Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beinhaltet detaillierte Verfahren zur Isolierung von Urinzellen von Muskeldystrophie-Patienten; ihre effiziente und schnelle Reprogrammierung durch Sendai-Virus-Transduktion.

Zusammenfassung

Dystrophischen Kardiomyopathie ist eine schlecht verstanden Folge der Muskeldystrophie. Generieren von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Patienten mit Muskeldystrophie ist eine unschätzbare Quelle für zelluläre in vitro Krankheitsmodellsysteme und für Wirkstoff-Screening-Studien verwendet werden. Patienten stammenden Urinzellen in erfolgreiche Reprogrammierung in induzierte pluripotente Stammzellen, um dystrophischen Kardiomyopathie Muster ¹ verwendet. Adressieren der Sicherheitsbedenken von integrierenden Vektor-Systeme, unter Verwendung eines nicht-integrierenden Sendai-Virus-Vektors für die Transduktion von Yamanaka Faktoren in den Urin-Zellen von Patienten mit Muskeldystrophie gesammelt präsentieren wir ein Protokoll. Dieses Protokoll erzeugt vollständig neu programmiert Klone innerhalb von 2-3 Wochen. Die pluripotenten Zellen sind vektorfreien Durchgang durch-13. Diese dystrophischen iPS-Zellen lassen sich in Herzmuskelzellen differenziert und entweder verwendet werden, um Krankheitsmechanismen und für Wirkstoff-Screening zu untersuchen.

Einleitung

Kardiomyopathie ist die zweithäufigste Todesursache bei Patienten mit Duchenne und Becker-Muskeldystrophie (MD). Obwohl Mutationen in dem X-verknüpften Dystrophin-Gen in 1 auftreten: 3,500 männlichen Neugeborenen, ist sehr wenig über die molekularen und zellulären Ereignisse, die zum fortschreitenden Herzmuskelschäden bekannt. Menschen induzierte pluripotente Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten stammen, wurden als neuartige Instrument, um die zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen zu studieren und für Wirkstoff-Screening ^1,2 verwenden entstanden.

Die erwartete Beschwerden von Hautbiopsien oder Blutproben kann jungen Patienten und / oder ihrer Erziehungsberechtigten davon abzubringen, die Einwilligung zur Studienteilnahme zu geben. Urinproben ein nicht-invasives Quelle somatischer Zellen, abänderbar Neuprogrammierung Methoden. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Urin Zellen von Muskeldystrophie Patienten gesammelt wurden, können kultiviert werden und effizient in iPSCs Hilfe retroviraler Transduktion mit den Yamanaka Faktoren (umprogrammiertOCT3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc; OSKM) ^1. Der Nachteil der retroviralen Gentransfer ist die zufällige Integration der Umprogrammierung Gene in die Wirtschromosomen. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir das nicht-integrierenden Sendaivirus zur Urin Reprogrammierung verwendet.

Dieses Protokoll beschreibt die Sendai-Virus Reprogrammierung von Zellen aus Urin isoliert Muskeldystrophie-Patienten, die dann in Herzmuskelzellen oder anderen Zelltypen für eine weitere Studie unterschieden werden können. Dieses Protokoll kann auch für andere Patienten spezifischen Krankheiten angepasst werden.

Protokoll

HINWEIS: Die Patienten und / oder ihrer Erziehungsberechtigten sollten Einwilligung in einem Institutional Review Board teilzunehmen geben genehmigten Studie.

