Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models

Zusammenfassung

Hefeproteinopathie-Modelle sind wertvolle Werkzeuge, um die Toxizität und Aggregation von Proteinen zu bewerten, die an Krankheiten beteiligt sind. In dieser Arbeit stellen wir Methoden zum Screening von Hsp104-Variantenbibliotheken auf Toxizitätssuppressoren vor. Dieses Protokoll könnte so angepasst werden, dass jede Proteinbibliothek auf Toxizitätssuppressoren von Proteinen untersucht wird, die in Hefe toxisch sind.

Zusammenfassung

Viele Proteinfehlfaltungsstörungen können in der knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae modelliert werden. Proteine wie TDP-43 und FUS, die an der amyotrophen Lateralsklerose beteiligt sind, und α-Synuclein, das an der Parkinson-Krankheit beteiligt ist, sind toxisch und bilden zytoplasmatische Aggregate in Hefe. Diese Merkmale rekapitulieren Proteinpathologien, die bei Patienten mit diesen Erkrankungen beobachtet wurden. Daher ist Hefe eine ideale Plattform für die Isolierung von Toxizitätssuppressoren aus Bibliotheken von Proteinvarianten. Wir sind daran interessiert, Proteindisaggregase anzuwenden, um fehlgefaltete toxische Proteinkonformere zu eliminieren. Konkret entwickeln wir Hsp104, ein hexameres AAA+-Protein aus Hefe, das in einzigartiger Weise in der Lage ist, sowohl ungeordnete Aggregate als auch Amyloid zu lösen und die Proteine in ihre native Konformation zurückzuführen. Während Hsp104 in Eukaryoten und Eubakterien hoch konserviert ist, hat es kein bekanntes Metazoen-Homolog. Hsp104 hat nur eine begrenzte Fähigkeit, ungeordnete Aggregate und Amyloidfasern zu eliminieren, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind. Daher wollen wir Hsp104-Varianten entwickeln, um die Proteinfehlfaltung, die bei neurodegenerativen Erkrankungen eine Rolle spielt, rückgängig zu machen. Wir haben Methoden entwickelt, um große Bibliotheken von Hsp104-Varianten auf die Unterdrückung der Proteotoxizität in Hefe zu untersuchen. Da Hefen anfällig für eine spontane unspezifische Unterdrückung der Toxizität sind, wurde ein zweistufiges Screening-Verfahren entwickelt, um falsch positive Ergebnisse zu eliminieren. Mit diesen Methoden haben wir eine Reihe von potenzierten Hsp104-Varianten identifiziert, die die Toxizität und Aggregation von TDP-43, FUS und α-Synuclein stark unterdrücken. Hier beschreiben wir dieses optimierte Protokoll, das an Screening-Bibliotheken angepasst werden könnte, die mit einem beliebigen Proteinrückgrat erstellt wurden, um die Toxizität von Proteinen zu unterdrücken, die in Hefe toxisch sind.

Einleitung

Hefe proteinopathy Modelle wurden für Proteinfehlfaltung Störungen, einschließlich amyotropher Lateralsklerose (ALS) und Parkinson-Krankheit (PD) ^1-3 entwickelt. Expression der Proteine ​​TDP-43 und FUS, die in ALS-Patienten misfold, sind toxisch und mislocalize cytoplasmatischen Aggregaten in Hefe ^1,2 bilden. Ebenso Expression von α-Synuclein (α-syn), die in PD gebracht wird, ist toxisch und mislocalizes cytoplasmatischen Aggregaten in Hefe ³ zu bilden. Diese Merkmale rekapitulieren Phänotypen bei Patienten mit diesen Erkrankungen ^4,5. So, Hefe-Modelle bieten eine nützliche Plattform für das Screening für Proteine ​​oder k....

Protokoll

1. Herstellung von Bibliotheken

1. Um Bibliotheken von Hsp104 mit domänenspezifischen fehleranfällige PCR konstruieren zunächst verstärken die Domäne von Interesse mit einem fehleranfälligen DNA-Polymerase ^20.
2. Reinige den PCR-Produkt durch Gel-Extraktion.
3. Führen Megaprimer-Extensionsschritt unter Verwendung einer Standardortsgerichtete Mutagenese-Protokoll: Kombinieren 50 ng Templat-Plasmid, 250 ng Megaprimer, 200 uM dNTPs und High-Fidelity-DNA-Polymerase in PCR-Puffer, und mit Wasser auf 50 & mgr; l Gesamtvolumen mit PCR-Wasser ²⁰ . Führen Sie einen Standard-PCR-Programm.
   HINWEIS: Spezifische Primer verwendet ....

Ergebnisse

Wir haben eine Bibliothek von Hsp104 Varianten in der Mitteldomäne randomisiert konstruiert und gesiebt es zur Unterdrückung von TDP-43 Toxizität. Die Bibliothek wurde transformiert und auf Glucose und Galactose-Platten (2) überzogen, um die Stringenz der Bildschirm zu bewerten. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und die Stämme wurden Zähler mit 5-FOA die Hsp104 Plasmid beseitigen ausgewählt. Diese Stämme wurden dann bewertet, diese Toxizität zu bestätigen war auf TDP-43 allein, ohne den Hsp104 Variant.......

Diskussion

Hier präsentieren wir unseren Ansatz zur Isolierung potenziert Hsp104-Varianten, die die Toxizität von krankheitsassoziierten Substraten unter Verwendung von Hefe proteinopathy Modelle zu unterdrücken. Mit diesem Ansatz können große Bibliotheken von Varianten im Hochdurchsatz untersucht werden, wobei die einzige Einschränkung ist die Anzahl der Varianten, die das 5-FOA sekundären Sieb passieren. Durch Durchführen dieser Schritte in 96-Well-Format, routinemäßig auf die wir bis zu 200 Zugriffe zu einem Zeitpunkt in der 5-.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150 mm Petrischalen	Falcon	351058
5-Fluorosäure	Forschungsprodukte International	f10501-5.0
96-DeepWell 2 ml Platten	Eppendorf	0030 502.302
96 fettes Replikator-Werkzeug	V& P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200