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Methodenartikel

Synthese von Immunotargeted Magneto-Plasmonen Nanocluster

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DOI:

10.3791/52090

⸱

22. August 2014

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin, 2Department of Imaging Physics, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Synthese von magneto-Plasmonen-Nanopartikel mit einem starken magnetischen Moments und einer starken Nah-Infrarot (NIR)-Absorption. Das Protokoll schließt auch Antikörper-Konjugation in den Nanopartikeln durch die Fc-Teil für verschiedene biomedizinische Anwendungen, die Molekular spezifisches Targeting erforderlich.

Zusammenfassung

Magnetische und plasmonischer Eigenschaften in einem einzigen Nanopartikel kombiniert eine Synergie, die vorteilhaft in einer Reihe von biomedizinischen Anwendungen, einschließlich Kontrastverstärkung in neuartigen magnetoBildgebungsModalitäten, gleichzeitige Erfassung und Detektion von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) und multimodaler Molekularabbildungs ​​Kombination mit photothermische Therapie von Krebszellen. Diese Anwendungen haben großes Interesse an der Entwicklung von Protokollen für die Synthese von magneto-Plasmonen-Nanopartikel mit einer optischen Absorption im nahen Infrarotbereich (NIR) und ein starkes magnetisches Moment stimuliert. Hier stellen wir ein neues Protokoll für die Herstellung dieser Hybrid Nanopartikel, die auf einer Öl-in-Wasser-Mikroemulsionsverfahren basiert. Die Besonderheit des hier beschriebenen Protokoll ist die Synthese von magneto-Plasmonen-Nanopartikel in verschiedenen Größen von der Grundbausteine, die auch magneto-plasmonischen Eigenschaften. Dieser Ansatz führt zu Nanopartikeln mit einem hohen Höhlesität von magnetischen und plasmonischen Funktionalitäten, die gleichmäßig in der Nanopartikel-Volumen verteilt sind. Die Hybrid-Nanopartikel können durch Anbringen Antikörper durch den Fc-Teil Verlassen der Fab-Teil, der für die Antigenbindung für die Ausrichtung verantwortlich ist verfügbar funktionalisiert werden.

Einleitung

Hybrid-Nanopartikeln, die aus unterschiedlichen Materialien mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften können neue Möglichkeiten in der biomedizinischen Anwendungen, einschließlich des multimodalen molekularen Bildgebung, Therapieabgabe und Überwachung, neue Früherkennungstest 1-3 öffnen. Die Kombination von Plasmonen und magnetischen Eigenschaften in einem einzigen Nanopartikel ist von besonderem Interesse, da sie eine sehr starke Lichtstreuung und Absorptionsquerschnitte mit Plasmonenresonanzen und Reaktionsfähigkeit auf ein Magnetfeld verbunden. So wurden beispielsweise magneto-Plasmonen-Nanopartikeln verwendet werden, um den Kontrast in Dunkelfeldabbildung der markierten Zellen durch Anwenden eines zeitlichen Signalmodulation durch einen externen Elektromagneten 3-5 zu erhöhen. Magneto-photoakustische Bildgebung, wo magneto-Plasmonen-Nanopartikel ermöglichen große Verbesserungen in Kontrast und Signal-zu-Hintergrund Ratte - Vor kurzem wurde ein ähnliches Prinzip in der Entwicklung eines neuen bildgebenden Verfahren angewendetio 6,7. Es wurde auch gezeigt, dass die Hybrid-Nanopartikel können zur gleichzeitigen Aufnahme und Detektion von zirkulierenden Tumorzellen im Vollblut und in vivo 8,9 verwendet werden. Weiterhin sind magneto-Plasmonen-Nanopartikel verspricht theranostic Mittel, die für die molekulare spezifischen optischen und MR-Bildgebung in Verbindung mit photothermische Therapie von Krebszellen 10 verwendet werden kann.

