Wir haben ein Modell für Lungenverletzungen von Mäusen durch intratracheale Injektion des Bakteriums Pseudomonas aeruginosa entwickelt. Dieses Modell ahmt Lungenschäden bei Lungenentzündungen nach und ist klinisch relevant.
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Methodenartikel
Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Um die menschliche akute Lungenschädigung oder Lungenentzündung zu untersuchen, ist es wichtig, Tiermodelle zu entwickeln, um verschiedene pathologische Merkmale dieser Krankheit zu imitieren. Hier haben wir eine Maus Lungenverletzung Modell durch intratracheale Injektion von Bakterien Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa oder PA) entwickelt. Mit diesem Modell konnten wir Lungenentzündung in der frühen Phase der Verletzung zeigen. Zusätzlich wurde Alveolarepithel- Sperr Undichtigkeit durch Analysieren bronchoalveoläre Lavage (BAL) beobachtet; und alveoläre Zelltod wurde durch TUNEL-Assay mit Gewebe aus verletzten Lunge vorbereitet beobachtet. Zu einem späteren Phase nach der Verletzung, beobachteten wir die Zellproliferation für den Reparaturvorgang erforderlich. Die Verletzung wurde von 7 Tagen ab der Einleitung des P. gelöst aeruginosa Injektion. Dieses Modell imitiert die sequentielle Verlauf Lungenentzündung, Verletzungen und Reparatur während einer Lungenentzündung. Diese klinisch relevanten Tiermodell eignet sich für das Studium der Pathologie, Mechanismus der Reparatur, fach akuter Lungenverletzung, und kann auch verwendet werden, um potentielle therapeutische Mittel für diese Krankheit zu testen.
Einleitung
Lungen Umweltkrankheitserreger ausgesetzt und sind anfällig für Entzündungen und Verletzungen 1-3. Während pathologischen Zuständen, wie Lungenentzündung oder Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS), Krankheitserreger sowie Entzündungsfaktoren von Leukozyten freigesetzt induzieren Verletzungen und Tod von Alveolarzellen 1-3. Es ist wichtig zu Tiermodellen von akutem Lungenversagen entwickeln, um die Untersuchung der Pathologie von Verletzungen sowie Mechanismus der Reparatur zu erleichtern.
Gegenwärtig sind die meisten Leute benutzen Hyperoxie und Bleomycin induzierten Mauslungenverletzung Modelle 4. Jedoch sind die Mechanismen der Hyperoxie Schädigung verursacht sind nicht die gleichen wie die häufigste Lungenverletzungen, die bei Lungenentzündung oder ARDS 5 auftreten. Bleomycin induzierte akute Verletzung ist selten im klinischen Kontext 4. Eine Maus Lungenverletzung Modell mit intratracheale Injektion von P. Hier berichten wir aeruginosa 6,7. Dieses Modell ist klinisch relevant, und ahmt die prozesse, die folgende Lungenentzündung 8 geschehen.
Als opportunistische, nosokomiale Erreger der immungeschwächten Personen, P. aeruginosa infiziert in der Regel die Lungenwege, der Harnwege, Verbrennungen, Wunden, und verursacht auch andere Blutinfektionen 6. Die Bakterien setzen Virulenzfaktor Exotoxin A, multiplizieren und lösen Immunreaktionen 6. Intra-trachael Verabreichung von P. aeruginosa spiegelt die Situation in der menschlichen Exposition gegenüber den Bakterien, die Lungenentzündung verursachen und die Pathologie ist wahrscheinlich anders als die vor kurzem berichtet, Influenza-Virus H1N1 induzierten Lungenschädigung Modell 9 zu sein. Da P. aeruginosa ist ein opportunistisches Pathogen, das relativ sicher im Vergleich zu einigen der virulenten Pathogenen handhaben ist. Hier verwendeten wir intratracheale Injektion, um die Bakterien zu verabreichen, weil wir festgestellt, dass dieses Verfahren eingeführt mehr Bakterien in den distalen Bereich der Alveolen der Lunge im Vergleich mitEinige andere Verfahren wie die Verwendung eines Katheters über den Mund.
Verglichen mit anderen akuten Lungenverletzung Modelle, die P. hier beschriebenen aeruginosa Modell eignet sich für das Studium Lungenschädigung durch Bakterien und durch übermäßige Entzündung induziert. Im Gegensatz zu anderen Tiermodellen, die P. verwenden aeruginosa Sepsis 10,11 induzieren, hier verwenden wir intratracheale Injektion dieser Bakterien, um lokalisierte akute Lungenschädigung zu induzieren.
