Methodenartikel

Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse

DOI:

10.3791/52104

⸱

11. November 2014

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center, The University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at Houston

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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RNA-Sequenzierung und Bioinformatik-Analysen wurden verwendet, um deutlich und differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren in Lin-CD34 + und Lin-CD34- Subpopulationen von Maus EMLcells identifizieren. Diese Transkriptionsfaktoren könnten eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Wechsel zwischen Selbsterneuerung Lin-CD34 + und teilweise differenziert Lin-CD34- Zellen spielen.

Zusammenfassung

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Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) werden klinisch zur Behandlung Transplantation verwendet, um blutbildende System des Patienten in vielen Krankheiten, wie Leukämie und Lymphom aufzubauen. Aufklärung der Mechanismen, die HSK Selbsterneuerung und Differenzierung ist wichtig, für die Anwendung der HSK für Forschung und klinische Anwendungen. Jedoch ist es nicht möglich, große Mengen von HSZ erhalten aufgrund ihrer Unfähigkeit, in vitro zu proliferieren. Um diese Hürde zu überwinden, verwendeten wir eine Knochenmark der Maus abgeleitete Zelllinie, die EML (Erythroid, myeloische und lymphatische) Zelllinie, als Modellsystem für diese Studie.

RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) wurde zunehmend zur Microarray für Genexpressionsstudien zu ersetzen. Wir berichten hier über eine detaillierte Verfahren zur Verwendung von RNA-Seq-Technologie, um die potenziellen Schlüsselfaktoren bei der Regulation der EML Zellselbsterneuerung und Differenzierung zu untersuchen. Die in diesem Papier Protokoll ist in drei Teile unterteilt. Das erste Part erklärt, wie man Kultur EML Zellen und separaten Lin-CD34 + und Lin-CD34- Zellen. Der zweite Teil des Protokolls bietet detaillierte Verfahren für Gesamt-RNA Vorbereitung und die anschließende Konstruktion der Bibliothek für Hochdurchsatz-Sequenzierung. Der letzte Teil beschreibt die Methode für die RNA-Seq Datenanalyse und erklärt, wie die Daten verwenden, um differentiell exprimierte Transkriptionsfaktoren zwischen Lin-CD34 + und Lin-CD34- Zellen zu identifizieren. Die signifikant differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren wurden identifiziert, um die potenziellen Schlüsselregulatoren steuern EML Zellselbsterneuerung und Differenzierung. Im Diskussionsteil dieser Arbeit unterstreichen wir die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Entwicklung dieses Experiments.

Dieses Papier Zusammengefasst bietet ein Verfahren zur Verwendung von RNA-Seq-Technologie, um potentielle Regulatoren der Selbsterneuerung und Differenzierung in EML-Zellen zu identifizieren. Die Schlüsselfaktoren identifiziert werden, um nachgeschaltete Funktionsanalyse in vitro und i unterzogenn vivo.

Einleitung

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Hämatopoetische Stammzellen sind selten Blutzellen, die vor allem in der Knochenmark Erwachsener Nische befinden. Sie sind für die Produktion von Zellen erforderlich ist, um das Blut wieder aufzufüllen und das Immunsystem 1 verantwortlich. Als eine Art von Stammzellen, HSK sind in der Lage, sowohl die Selbsterneuerung und Differenzierung. Erforschung von Prozessen, die das Schicksal Entscheidung des HSK zu steuern, entweder in Richtung Selbsterneuerung oder Differenzierung, werden wertvolle Hinweise auf die Manipulation von HSCs für Blutkrankheit Forschungen und klinische Nutzung 2 bieten. Ein Problem von den Forschern konfrontiert ist, dass HSCs aufrechterhalten und in vitro in einem sehr begrenzten Ausmaß erweitert werden; die überwiegende Mehrheit ihrer Nachkommen sind teilweise in der Kultur 2 differenziert.

Um Schlüsselregulatoren, die die Prozesse der Selbsterneuerung und Differenzierung in einer genomweiten Maßstab steuern zu identifizieren, haben wir eine Maus primitiven hämatopoetischen Vorläuferzelllinie EML als Modellsystem. Thwird Zelllinie wurde von murinen Knochenmark 3,4 abgeleitet. Wenn mit verschiedenen Wachstumsfaktoren zugeführt wird, kann EML Zellen in erythroiden, myeloiden und lymphoiden Zellen in vitro 5 unterscheiden. Wichtig ist, dass diese Zelllinie in großer Menge in Kulturmedium, das Stammzellfaktor (SCF) und Beibehaltung ihrer multipotentiality vermehrt werden. EML Zellen in Subpopulationen von sich selbst erneuernden Lin-SCA + CD34 + getrennt und teilweise differenziert Lin-SCA-CD34- Zellen auf Oberflächenmarker CD34 und SCA 6. Ähnlich wie bei kurzfristigen HSCs, SCA + CD34 + Zellen sind in der Lage sich selbst zu erneuern. Wenn sie mit SCF, Lin-SCA + CD34 + Zellen, behandelt schnell regenerieren einer gemischten Population von Lin-SCA + CD34 + und Lin-SCA-CD34- Zellen und weiter zu vermehren 6. Die beiden Populationen ähnliche Morphologie und haben ähnliche Niveaus der c-kit-mRNA und Protein-6. Lin-SCA-CD34- Zellen können Vermehrungsmedium, das IL-3 anstelle von SCF 3. Unveiling die Schlüsselregulatoren in der EML Zellschicksal Entscheidung besseres Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen in frühen Entwicklungs Übergang während der Hämatopoese bieten.