Verschiedene Ansätze wurden für die Synthese von magneto-Plasmonen-Nanopartikel untersucht. B. Yu et al. Verwendet Zersetzung und Oxidation von Fe (CO) 5 auf Gold-Nanopartikel zu hantelartigen bifunktionellen Au-Fe 3 O 4-Nanopartikel 11 bilden. Wang et al., Gold beschichteten Eisenoxid-Nanopartikel unter Verwendung von thermischen Zersetzungsverfahren 12 synthetisiert. Einige andere Ansätze beruhen auf Beschichtungspolymer oder Amin-funktionellen Moleküle auf Magnetkern-Nanopartikel, gefolgt von Abscheiden von Agalte Schale auf die Polymeroberfläche zu erstellen, um das Hybridpartikel 7,13. Ferner wurden Eisen-Nanopartikeln, Gold-Nanostäbchen über elektrostatische Wechselwirkung oder eine chemische Reaktion 14,15 befestigt. Obwohl diese Ansätze ergeben magneto-Plasmonen-Nanostrukturen, in gewissem Umfang Eigenschaften des magneto-Plasmonen Kombination beeinträchtigen, wie optische Absorption im nahen Infrarot (NIR)-Fenster oder ein starkes magnetisches Moment von denen beide in biomedizinischen Anwendungen höchst wünschenswert sind. Beispielsweise hantel Au-Fe 3 O 4-Nanopartikel eine Plasmonresonanz-Peak bei 520 nm, die ihre Nützlichkeit in vivo durch eine hohe Gewebe Trübung in diesem Spektralbereich begrenzt. Weiterhin werden die von Current Protocols magneto-Plasmonen-Nanopartikel nur eine 11 oder weniger (weniger als 10) 14,15 superparamagnetischen Anteile (beispielsweise Eisenoxid-Nanoteilchen) begrenzt, der deutlich kleiner als sein könnte ACH istin einer dicht gepackten Nanostruktur ieved. Zum Beispiel kann ein dicht gepacktes 60 nm Durchmesser sphärische Nanopartikel in der Größenordnung von eintausend 6 nm superparamagnetische Nanopartikel enthalten. Daher besteht ein großer Raum für Verbesserung der magnetischen Eigenschaften der Hybrid-Nanopartikel. Darüber hinaus sind einige der zuvor beschriebenen Protokolle relativ komplex und erfordern eine sorgfältige Optimierung, um Partikelaggregation während der Synthese 14,15 vermeiden.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Synthese von magneto-Plasmonen-Nanopartikel mit einem starken magnetischen Moment und eine starke NIR-Absorption, die wesentliche Einschränkungen der aktuellen Kunst befasst. Die Synthese hat ihren Ursprung in Öl-in-Wasser-Mikroemulsion Verfahren 16. Es wird bei der Montage von Nanopartikeln mit einer gewünschten Größe aus einem viel kleineren Primärpartikel. Dieser Ansatz wurde erfolgreich auf Nanostrukturen aus einem einzigen Material wie Gold, Eisenoxid und Halbleiter pri produzierenmary Partikel 16. Wir erweitern es zur Synthese von magneto-Plasmonen-Nanopartikeln durch, erstens, dass 6 nm Durchmesser Goldhülle / Eisenoxid-Kernteilchen, und dann wird die Montage der primären Hybrid-Partikel in der endgültigen kugelförmigen Nanostruktur. Zusammenbau Primärpartikel in Nanoclustern ermöglicht nicht nur die Verbesserung der Eigenschaften der Nanopartikel Bestandteil, wie die stärkere magnetische Moment Beibehaltung superparamagnetischen Eigenschaften, sondern nutzt auch die Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Nanopartikeln somit neue Merkmale fehlen Bestand Nanopartikel wie stark optische Absorption im NIR-Fenster. Dieses Protokoll liefert Hybrid-Nanopartikel mit einer hohen Dichte von magnetischen und plasmonischer Funktionalitäten. Nach Primärpartikel synthetisiert werden, ist unser Verfahren im wesentlichen eine einfache Ein-Topf-Reaktion. Die Gesamtplasmonresonanz Festigkeit und magnetische Moment durch eine Anzahl von Primärpartikeln und ther bestimmtevor, kann leicht optimiert werden, je nach Anwendung. Darüber hinaus haben wir auch ein Verfahren zur Antikörper-Konjugation entwickelt, um die Hybrid-Nanopartikeln für verschiedene biomedizinische Anwendungen, die molekularen spezifisches Targeting erfordern. Antikörper werden durch den Fc-Teil Verlassen der Fab-Teil, der für die Antigenbindung für die Ausrichtung verantwortlich ist verfügbar angebracht.

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Protokoll

1. Messgeraete, Glaswaren Herstellung

  1. Geeignete Schutzausrüstung, dh, einen Laborkittel, Einweghandschuhe und Augenschutz tragen.
  2. Anschluss eines Rundkolben mit einem Kondensator und tauchen in einem Siliconöl mit einer Temperatur-Überwachung durch ein Thermometer. Legen Sie eine Wärmequelle (zB Hitzeschild) unter dem Ölbad (Abbildung 1). Verwenden Sie ein Thermometer zur Messung der Temperatur von mehr als 260 ° C ist.