1. Puffer und Medien Vorbereitungen

1. Waschpuffer: Zu 100 ml Waschpuffer vorbereiten, 1 ml der 100x Pen / Strep-Lösung (100 U / ml Penicillin + 100 ug / ml Streptomycin) und 99 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
2. Urinary Vorläuferzellen Cell (UPC) Medium: Um UPC Medium herzustellen, mischen gleichen Volumina von Keratinozyten Serum Free (KSF) Medium + Vorläuferzellen Cell Medium.
   1. KSF Medium: Um Keratinozytenmedium vorzubereiten, fügen Sie 5 ng / ml des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), 50 ng / ml Rinder (BPE), 30 ng / ml von Choleratoxin und Pen / Strep-Lösung (100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin) versetzt, um 500 ml Medium KSF.
   2. Vorläuferzellen Cell Medium: In drei Viertel der DMEM mit einem Viertel der Ham-F12-Medium und ergänzt mit 10% FBS, 0,4 ug / ml Hydrocortison, 0,1nM Choleratoxin, 5 ng / ml Insulin, 1,8 x 10 ^-4 M Adenin, 5 ug / ml Transferrin, 2 x 10 ^-9 M triiod Thyronin, 10 ng / ml EGF und Pen / Strep-Lösung.
3. hES Medium: Fügen Sie 20% KO-Serumersatz (K-SR), 1x MEM nicht essentiellen Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 100 uM β-Mercaptoethanol, 20 ng / ml bFGF und Pen / Strep zu 400 ml DMEM / F12-Medium.

2. Urinprobenentnahme

1. Weisen Sie die Patienten, um Flüssigkeiten 30 Minuten vor dem Sammelurin trinken, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Menge (~ 30-40 ml) der Urin gesammelt werden können.
2. Geben Sie dem Patienten und / oder deren Erziehungsberechtigte eine Urinsammlung Kit mit folgendem Inhalt: (1) schriftliche Anweisungen zur Steril- oder Reinfangurinprobe zu erhalten, (2) feuchte antibakterielle Toiletten, und (3) eine 100 ml sterile Proben-Sammelbecher. Patienten sollen angewiesen Probe zu sammeln.
3. Sofort legen Sie die Urinproben auf Eis und Transfer zum laboratory in einem Kühler. Verarbeiten Sie die Urin zur Zellisolierung sofort. Wenn eine Verzögerung unvermeidlich, lagern die Probe auf Eis für bis zu 4 h bei minimalem Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen.

3. Isolierung und Expansion von Urin Cells

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen in einem BSL2 Biologische Sicherheitswerkbank.

1. Mit sterilen Pipetten, um den Transfer Urinproben 50-ml-Zentrifugenröhrchen steril. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei RT.
2. Saugen Sie den Überstand zu verlassen 1 ml in der Röhre; darauf achten, dass das Zellpellet zu stören.
3. Resuspendieren und verbinden die Pellets aus einer Vielzahl von Röhren in 7 ml Waschpuffer und wiederholen Zentrifugation bei 400 × g für 10 min bei RT.
4. Vorsichtig den Überstand aspirieren, so dass die Zellpellet und ~ 0,2 bis 0,5 ml Überstand. Resuspendieren in 2-3 ml Urin-Vorläuferzellen Cell (UPC) Medium und übertragen Sie die Suspension in 4-6 Vertiefungen einer unbeschichtete 24-Well-Platte.
5. Nach 72 Stunden, ergänzen die Kultur mit 0,5 ml frischem UPC Medium pro Vertiefung und ändern Medium alle 2-3 Tage nach der. Die Erythrozyten und Schuppenzellen, die nicht an der Platte zu befestigen müssen mit den Mediumwechsel entfernt werden.
6. Überwachen Kultur nach 4-6 Tagen.
   HINWEIS: Kleine 2-4 Zellkolonien beginnt zu erscheinen. Cells wird abgerundet oder verlängert, die Typ I oder Typ II Nierenepithelzellen (RE) Zellen jeweils ³ darzustellen.
7. Ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage, da, sobald die Zellen erscheinen, werden sie einen kräftigen Wachstumsphase durchlaufen.
8. Sobald die Zellen Konfluenz von 80-90% zu erreichen, in der Umgebung von 9-15 Tagen nach der Plattierung zu dissoziieren und den Durchgang der Zellen (15,000-18,000 Zellen / cm ²⁾ auf 2-4 Vertiefungen der Platte mit 24 Vertiefungen zur weiteren Expansion. Kennzeichnen Sie diese als Zellpassage 1 (P1).
9. Charakterisieren Urinzellen für Linie Spezifikationen durch Durchflusszytometrie, immunohistochemchemische Färbung oder durch Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR).
10. Reprogram isoliert Urin Zellen (Abschnitt 4) oder frieren Sie sie in Freezing Medium (DMEM, ergänzt mit 10% Serum und 10% DMSO) für langfristige Kryolagerung.