Um die zugrunde liegenden molekularen Unterschiede zwischen den sich selbst erneuernden Lin-SCA + CD34 + und teilweise differenziert Lin-SCA-CD34- Zellen zu untersuchen, RNA-Seq wir differentiell exprimierte Gene zu identifizieren. Insbesondere konzentrieren wir uns auf Transkriptionsfaktoren, wie Transkriptionsfaktoren sind entscheidend bei der Bestimmung des Zellschicksals. RNA-Seq ist eine kürzlich entwickelte Ansatz, der die Fähigkeiten der nächsten Generation Sequenzierung verwendet (NGS) -Technologien zum Profil und zu quantifizieren RNAs aus Genom 7,8 transkribiert. Kurz, Gesamt-RNA poly-A ausgewählt und fragmentiert wie die anfängliche template.The RNA-Matrize wird dann in cDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase umgewandelt. Um Volllängen-RNA-Transkripte der Karte unter Verwendung intakter, nicht abgebauter RNA zur Konstruktion von cDNA-Bibliothek ist wichtig. Für die purHaltung der Sequenzierung werden spezifische Adaptersequenzen an beiden Enden der cDNA addiert. Dann wird in den meisten Fällen, cDNA-Moleküle werden durch PCR amplifiziert und in einem Hochdurchsatz Weise sequenziert.

Nach der Sequenzierung, liest der resultiert, kann zu einem Referenzgenom und Transkriptom-Datenbank ausgerichtet werden. Die Anzahl der Lesevorgänge, die Karte an die Referenz-Gen wird gezählt, und diese Information kann verwendet werden, um die Genexpression Pegel abzuschätzen. Das liest kann auch zusammengebaut werden de novo ohne Referenzgenom, so dass das Studium der Transkriptomen in Nicht-Modellorganismen 9. RNA-seq Technik wurde auch verwendet, um Spleiß-Isoformen 10-12, neuer Transkripte 13 und Genfusionen 14 erfassen. Zusätzlich zum Nachweis von Protein-codierenden Genen kann RNA-Seq auch verwendet, um neuartige erfassen und zu analysieren Transkriptionsniveau des nicht-kodierenden RNAs, wie lange werden nicht-kodierende RNA 15,16, MikroRNA 17, 18 usw. siRNA. Wegen tEr Genauigkeit dieser Methode wurde zum Nachweis von single nucleotide Variationen 19,20 verwendet.

Vor dem Aufkommen der RNA-Seq-Technologie, Mikroarray war die wichtigste Methode für die Analyse von Genexpressionsprofil verwendet. Vorgefertigte Sonden synthetisiert und anschließend an einer festen Oberfläche befestigt ist, um einen Mikroarray-Objektträger 21 zu bilden. mRNA extrahiert und in cDNA umgewandelt. Während der reversen Transkription Verfahren werden fluoreszenzmarkierte Nukleotide in die cDNA eingebaut, und die cDNA kann auf die Mikroarray-Objektträger hybridisiert werden. Die Intensität des von einer bestimmten Stelle gesammelt Signals hängt von der Menge an cDNA-Bindung an die spezifische Sonde an dieser Stelle 21. Verglichen mit RNA-Seq-Technologie, hat Microarray mehrere Einschränkungen. Zunächst setzt Microarray auf dem bereits bestehenden Wissen der Gen-Annotation, während RNA-Seq-Technologie ist in der Lage, neue Transkripte bei relativen hohen Hintergrundkonzentration, die seine Verwendung, wenn begrenzt erkennen gene Expressionsniveau ist niedrig. Außerdem hat das RNA-Seq-Technologie viel höheren Dynamikbereich der Erfassungs (8000-fach) 7, wobei aufgrund der Hinter und Sättigung von Signalen, ist die Genauigkeit der Mikroarray sowohl von hoch und niedrig exprimierten Genen 7,22 begrenzt. Schließlich unterscheiden sich Mikroarray-Sonden in ihren Hybridisierungseffizienzen, die bei einem Vergleich relativen Expressionslevel der verschiedenen Transkripte innerhalb einer Probe 23 die Ergebnisse weniger zuverlässig machen. Obwohl RNA-Seq hat viele Vorteile gegenüber Mikroarray ist ihre komplexe Datenanalyse. Dies ist einer der Gründe, warum viele Forscher Mikroarray verwenden noch immer statt RNA-Seq. Verschiedene Methoden der Bioinformatik für RNA-Seq Datenverarbeitung und -analyse 24 erforderlich.