2. Synthese von primären Hybrid Magneto-Plasmonen-Nanopartikel

  1. Herstellung von magnetischen Kern-Nanopartikel
    1. Hinzufügen 353,2 mg (1 mmol) Eisen (III)-acetylacetonat, 1 ml (2 mmol) Ölsäure, 1 ml (2 mmol) Oleylamin, 1,292 g (5 mmol) 1,2-Hexadecandiol und 10 ml Phenylether in einen Rund -bottom Kolben.
    2. Rühren Sie die Mischung kräftig mit einem Magnetrührstab und Wärme auf 250-260 ° C für 1 h unter Rückfluss. Dann warten, bis die Lösung abkühlenauf RT. Sicherzustellen, dass die Temperatur unter 260 ° C bis Siedetemperatur des Phenylether verhindern und ein Platzen der Reaktionsmischung aus dem Rundkolben in den Kondensator.
      ACHTUNG: Die Reaktionsmischung wird extrem heiß und die Chemikalien kann zu Reizungen führen. Muss unter einem Abzug arbeiten und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung. Für ausreichende Belüftung sorgen für die Öl-Bad.
      Hinweis: Das Ölbad bei 250-260 ° C Temperatur für 1 h bei der Synthese der magnetischen Nanopartikel gehalten. Im Prinzip kann ein Pyrex-Glasschale für diesen Zweck verwendet werden. , Die maximale Dauertemperatur für Pyrex Glas ist jedoch ~ 260 ° C laut Herstellerangabe. Daher stellt ein Metallbehälter eine sicherere Option für die Reaktion, da sie eine höhere Temperatur aushalten und länger in mehreren Läufen kann.
  2. Abscheidung einer Goldschale auf Magnetkern-Nanopartikel
    1. 411,5 mg hinzufügen (1,1 mmol) gold-AssTate, 0.25 ml (0.75 mmol) Ölsäure, 1,5 ml (3,0 mmol) Oleylamin, 775,3 mg (3 mmol) 1,2-Hexadecandiol und 15 ml Phenylether in einen Rundkolben gegeben.
    2. 5 ml Suspension von magnetischen Nanopartikeln aus Schritt 2.1. Das Reaktionsgemisch auf 180 ° C und halten unter Rückfluss für 1 Stunde. Warten, bis die Lösung auf RT abkühlen.
    3. 50 ml Ethanol zu der primären Hybrid-Nanopartikel, gefolgt von einer Zentrifugation bei 3.250 × g für 15 min ausgefällt.
    4. Resuspendieren den Niederschlag in 25 ml Hexan mit Hilfe eines Ultraschallbad. 25 ml Ethanol, um die primären Hybrid-Nanopartikeln ausfällt. Zentrifuge bei 3.250 g für 15 min und Resuspendieren des Niederschlags in Hexan. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
    5. Trocknen Sie die gefällte Grund Hybrid-Nanopartikeln im Vakuumtrockenschrank O / N. Bestätigen Sie, dass die Partikel vollständig trocken sind.