4. Urin Zell Reprogrammierung Mit Sendai Virus

HINWEIS: Der richtige Umgang mit und die Verwendung von PSA (persönliche Schutzausrüstung) wird empfohlen, während die Manipulation der Transfektion Mittel. Die folgenden Schritte werden unter sterilen Bedingungen in einem BSL2 Biologische Sicherheitswerkbank. Die ordnungsgemäße Entsorgung der Transfektion Mittel und / oder transfizierten Zellen wird empfohlen, um das Risiko von Umwelt- und Gesundheitsgefahren zu vermeiden. Für Urin Reprogrammierung, verwenden Sie ein Sendai Reprogrammierung Kit mit Änderungen an Feeder-abhängigen Protokoll des Herstellers wie unten beschrieben.

1. Um einen hohen Wirkungsgrad Neuprogrammierung mit dem Sendai-Virus zu gewährleisten, verwenden Sie Gänge 1-5 von Urin-Zellen, die schnell sindly Division. Wenn die Zellen nicht gut replizieren oder werden seneszenten, verwerfen, da sie nicht effizient neu zu programmieren.
2. Seed 60.000 Zellen pro Vertiefung in zwei Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen. Markieren Sie diese als Tag -2. Einzustellen Zellsaat Dichte (5 x ^Oktober 4-9 × 10 ⁴ Zellen pro Vertiefung) wie erforderlich, um 80-90% Konfluenz von Tag 0 zu erreichen.
3. Am Tag 0 (48 h nach dem Ausplattieren der Zellen), bereiten die Sendai Umprogrammierung Vektoren (SeV), die jede der vier OSKM Faktoren. In jeder der Vektoren zu 1 ml vorgewärmten UPC Medium. Verwenden Sie eine MOI von 1-1,5 (5-7,5 x 10 ⁵ CIU), die ausreicht, um eine Anpassung Urinzellen ist. Saugen Sie das Medium und langsam 1 ml UPC + SeV zu einer Vertiefung der Urin Zellen hinzuzufügen. Verwenden Sie die zweite sowie die Weiterleitung Negativkontrolle.
4. Am Tag 1, ersetzen Sie die UPC + SeV Medium durch frisches Medium UPC. Einige Zelltod nach 24 h durch virale Zytotoxizität gesehen.
5. Je nach Effizienz der umprogrammiert clonE-Formationen und die kompakte Morphologie, halten Wechsel des Mediums täglich bis Tag 6 oder 7.
6. Einen Tag vor der Dissoziation von transduzierten Zellen (Tag 5 oder 6), vorzubereiten MEF Nährplatten durch Plattieren Mitomycin-C (10 ug / ml für 3 Stunden) behandelt-MEFs bei einer Dichte von 5 x 10 ⁴ Zellen / cm ² auf 0,1 % Gelatine beschichtete 100 mm ² Kulturschalen.
7. Am nächsten Tag (Tag 6 oder 7), dissoziieren die Zellen mit 0,25% Trypsin, Resuspendieren der Zellen in Medium und UPC Platte 5 × 10 ⁴ - 2 x 10 ⁵ Zellen / 100 mm ² MEF Zuführplatte.
8. Am folgenden Tag zu hES Medium wechseln und das Medium jeden Tag. Beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um transformierte Zellen zu überwachen.
   HINWEIS: Die Zellen klonale Aggregaten mit typischen Kopfsteinpflastermorphologie und mit höheren Zellkern zu Plasma-Relation (12-18 Tage nach der Weiterleitung) zu bilden.
9. Innerhalb von zwei bis drei Wochen nach der Transduktion abholen Kolonien und Übertragung auf neue Platten für clonal Expansion.
10. Führen Lebendzellfärbung zum Auswählen iPSC Klone durch Inkubieren von Zellen mit TRA-1-81-Antikörper für 1 h bei 37 ° C im CO ₂ -Inkubator nach Gegenfärbung mit spezifischen Fluoreszenzfarbstoff konjugierten sekundären Antikörper, gefolgt für 1 h bei 37 ° C im CO ₂ -Inkubator.
11. Verwenden Sie eine 26 G 1½ Zoll Nadel Quer schlüpfen die größeren TRA-1-81 positive iPSC Klone in kleine gleichgroße Stücke (4-6 Stück pro Klon).
12. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze zu holen und den Transfer 10-20 schraffierte Stücke aus mehreren Klonen in jede Vertiefung der Matrigel (10 ug / cm ²⁾ beschichtete 24-Well-Platte mit hES-Medium.
    HINWEIS: Stücke von einem einzigen Klon einzeln in einer einzigen Vertiefung plattiert nicht erweitern oder pflegen Pluripotenz.
13. Ändern von hES zu iPSC Medium 24-48 Stunden nach der Umprogrammierung Klone werden auf die Matrigel Oberfläche befestigt.
14. Während der Wartung auf Matrigel-beschichteten Platten, manuell scrape-off alle differenzierten Zellen oder verunreinigen MEF Feeder-Zellen mit einer Pipette-Spitze bis zur voll reprogrammiert und pluripotent dystrophischen iPSC (MD-iPS) Klone anzureichern.
15. Nachdem einzelne Klone wurden ~ 100 & mgr; m Größe erreicht, erweitern die Klone durch Dissoziieren mit 0,48 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) Lösung für 3 min und Beschichtung kleine Zellaggregate von MD-iPSCs in iPSC Medium (ergänzt mit 5 uM Y27632, Rho-Kinase-Inhibitor ) auf frischen Matrigel (10 ug / cm ²⁾ beschichtete 12-Well-Platte. Ändern iPSC Medium täglich.
16. Voll Umprogrammierung jedes Klons kann sowohl durch Genexpressionsanalyse OSKM Gene und immunhistochemische Färbung von Pluripotenzmarker (Oct3 / 4 und TRA-1-81) bestimmt werden. Eine rigorose Bewertung der Pluripotenz Potenzial sollte eingesetzt werden, um zu bestätigen vollständig umprogrammiert iPSC Linien lassen sich in drei Keimblätter differenzieren. Dies kann entweder durch Embryoidkörper (EB) die Bildung und Differenzierung Assay oder einem ter erreicht werdenatoma Bildungstest.