Unter mehreren Next-Generation-Sequencing (NGS) Plattformen, 454, sind Illumina, solide und Ion Torrent die am häufigsten benutzten. 454 war der erste kommerzielle NGS-Plattform. Im Gegensatz zu den anderen Sequenzierplattformenwie Illumina und SOLID erzeugt der 454-Plattform mehr gelesen Länge (durchschnittlich 700 Basis liest) 25. Länger liest sich besser für erstmalige Beschreibung transcriptiome aufgrund ihrer höheren Effizienz montieren 25. Der Hauptnachteil des 454-Plattform ist die hohe Kosten pro Megabasen der Sequenz. Die Illumina und SOLID-Plattformen erzeugen liest mit erhöhten Zahlen und kurze Längen. Die Kosten pro Megabasen-Sequenz ist viel niedriger als die Plattform 454. Aufgrund der großen Zahl von kurzen liest die Illumina und SOLID-Plattformen ist die Datenanalyse viel rechenintensiver. Der Preis des Gerätes und Reagenzien für die Sequenzierung der Ion Torrent Plattform ist billiger und die Sequenzierung Zeit kürzer 25. Allerdings ist die Fehlerrate und die Kosten pro Megabasen der Sequenz sind höher als in der Illumina und SOLID Plattformen. Unterschiedliche Plattformen haben ihre eigenen Vor- und Nachteile und erfordern unterschiedliche Methoden zur Datenanalyse. Die plaTForm sollten auf der Grundlage der Sequenzierung Zweck und der Verfügbarkeit der Mittel gewählt werden.

In diesem Beitrag nehmen wir Illumina RNA-Seq-Plattform als Beispiel. Wir verwendeten EML Zelle als Modellsystem, um die Schlüsselregulatoren in EML Zellselbsterneuerung und Differenzierung zu untersuchen, und eine detaillierte Methoden der RNA-Seq Bibliothekskonstruktion und Datenanalyse für Expressionsniveau Berechnung und neuartige Transkript Erkennung. Wir haben in unserer früheren Veröffentlichung, dass RNA-seq Studie in EML Modellsystem 2, wenn sie mit Funktionsprüfung (zB shRNA Zuschlags) bieten eine leistungsfähige Ansatz zum Verständnis des molekularen Mechanismus der frühen Stadien von hämatopoetischen Differenzierung gezeigt und kann als dienen Modell für die Analyse der Zellselbsterneuerung und Differenzierung im Allgemeinen.

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Protokoll

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1. EML Zellkultur und Trennung von Lin-CD34 + und Lin-CD34- Zellen unter Verwendung Magnetic Cell Sorting System und fluoreszenzaktivierte Zellsortierverfahren