3. Hybrid Magneto-Plasmonen Nanocluster Synthese und Größentrennung

  1. Resuspendieren 5 mg Trockenprimär Hybrid-Nanopartikeln in 1 ml Hexan mit Hilfe eines Ultraschallbad. Beschallen die Nanopartikel-Suspension, bis kein sichtbarer Niederschlag vorhanden ist.
  2. Zugeben der Lösung aus Schritt 3.1 zu 10 ml wässrige Lösung von Natriumdodecylsulfat (2,8 mg / ml) in einem 20 ml Glasröhrchen mit Kappen angebracht. Fügen Sie die Aussetzung der primären Hybridnanopartikeln Tropfen für Tropfen zu vermeiden Mischen der beiden Phasen vor dem nächsten Schritt.
  3. Beschallen die zweiphasige Lösung in einem Ultraschallbad für 2 h, gefolgt von Erhitzen in einem Wasserbad bei 80 ° C für 10 min. Warten, bis die Lösung auf RT abkühlen.
    1. Füllen Sie Wasser in die Arbeitsebene der Linie Ultraschallbad. Zentrieren Sie die Glasflasche in der Ultraschallbad. Eine Emulsion bildet sich sofort zwischen den beiden Phasen. Schütteln Sie die Zwei-Phasen-Lösung mit der Hand nach Beginn der Ultraschallbehandlung; dies erleichtert das Mischen zwischen der Phase, die primäre Hybrid-Nanopartikeln und der unteren wässrigen Phase.
      Hinweis: Beachten Sie that der Ultraschallgerät erwärmt sich nach 2 Stunden Betrieb.
  4. Zentrifugieren Sie die Hybrid-Nanocluster Suspension bei 100 g für 30 min. Sammeln sowohl des Präzipitats und des Überstandes. Resuspendieren Niederschlag in 0,1 mM Natriumcitrat unter 10 min Beschallung. Die erwartete Größe der Nanocluster beträgt ~ 180 nm im Durchmesser.
  5. Den Überstand aus Schritt 3.3 auf einen neuen konischen Röhrchen.
  6. Zentrifugieren der Suspension aus Schritt 3.4 bei 400 × g für 30 min. Sammeln sowohl des Präzipitats und des Überstandes. Resuspendieren Niederschlag in 0,1 mM Natriumcitrat unter 10 min Beschallung. Die erwartete Größe der Nanocluster beträgt ~ 130 nm im Durchmesser.
  7. Den Überstand aus Schritt 3.5 auf einen neuen konischen Röhrchen.
  8. Zentrifugieren der Suspension aus Schritt 3.6 bei 1.500 xg für 30 min. Den Niederschlag und resuspendieren in 0,1 mM Natriumcitrat unter 10 min Beschallung. Die erwartete Größe der Nanocluster ist ~ 90 nm Durchmesser.
  9. Geben Sie 300 _6, l-Nanocluster Suspension zu einer 96-Well-Mikrotiterplatten-Lesegerät zum Messen einer UV-VIS-NIR-Absorptionsspektrum. Fallen 10 ul Nanocluster Suspension auf Kohlenstoff beschichteten Kupfernetz für TEM-Aufnahmen.

4. Konjugation von monoklonalen Antikörpern gegen Nanocluster

  1. Planen 100 ul monoklonaler Antikörperlösung (1 mg / ml) in PBS, pH 7,2, beispielsweise Anti-Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2)-Antikörper oder Anti-Epidermal Growth Factor Receptor 1 (EGFR)-Antikörper.
  2. Fügen Sie die Antikörperlösung aus Schritt 4,1 bis 3,9 ml 4 mM HEPES, pH 7,2. Zentrifuge die Lösung durch einen 10 K MWCO Filterzentrifuge bei 3.250 · g für 20 min bei 8 ° C hat. Resuspendieren des Antikörpers in 4 mM HEPES, pH 7,2, auf ein Endvolumen von 100 ul.
    HINWEIS: Dieser Schritt wird ausgeführt, um das Originalmedium in der Antikörper-Lösung mit HEPES ersetzen.
  3. Werden 10 ul 100 mM NaIO 4 bis 100 ul der Antikörperlösung. Decken Sie die Reaktionsgefäß mit einem Al-uminum Folie bei RT und mischen für 30 min mit einem Orbitalschüttler.
  4. Die Reaktion wird durch Zugabe von 500 ul 1x PBS.
  5. Add 2 ul 46,5 mM Linkerlösung (dithiolaromatic PEG6-CONHNH 2) zu der Antikörperlösung aus Schritt 4.4 und Schütteln für 1 h bei RT.
  6. Die Lösung wird unter Verwendung eines 10 k MWCO-Filter-Zentrifuge bei 3.250 × g für 20 min bei 8 ° C hat. Resuspendieren Antikörper in 1 × PBS auf ein Endvolumen von 100 ul, die zu einer Antikörperkonzentration von ~ 1 mg / ml führt.
  7. Mischungs 100 ul Nanocluster Suspension bei OD ~ 1,0 mit 1 ul modifizierter Antikörper aus Schritt 4.6 (1 mg / ml) für 120 min bei RT.
  8. Fügen Sie 10 ul 10 -3 M 5 kDa PEG Thiol und schütteln für 15 min bei RT.
  9. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 830 x g für 3 min. Überstand verwerfen und das Sediment resuspendieren in 100 ul 2% w / v 5 kDa PEG in PBS, pH 7,2.
  10. Messen Sie das Absorptionsspektrum der antikörperkonjugierten Nanocluster und vergleichen zu ter Absorptionsspektrum des nackten Nanocluster. Erwarten Sie ein paar Nanometer-Rotverschiebung nach der Konjugation.
  11. Wenn die Nanopartikel Aggregat durch eine deutliche Verschiebung zu einem Anstieg der OD im Bereich rot-NIR gezeigt, erhöhen die Konzentration der Thiol-PEG bis 5 x 10 -3 M. Auch erhöhen die Inkubationszeit mit Thiol PEG bis 30 min und eine Verringerung der Schleuderdrehzahl in 200 × g-Schritten.
  12. Für die Krebszellmarkierung Test, fügen Sie die Antikörper konjugiert Nanopartikel aus Schritt 4,9 bis Krebszellsuspension in entweder Medium oder 1x PBS (1 ml ~ 10 6 Zellen) zugeben und 60 min.