Ergebnisse

Meist Progenitorzellen aus menschlichem Urin isoliert sind positiv für uroepithelial Vorläufer und Perizyten Marker wie CD44, CD73 und CD146 (97,37%, 97,09% und 97,3% jeweils, Figur 1A und 1B). Diese Zellen exprimierten auch andere mesenchymalen Marker wie alpha-Aktin der glatten Muskulatur und Vimentin (1B). RT-PCR-Analyse zeugt von einer gemischten Population von Zellen in den Kulturen, daß es eine schwache Expression von Cytokeratin-7 (CK-7) und Uroplakin (UP) -Ia &a...

Diskussion

Modellierung von Herzkreislauferkrankungen mit iPS-Zellen entwickelt sich zu einem gemeinsamen Ansatz für den genetischen Beitrag ^4-6 zu verstehen. Einige unerwartete Schwierigkeiten, die einem Zellproben von Patienten, insbesondere junge Kinder, können, indem sie die Möglichkeit einer nichtinvasiven Ansatz wie einer Urinsammlung vermieden werden. In diesem jungen Patientengruppe ist es oft schwierig, eine Urinvolumen ausreichend zu sammeln, um genügend Zellen zur Reprogrammierung Urin ergeben. Coaching der j...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Materialien
>4 Oz. Probenbecher mit Deckel	STL Medical Supply	M9AMSAS340	für die Urinprobenentnahme
15 ml BD-Falcon Röhrchen	Fisher Scientific	352097
50 ml BD-Falcon Röhrchen	Fisher Scientific	352098
Runde Glasdeckgläser	Fisher Scientific	12-545-81
CytoTune-iPS Sendai Reprogrammierungskit	Life Technologies	A1378-001
PBS, pH 7,4	Life Technologies	10010-023
Pen-Strep ohne Glutamin	Life Technologies	15140-122	Warm bei 37 Grad C Wasserbad vor Gebrauch
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875-093	Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
B-27 Supplement mit Insulin (50x)	Life Technologies	17504-044	Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
B-27 Supplement ohne Insulin (50x)	Life Technologies	0050129SA	Warm in 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch
DMEM/F12 (1:1)	Life Technologies	11330-032	Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
Versene, 1:5.000	Life Technologies	15040066	Warm in 37 °; C Wasserbad vor Gebrauch
bFGF (10 & Mikro; g)	Life Technologies	13256-029	Warm in 37°; C Wasserbad vor Gebrauch
Cell Counter Cartridges	Life Technologies	C10228
Knockout Serum (500  ml Flasche)	Life Technologies	10828-028	Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies	12648-010
Keratinocyte-SFM (1x), Liquid	Life Technologies	17005-042	Warm in 37 &Grad; C Wasserbad vor Gebrauch
DMEM, hoher Glukosegehalt, Glutamax	Life Technologies	10566-016	Warm in 37 > C Wasserbad vor dem Gebrauch
Schinken's F-12 Nährstoffmischung	Life Technologies	11765-054	Warm in 37 ° C Wasserbad vor Gebrauch
EGF Rekombinantes humanes Protein, flüssige Form	Life Technologies	PHG0311L	Warm in 37 &°; C Wasserbad vor Gebrauch
Insulin, human rekombinant, Zink Soln	Life Technologies	12585-014	Warm in 37 °; C Wasserbad vor Gebrauch
TeSR-E8	Stem Cell Technologies	5940	Warm in 37 &°; C Wasserbad vor Gebrauch
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Selleck	S1049	Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
Matrigel	BD Biosciences	354277	hESC Qualified Matrix, LVED Free
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
iScript cDNA-Synthesekit	Bio-Rad	170-8890
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)	Thermo-Scientific	K1081
FBS-qualifiziert	Sigma Aldrich	F6178	Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
Adenin Bioreagenz	Sigma Aldrich	A2786-5G	Warm in 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch
Cholera Toxin aus Vibrio cholerae	Sigma Aldrich	C8052-.5MG	Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
Hydrocortison	Sigma Aldrich	H0888-1G	Warm in 37 °; C Wasserbad vor Gebrauch
Holo-Transferrin vom Menschen	Sigma Aldrich	T0665-50MG	Warm in 37 & Grad; C Wasserbad vor Gebrauch
3,3',5-Trijod-L-thyronin-Natriumsalz	Sigma Aldrich	T6397-100MG	Warm in 37 ° C Wasserbad vor dem Gebrauch
DAPI	Santa Cruz Biotechnology	SC-3598
Fluormount Aquous Einbettmedium	Sigma Aldrich	F4680
16% Paraformaldehyd	Alfa-Aesar	43368<
Maus anti CD44 - markiert mit FITC	BD Biosciences	560977
Maus anti CD146 - markiert mit PE	BD Biosciences	561013
Maus anti CD73 - markiert mit PE	BD Biosciences	561014
Maus anti-α-glatte Muskulatur Aktin	Sigma Aldrich	A2547
Maus anti-Vimentin	Abcam	ab8978-100
Maus anti - TRA-1-81	Life Technologies	411100
Kaninchen Anti Oct 3/4	Santa Cruz Biotechnology	SC-9081
Maus Anti Dystrophin	Leica Biosystems	NCL-DYSB