Dieses Protokoll beinhaltet detaillierte Verfahren zur Isolierung von Urinzellen von Muskeldystrophie-Patienten; ihre effiziente und schnelle Reprogrammierung durch Sendai-Virus-Transduktion.
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Methodenartikel
Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dystrophischen Kardiomyopathie ist eine schlecht verstanden Folge der Muskeldystrophie. Generieren von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Patienten mit Muskeldystrophie ist eine unschätzbare Quelle für zelluläre in vitro Krankheitsmodellsysteme und für Wirkstoff-Screening-Studien verwendet werden. Patienten stammenden Urinzellen in erfolgreiche Reprogrammierung in induzierte pluripotente Stammzellen, um dystrophischen Kardiomyopathie Muster 1 verwendet. Adressieren der Sicherheitsbedenken von integrierenden Vektor-Systeme, unter Verwendung eines nicht-integrierenden Sendai-Virus-Vektors für die Transduktion von Yamanaka Faktoren in den Urin-Zellen von Patienten mit Muskeldystrophie gesammelt präsentieren wir ein Protokoll. Dieses Protokoll erzeugt vollständig neu programmiert Klone innerhalb von 2-3 Wochen. Die pluripotenten Zellen sind vektorfreien Durchgang durch-13. Diese dystrophischen iPS-Zellen lassen sich in Herzmuskelzellen differenziert und entweder verwendet werden, um Krankheitsmechanismen und für Wirkstoff-Screening zu untersuchen.
Einleitung
Kardiomyopathie ist die zweithäufigste Todesursache bei Patienten mit Duchenne und Becker-Muskeldystrophie (MD). Obwohl Mutationen in dem X-verknüpften Dystrophin-Gen in 1 auftreten: 3,500 männlichen Neugeborenen, ist sehr wenig über die molekularen und zellulären Ereignisse, die zum fortschreitenden Herzmuskelschäden bekannt. Menschen induzierte pluripotente Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten stammen, wurden als neuartige Instrument, um die zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen zu studieren und für Wirkstoff-Screening 1,2 verwenden entstanden.
Die erwartete Beschwerden von Hautbiopsien oder Blutproben kann jungen Pa....
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Protokoll
HINWEIS: Die Patienten und / oder ihrer Erziehungsberechtigten sollten Einwilligung in einem Institutional Review Board teilzunehmen geben genehmigten Studie.
1. Puffer und Medien Vorbereitungen
- Waschpuffer: Zu 100 ml Waschpuffer vorbereiten, 1 ml der 100x Pen / Strep-Lösung (100 U / ml Penicillin + 100 ug / ml Streptomycin) und 99 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Urinary Vorläuferzellen Cell (UPC) Medium: Um UPC Medium herzustellen, mischen gleichen Volumina von Keratinozyten Serum Free (KSF) Medium + Vorläuferzellen Cell Medium.
- KSF Medium: Um Keratinozytenmedium vorzubereiten, fügen Sie 5 ng / ....
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Ergebnisse
Meist Progenitorzellen aus menschlichem Urin isoliert sind positiv für uroepithelial Vorläufer und Perizyten Marker wie CD44, CD73 und CD146 (97,37%, 97,09% und 97,3% jeweils, Figur 1A und 1B). Diese Zellen exprimierten auch andere mesenchymalen Marker wie alpha-Aktin der glatten Muskulatur und Vimentin (1B). RT-PCR-Analyse zeugt von einer gemischten Population von Zellen in den Kulturen, daß es eine schwache Expression von Cytokeratin-7 (CK-7) und Uroplakin (UP) -Ia &a.......
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Diskussion
Modellierung von Herzkreislauferkrankungen mit iPS-Zellen entwickelt sich zu einem gemeinsamen Ansatz für den genetischen Beitrag 4-6 zu verstehen. Einige unerwartete Schwierigkeiten, die einem Zellproben von Patienten, insbesondere junge Kinder, können, indem sie die Möglichkeit einer nichtinvasiven Ansatz wie einer Urinsammlung vermieden werden. In diesem jungen Patientengruppe ist es oft schwierig, eine Urinvolumen ausreichend zu sammeln, um genügend Zellen zur Reprogrammierung Urin ergeben. Coaching der j.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Entwicklung dieses Protokolls wurde von Advancing a Healthier Wisconsin und dem National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, durch die Fördernummer 8UL1TR000055 unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der NIH wieder.
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Materialien
Antikörper
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Materialien | |||
| >4 Oz. Probenbecher mit Deckel | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | für die Urinprobenentnahme |
| 15 ml BD-Falcon Röhrchen | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Röhrchen | Fisher Scientific | 352098 | |
| Runde Glasdeckgläser | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogrammierungskit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7,4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep ohne Glutamin | Life Technologies | 15140-122 | Warm bei 37 Grad C Wasserbad vor Gebrauch |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch |
| B-27 Supplement mit Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch |
| B-27 Supplement ohne Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch |
| Versene, 1:5.000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °; C Wasserbad vor Gebrauch |
| bFGF (10 & Mikro; g) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37°; C Wasserbad vor Gebrauch |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Flasche) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 &Grad; C Wasserbad vor Gebrauch |
| DMEM, hoher Glukosegehalt, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 > C Wasserbad vor dem Gebrauch |
| Schinken's F-12 Nährstoffmischung | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 ° C Wasserbad vor Gebrauch |
| EGF Rekombinantes humanes Protein, flüssige Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 &°; C Wasserbad vor Gebrauch |
| Insulin, human rekombinant, Zink Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °; C Wasserbad vor Gebrauch |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 &°; C Wasserbad vor Gebrauch |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA-Synthesekit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-qualifiziert | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch |
| Adenin Bioreagenz | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch |
| Cholera Toxin aus Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch |
| Hydrocortison | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °; C Wasserbad vor Gebrauch |
| Holo-Transferrin vom Menschen | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 & Grad; C Wasserbad vor Gebrauch |
| 3,3',5-Trijod-L-thyronin-Natriumsalz | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 ° C Wasserbad vor dem Gebrauch |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluormount Aquous Einbettmedium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyd | Alfa-Aesar | 43368< | |
| Maus anti CD44 - markiert mit FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Maus anti CD146 - markiert mit PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Maus anti CD73 - markiert mit PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Maus anti-α-glatte Muskulatur Aktin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Maus anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Maus anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Kaninchen Anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Maus Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
Referenzen
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
