャンスがある。 図3は、関連する複数の下向きステップで膜キャパシタンスの典型的な記録を実証単一小胞エンドサイトーシス。

実行可能なマウスの副腎髄質細胞の図1の例細胞培養24時間後。3の生クロマフィン細胞に矢印ポイント。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

セルに接続された記録の中で、図2の位相調整。初期位相設定では、穏やかなを吸引過渡の両方の容量（イム）の変化とコンダクタンス（Re）が痕跡を引き起こし、再トレースで投影が23°の位相で相殺されているシフトします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3典型的なC単一小胞エンドサイトーシスに関連する複数の下向きのステップで録音のエル·添付容量。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

セルに接続された静電容量測定に成功し、高品質での録音を得るためには、いくつかの重要なステップが必要です：副腎から調製1）生存し、健康な細胞;カバースリップの2）、PDLコーティング; 3）ギガオームシール形成; 4）システムのノイズレベル;および5）位相補正。

動物を手術のために、一つは、潜在的な修正は、最も適した器用に外科的アプローチを調整し、解剖時の損傷を防止することである。電気生理学的記録のために利用される細胞は、副腎髄質からのみ来るように加えて、検索および副腎の除去に十分な練習が不可欠です。酵素消化のためには、5％のCO ₂ + 95％O ₂で溶液をバブリングして酵素溶液を平衡化することが重要である。シリンダに接続チューブは漏れで十分とタイトであることを確信すること。また、必ずその目的の私n個の溶液を適切に全体の15分バブリング時間の間に置かれる。これは、適切に空気流を向けるようにチューブの端部で平滑化された20 G針先端を配置することで達成することができる。また、このステップの追加の時間があれば、空気の流れがチューブ内の溶液をオーバーフローするほど強力ではありませんように傷つけることはありません。細胞の滴定は練習が必要になるもう一つの重要なコンポーネントです。過剰滴定した場合に細胞の大部分が損傷する可能性があります。滴定が十分でない場合には逆に、組織から解離した非常に少数の単離された細胞が存在することになる。効果的に滴定するには、滴定などの腺が優しく200μlのピペットチップを通過することを確認しながら、上下7-8xアップピペット200μlのピペットチップを利用して。

PDLコーティングのために、人は常にカバースリップの十分なコーティングを確実にするために、3時間までのカバーガラス上で、PDLのインキュベーション時間を延長することができます。クロマフィン細胞が付着するのPDLコーティングは非常に重要ですへと細胞播種後にカバーガラス上で成長する。 PDLコーティングが十分でない場合、細胞のほとんどは、ギガオームのシール形成が困難になり、カバースリップ、から離脱される。

パッチ技術は、専用のプロセスであるように細胞に付着した記録は、常に、変更、改良することができる。ジェントルと微妙な吸引がパッチピペットと細胞が接触している場合ギガオームのシール形成を促進する上で重要である。あまりにも多くの吸引は、パッチチップ - 細胞接触を破壊し、極端な状況では、細胞は、パッチピペット内に吸引することができる。これは非常に簡単に全細胞構成に変化させることによって、または非常に大きなものに戻す非常に最小限の抵抗によって、オシロスコープ上で観察される。実際には、高品質ギガオームのシール形成を得るために最も重要である。

高いシール抵抗がセル添付録音におけるノイズレベルを最小限に抑えるために重要であるが、以下の2つのステップでもある単一のエンドサイトーシスイベントを解決するために、ノイズレベルを低減することが重要：（1）パッチピペット溶液では、TEACLは、電位依存性K ⁺チャンネルを遮断するために利用される。 （2）ピペットチップは、粘着性のワックスでコーティングされ、ピペットチップ内部のワックスは耐熱研磨によって除去することができる。

プロトコルステップ6.2に詳述された位相調整が記録のための初期段階を設定することが重要ですが、このステップは理想的ではないかもしれない。したがって、個別のイベントの核分裂細孔分析の間に位相補正を行うことが重要である。 -65 mV程度の静止膜電位で、ホールセル記録は、典型的なマウス髄質細胞として、マウス髄質細胞の膜コンダクタンス〜を計算5pFの入力容量と500MΩの入力抵抗を有することを示す0.4 PS / fFと。これは1 FFの容量サイズのエンドサイトーシスのイベントは〜0.4 psのの膜コンダクタンスの純損失につながることを意味します。この値は、ATに比べて無視できるセルに接続された記録の中に、エンドサイトーシス核分裂気孔の閉鎖に関連したypical 50-100 psの膜コンダクタンスが変化。そこで、私たちの位相補正は、私たちはそのような前後の核分裂気孔の閉鎖が同じレベルであることを、膜コンダクタンスのベースラインを調整することができていることを確信しています。このプロセスは、私たちのデータ分析に<1％の誤差をもたらすことができる。

要約すると、ここに記載されるプロトコルは、細胞付着した静電容量の記録は、モデル系としてマウス髄質細胞を用いて、単一小胞エンドサイトーシスをモニターするために利用することができる方法を示しています。この技術は1つが、エンドサイトーシスの間に小胞分裂のための調節機構を分析することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12 mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100 ml
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm