Methodenartikel

Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

DOI:

10.3791/52058

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2. Januar 2015

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1Abteilung Mikrobiologie, Fachbereich Biologie/Chemie, Universität Osnabrück

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Synthese und die Fluoreszenzmarkierung von Nanopartikeln (NPs). Die Nanopartikel wurden in Pulse-Chase-Experimenten angewandt, um die Endo-lysosomalen System von eukaryotischen Zellen zu kennzeichnen. Eine Manipulation der endo-lysosomalen System Aktivitäten des intrazellulären Pathogen Salmonella ente wurden von Live Cell Imaging und quantifizierte gefolgt.

Zusammenfassung

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Fluoreszierende Nanopartikel (NPs) mit wünschenswerten chemischen, optischen und mechanischen Eigenschaften sind versprechendsten Mittel, um intrazelluläre Organellen zu beschriften. Hier stellen wir ein Verfahren unter Verwendung von Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel, die endo-lysosomalen Systems eukaryontischer Zellen zu markieren und Manipulationen von Wirtszellwege zu überwachen, indem die intrazelluläre Pathogen Salmonella enterica. Die Nanopartikel wurden leicht durch HeLa-Zellen internalisiert und lokalisiert in späten Endosomen / Lysosomen. Salmonelleninfektion induzierte Umlagerung der Vesikel und Akkumulation von Nanopartikeln in Salmonella induzierten Membranstrukturen. Wir Einsatz der Imaris Softwarepaket für quantitative Analysen der konfokalen Mikroskopie Bilder. Die Anzahl der Objekte und ihre Größenverteilung in nicht-infizierten Zellen waren verschieden von denen in Salmonellen-infizierten Zellen, was eine überaus Umbau des endo-lysosomalen System WT Salmonellen.

Einleitung

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Fluoreszierende Nanopartikel (NPs), einschließlich Metall-Nanopartikel, Quantenpunkte, Polymer-Nanopartikel, Silica-Nanopartikel, Carbon Punkte usw., haben in den vergangenen Jahrzehnten 1,2 beträchtliche Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Im Vergleich zu herkömmlichen organischen Farbstoffen, fluoreszierenden Nanopartikeln zeigen wünschenswerte chemische, optische und mechanische Eigenschaften, wie starke Signalstärke, Resistenz gegen Ausbleichung und hohen Biokompatibilität 3,4. Diese Vorteile machen sie die Methode der Wahl für die intrazelluläre Erkundung und Live Cell Imaging. Darüber hinaus sind eine Vielzahl von elektronendichte Na....

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Protokoll

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1. Synthese von 10 nm Goldnanopartikel (Gold-Nanopartikel) 15

  1. Bereiten Lösung A: 2 ml 1% ige wässrige Goldchlorid in 160 ml Milli-Q oder doppelt destilliertes Wasser.
  2. Bereiten Lösung B: 8 ml 1% Trinatriumcitrat x 2 H 2 O und 160 ul 1% Gerbsäure in 32 ml Milli-Q oder doppelt destilliertes Wasser.
  3. Warm up-Lösung A und B auf 60 ° C und mischen sie unter Rühren. Beachten Sie eine dunkelblaue Farbe sofort. Beachten rot nach ca. 15 min. Dann heizen bis zu 95 ° C, 5 Minuten zu halten und die Lösung auf RT.
  4. Fügen Sie einen Tropfen des NP Suspension auf eine kohlenstoffbeschichteten Netz und lassen an der Luft tro....

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Ergebnisse

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Gold-Nanopartikel wurden durch ein gut etabliertes Verfahren durch Reduktion von Chlorwasserstoffsäure von Citrat und Gerbsäure erzeugt. Wie in 2A gezeigt, waren die synthetisierten NPs quasi-kugelförmiger Gestalt mit einer Größe von etwa 10 nm. BSA-Beschichtung und Rhodamin-Markierung nicht beeinflussen die Morphologie und Größe (2B).

Es wurde berichtet, dass die Gold-Nanopartikel können leicht von verschiedenen Säugerzellen aufgenommen und am Ende in den e.......

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Diskussion

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Die endo-lysosomalen System von Säugerzellen steuert wichtige physiologische Prozesse, einschließlich der Nahrungsaufnahme, Hormon-vermittelten Signaltransduktion, Immunüberwachung und Antigen-Präsentation 17. Bisher wurde eine Vielzahl von Markern für die Kennzeichnung von endocytischen und Tracking-Studien verwendet. Beispielsweise Lysotracker Sonden fluoreszierend acidotropic Sonden von Molecular Probes (Life Technologies, USA) zum Lysosom Kennzeichnung entwickelt, das sich selektiv anreichernde in zellulä.......

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft durch das Stipendium Z im Sonderforschungsbereich 944 'Physiologie und Dynamik zellulärer Mikrokompartimente' und HE1964/18 im Schwerpunktprogramm 1580.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
GoldchloridSigma-Aldrich520918
GerbsäureSigma-Aldrich403040
TrinatriumcitratSigmaC8532
RinderserumalbuminSigmaA2153
NHS-RhodaminPierce46406
DMSOSigmaD8418
HEPESSigmaH3375
GentamicinApplichemA1492
KanamcyinRothT832
CarbenicillinRoth6344
8-Well-Kammer-ObjektträgerIbidi80826Gewebekultur behandelt, steril
Imaris SoftwareBitplaneVersion 7.6verschiedene Konfigurationen verfügbar

Referenzen

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  1. Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
  2. Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

SalmonelleninfektionKonfokalmikroskopieGold BSA NanopartikelHeLa ZellenVesikel RemodellierungBildanalyseNanopartikel Markierung

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