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Protokoll
Die Tierversuche wurden von der Tierpflege Ausschuss und Institutional Biosafety Ausschüsse der Universität von Illinois in Chicago genehmigt.
HINWEIS: Maske, Augenschutz, Kleid oder Overall und Doppelhandschuhe: Alle Verfahren, die Pseudomonas sollte mit biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL2) Praktiken, die umfassen, sind aber nicht beschränkt durchgeführt werden. Arbeiten Sie in zertifizierten Sicherheitswerkbank. Gönnen Instrumente in Kontakt mit Bakterien mit Bleichmittel oder Chlordioxid Desinfektionsmittel. Verwenden Sie eine versiegelte Verpackung für den Transport Proben.
1. P. aeruginosa Kultur und Wachstum
- Shop P. aeruginosa PA103 als Bakterienbestand in einer Schraubkappe Kryoröhrchen bei -80 ° C.
- Legen Sie das Fläschchen in einem Rack in einem Kasten mit 70% Ethanol benetzt Papierhandtücher und zu ergreifen, um die biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL2) Labor.
- Streak die Bakterien auf Schafblut-Agar-Platten wachsen bei 37 ° C für ~ 15 Stunden in einem Inkubator.
- In einer BSL2- Haube, kratzen die Bakterien von der Platte mit Bakterien Schleife und resuspendieren in 5 ml PBS.
- Bewahren Sie die Lager bei 4 ° C für bis zu 3 Monate. Allerdings bestimmen die Titer alle 2 Wochen.
- Seriell zu verdünnen, die Bakterien in PBS (in der Regel von 1:10 4 bis 1:10 7) und die Platte des bekannten Verdünnung auf Schafblut-Agar-Platten.
- Inkubieren Sie die Platten für ~ 15 Std. Graf Kolonien und berechnen Colony Forming Unit (CFU) nach Bakterienkonzentration zu bestimmen.
- Resuspendieren der entsprechenden Konzentrationen (~ 5 x 10 3 KbE / ul) in 0,5 ml PBS in 1,5 ml steriler Schraubkappe Kryoröhrchen. Dichten Sie die Kryoröhrchen und legen Sie sie in einem Kryoröhrchen Rack auf Desinfektionsmittel beladene Papierhandtücher in einem Schnappdeckel-Box.
- Transportieren Sie das Kästchen, um BSL2- Tieranlage. Dort angekommen, öffnen Sie die Box in der BSL2- Schrank.
2. P. aeruginosa Instillation
- Führen Überleben Chirurgie aseptisch (sterile Handschuhe, sterile InstrumenteUnd aseptischer Techniken). Verwenden Sie eine sterile Abdeckung, eine Arbeitsfläche für sterile (autoklaviert) chirurgische Instrumente bereitzustellen. Sterilisieren Instrumente mit einer Heiß Perle Sterilisator zwischen jeder Instillation Verfahren.
- Wiegen Mäusen vor Betäubung. Mäuse anästhesiert mit Ketamin (100 mg / kg), Xylazin (5 mg / kg) in 0.1 - 0.2 ml PBS intraperitoneal (ip). Bestimmung der Wirksamkeit der Betäubung durch Nichtreaktionsfähigkeit auf Zehenklemm. Verwenden Sie einen Tierarzt Salbe auf die Augen bis zur Trockene unter Narkose zu verhindern.
- Rain Mäuse auf einer chirurgischen Bord in BSL2- Schrank.
- Identifizieren Sie den Bereich für den Schnitt nach unten. Rasur dieses Gebiet und bereiten die Haut mit Wechselstrom Alkohol und Povidoniod Tupfer 3 mal.
- Behandlung der Schnittbereich mit einem Lokalanästhetikum (Lidocain), da dies der Anästhesie ist ausreichend für eine kleinere chirurgische Eingriffe, wie einen Hautschnitt, um die Luftröhre gelangen.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 5 mm) an der Mittellinie des Halses, und benutzen stumpfe forceps sanft bewegen die Muskeln für den Zugriff auf die Luftröhre. Setzen Sie die Luftröhre durch chirurgische Dissektion.