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Ergebnisse

Ein Schema für die Synthese von immunotargeted magneto-Plasmonen-Nanocluster in Figur 2 gezeigt. Zuerst werden die magnetischen Fe 3 O 4 Eisenoxid-Nanopartikel durch thermische Zersetzungsverfahren synthetisiert. Dann wird eine dünne ca. 1 nm Gold-Schale an den Eisenoxidkern Teilchen durch thermische Zersetzung abgeschieden. Die primären ca. 6 nm Hybrid-Nanopartikel dienen als Saatgut zu magneto-plasmonischen Nanocluster durch den Einsatz einer Öl-in-Wasser-Mikroe...

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Diskussion

Kritische Schritte in der erfolgreichen Synthese von magneto-plasmonischen Nanocluster gehört es, hoch monodispersen primären Gold-Schale / Eisenoxid-Kern-Nanopartikel und Leitung der Selbstorganisation der Primärpartikel in Nanocluster. Das Molverhältnis zwischen den Primärteilchen und Tenside spielen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Größenverteilung der Nanocluster. Ungleichmäßige Größenverteilung der primären Nanopartikel können die Bildung von großen Aggregaten während der Montage der magneto-plasmonischen...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde zum Teil durch die NIH Zuschüsse R01 R01 CA103830 EB008101 und unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PYREX 50 ml Siedekolben mit rundem Boden mit kurzem Hals & 24/40 [ST] GelenkCorning4320A-50Thermische Zersetzungsreaktion
PYREX 41 x 300 mm 5-bulbiger Allihn Kondensator mit 24/40 [ST] Außen-/InnenverbindungenCorning2480-300Thermische Zersetzungsreaktion
SilikonölFisherS159-500Ölbad
HeizplattenrührerCorningPC-351Erhitzen Sie die Reakton mit Rührfunktion
ThermometerThermoWorks221-092Temperatur messen
Eisen(III)-acetylacetonatFisherAC11913-0250Material für die Synthese primärer Hybrid-Nanopartikel
Ölsäure 99%FisherA195-500Material für die Synthese von primären Hybrid-Nanopartikeln
Gold(III)-acetatFisherAA3974206Material für die Synthese von primären Hybrid-Nanopartikeln
HexanFisherH292-1Material für die Synthese von primären Hybrid-Nanopartikeln
Phenylether 99%FisherAC13060-0025Material für die Synthese von primären Hybrid-Nanopartikeln
1,2-Hexadecandiol 90%Sigma213748-50GMaterial für die Synthese
von primären Hybrid-NanopartikelnOleylamin 70%SigmaO7805-100GMaterial für die Synthese primärer Hybrid-Nanopartikel
NatriumdodecylsulfatFisherBP166-100Clustersynthese
NatriumcitratdihydratSigmaW302600Clustersynthese
Monoklonaler Anti-EGF-Rezeptor-AntikörperSigmaE2156Spezifitätstest für die Zellmarkierung
Monoklonaler Anti-HER2 AntikörperSigmaAMAB90627Spezifitätstest für die Zellmarkierung
NatriumperiodatSigma311448oxidieren Fc-Region von Antikörpern
Dithiolaromatisch PEG6-CONHNH2SensoPath TechnologiesSPT-0014BHeterofunktioneller Linker für die Antikörperkonjugation an Nanocluster
Methoxy-PEG-thiol, 5 kCreative PEGworksPLS-604Passivierung der verbleibenden Goldoberfläche nach der Antikörperkonjugation
Amicon Ultra-4 Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-10-MembranMilliporeUFC801008Proteinaufreinigung
HEPESSigmaH3375Puffer
PBS, 1x LösungFisherBP2438-20Puffer
UV-Vis SpektroskopieBioTek Synergy HTObtain
Spectrum CentrifugeEppendorf5810RSeparation
Transmission ElektronenmikroskopFEITECNAI G2 F20 X-TWINMorphologie von Nanostrukturen Aufrechtes
MikroskopLeicaDM6000Dunkelfeldbilder erhalten
UltraschallgerätBranson1510Beschallung
Kohlenstofffilm 300 mesh GitterEMSCF300-CuTEM-Bildgebung
96-Well-PlatteCorning09-761-145UV-Vis-Leseplatte

Referenzen

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