- Zeichnen Bakterienlösung in eine 1 ml Einwegspritze mit 27 G-Nadel. Für jede Maus, verabreichen 20-30 ul Bakterien bei der entsprechenden Konzentration (bis zu 10 5 CFU je Maus).
- Setzen Sie die Nadel in die Luftröhre. Injizieren Lösung langsam in den Luftröhren.
- Stellen Sie sicher, dass die Tier keucht, die normalerweise an, dass Lösung in die Lunge erreicht.
- Schließen Sie die Wunde mit sterilem Nahtmaterial (6-0 Monofilament) unter aseptischen Bedingungen.
- Verwenden Sie 0,1 mg / kg Buprenorphin durch subkutane Injektion als post-op Analgesie zu postoperativen Schmerzen zu kontrollieren.
- Stellen Sie sicher, dass die Zeit von der ersten Narkoseeinleitung erforderlichen Schließung Schnitt weniger als 15 min.
- Nach der Injektion entsorgen Spritzen und Nadeln in einem geeigneten Biohazard Behälter für scharfe Gegenstände.
- Behandeln Sie die chirurgischen Instrumente mit Chlordioxid basierend DISInfectant für 15 min, spülen und zum Labor für die Sterilisation und Wiederverwendung wie nötig.
- Haus die Mäuse einzeln in saubere Käfige bei warmen Umgebung.
- Überprüfen Sie auf dem Tier alle 30 Minuten, bis er das Bewusstsein wiedererlangt und beginnt sich zu bewegen; und später in 12 Stunden Intervallen für die ersten 3 Tage nach der Operation.
- Halten die Mäuse in der Tier BSL2 Einrichtung während des Experiments. Stellen Sie sicher, dass nur in versiegelten Kiste enthaltene Gewebe verlässt das Tier BSL2- Möglichkeiten. Wenn die Mäuse exprimieren einem der moribund Verhaltensweisen (definiert als Atemnot, Lethargie, Versagen in Reaktion auf sanfte Stimulierung ambulate) an einem Punkt in der Studie euthanize die Mäuse durch CO 2 Inhalation aus einem Flaschenquelle gefolgt durch zervikale Dislokation.
- Euthanize die Versuchspersonen durch Ausbluten unter Narkose.
- Sammeln Lungengewebe von Mäusen getötet. Führen Sie diese Verfahren in einem BSL2 Kapuze. Falls erforderlich, überweisen Sie den Proben mit verschlossenen Röhrchen in einem rac platziertk on Desinfektions beladene Papierhandtücher in einem Schnappdeckel-Box für weitere Prozess.
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Ergebnisse
Ab 24 bis 72 Stunden nach P. aeruginosa Injektion erhöhte Zellularität wurde in Lungenschnitten beobachtet (1A-D). Die Lunge begonnen, von 96 Stunden nach der Verletzung (1E) erholen. 7 Tage nach P. aeruginosa, normalen Alveolen Morphologie wurde weitgehend wiederhergestellt (1F). Tunnel Färbung mit Lungenabschnitte bei 24 h nach P. vorbereitet aeruginosa zeigte Zelltod in Alveolen Zellen (1G-I). Um den Reparaturproze...
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Diskussion
Die Pseudomonas-Maus Lungenverletzung Modell, das wir beschreiben imitiert den gesamten Prozess der Entzündung, Lungenverletzung, Reparatur und Auflösung, die nach einer akuten Lungenschädigung oder Lungenentzündung auftreten. Es hat einzigartige Vorteile im Vergleich mit einigen anderen Verletzungen Modelle, dass es klinisch relevanten und relativ sicher und einfach zu handhaben.
Der kritische Schritt in dem Verfahren ist, dass die Injektion von Bakterienlösung muss sehr langsam. Wenn Einsp...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health HL105947-01 (YL), HL07829-16 (AM), HL090152 (AM) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anästhetikum: Ketamin, Xylazin, Lidocain, Buprenorphin | pharmazeutische Qualität | ||
| 27 G Nadel | Fisher | 1482648 | |
| Spritze | Fisher | 14823434 | 1 ml |
| Schere | Fine Science Werkzeuge | ||
| Zange | Fine Science Werkzeuge | ||
| Naht | Fisher | 19-037-526 | |
| Augenmessgerät, Handschuh, Kittel | |||
| Biosicherheitswerkbank | |||
| Desinfektionsmittel | Clidox | ||
| Schafblut-Agarplatten | Medex Versorgung | HL-1160 |
Referenzen
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