  1. Herstellung von Babyhamster-Nieren (BHK) Zellkulturmedium für die Stammzellfaktor Sammlung:
    1. Kultur BHK-Zellen in DMEM-Medium mit 10% FBS in 25 cm 2 -Kolben (Tabelle 1) bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem Zellkulturbrutschrank.
    2. Wenn Zellen wachsen, um 80 bis 90% Konfluenz, waschen Sie die Zellen einmal mit 10 ml PBS. 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zu der Monoschicht und Inkubieren der Zellen für 1-5 min bei Raumtemperatur (RT) bis die Zellen abgelöst werden.
    3. Pipette die Lösung oben und unten vorsichtig aufzubrechen Zellklumpen. 5 ml komplettem DMEM in den Kolben zu Trypsinaktivität stoppen. Sammeln Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg für 5 Minuten bei RT.
    4. Entfernen des Mediums und Resuspendieren des Zellpellets in 10 ml frische BHK-Zellkulturmedium.
      5. Übertragungs 2 ml der Zellsuspension aus Schritt 1.1.4 auf eine neue 75 cm 2 eingewogen und 48 ml der frischen BHK-Zellkulturmedium in den Kolben.
  2. Kultur die BHK-Zellen für zwei Tage zu sammeln und das Kulturmedium. Gang das Medium durch einen 0,45 um-Filter. Bewahren Sie das Medium, in -20 ° C bis zur weiteren Verwendung.
  • EML Zellkultur:
    1. Kultur EML-Zellen (in Suspension) in Grundmedium, das EML BHK-Zellkulturmedium (Tabelle 1) bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem Zellkulturbrutschrank.
    2. Aufrechterhaltung der EML Zellen bei geringer Zelldichte (0,5-5 x 10 5 Zellen / ml) mit dem Spitzendichte von weniger als 6 x 10 5 Zellen / ml. Aufgeteilt, die Zellen alle 2-3 Tage in einem Verhältnis von 1: 5. Passage EML Zellen vorsichtig und entsorgen Sie die Kultur nach Passagieren für 10 Generationen.
  • Depletion von Lineage-positiven Zellen:
    1. Ernten Sie die EML Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g for 5 min und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Sammeln der Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min.
    2. Resuspendieren der Zellen mit PBS und zähle die Zellen mit einem Hämozytometer. Bestimmen Sie die Antikörper-Konzentration in der anschließenden Zellseparationsschritt nach der Anzahl der Zellen (beachten Sie bitte die Anweisungen des Anbieters des Zellisolationssystem angeboten beziehen).
    3. Isolieren Sie die Linie negativ (Lin-) Zellen unter Verwendung Linie Antikörper-Cocktail (Cocktail aus Biotin-konjugierten monoklonalen Antikörper CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G / C), 7-4 und Ter-119 ) und eine magnetische Zellsortierung System nach den Anweisungen des Herstellers.
  • Trennung von Lin-CD34 + und Lin-CD34- Zellen:
    1. Spin-down der Lin- Zellen aus Schritt 1.3.3 bei 200 × g für 5 min. Zellpellet mit PBS und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer.
    2. Waschen der Zellen zweimal mit FACS-Puffer und Pelletierung der Zellen bei 200 xgfür 5 min.
    3. Beschriften fünf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit der Nummer 1, 2, 3, 4, 5 auf. Resuspendieren der Zellen mit 100 & mgr; l FACS-Puffer pro 10 6 Zellen (10 6 Zellen pro Röhrchen).
    4. In 1 ug Anti-Maus-CD34 FITC-Antikörper in Röhrchen 1 und Rohr 2 und die Röhrchen vorsichtig mischen.
    5. Alle Röhrchen bei 4 ° C inkubieren für 1 h in der Dunkelheit.
    6. In 0,25 ug PE-konjugierten Anti-Sca1 Antikörper und 20 ul APC-konjugierten Lineage Cocktail Antikörper in Röhrchen 1, 0,25 ug PE-konjugierten Anti-Sca1 Antikörper gegen Rohr 3 und 20 ul APC-konjugierten Lineage Cocktail Antikörpern gegen Rohr 4.
    7. Mischen Sie alle Röhrchen vorsichtig und Inkubation der Zellen bei 4 ° C für weitere 30 min im Dunkeln.
    8. Hinzufügen von 300 & mgr; l FACS-Puffer zu den Zellen und Spin-down werden die Zellen bei 200 g für 5 min.
    9. Mit 500 & mgr; l FACS-Puffer dreimal Waschen der Zellen.
    10. Zellpellet in 500 ul FACS buffer.
    11. Verwenden Sie die Zellen in Röhrchen 2, 3, 4 und 5 für die Einrichtung Entschädigung. Isolieren Lin-SCA + CD34 + und Lin-SCA-CD34- Zellen in Rohr 1 mittels FACS Aria.

    • 2. RNA Präparation und Library Construction für Hochdurchsatz-Sequenzierung

    1. Isolation, Qualitätsanalyse und Quantifizierung von RNA:
      1. Auszug Gesamt-RNA aus Lin-CD34 + und Lin-CD34- Zellen jeweils mit TRIzol nach fertigt 'Protokoll.
      2. Entfernen Sie die kontaminierten DNA unter Verwendung Desoxyribonuclease I (DNase I) folgende Protokoll des Herstellers. Gegebenenfalls, speichern die RNA bei -80 ° C bei diesem Schritt für die weitere Verwendung.
      3. Bewerten Sie die Qualität der Gesamt-RNA mit Bioanalyzer gemäß den Anweisungen des Lieferanten angeboten. Verwenden RNA-Probe mit RNA Integrity Number (RIN) lager als 9.
    2. Library Construction und Hochdurchsatz-Sequenzierung:
      HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt RNA-Seq mit Illumina-Plattform. Fürandere Sequenzierungsplattformen werden verschiedene Bibliothekspräparationsmethoden erforderlich.
      1. Verwenden 0,1-4 ug hochwertige Gesamt-RNA pro Probe für Bibliotheks Vorbereitung. Regel 2 ug Gesamt-RNA aus 10 5 EML Zellen extrahiert werden.
      2. Verwenden einer RNA-Sequenzierungsprobenvorbereitungssystem für RNA-Reinigung und Fragmentierung, ersten und zweiten Strang der cDNA-Synthese Ende Reparatur, 3'-Enden Adenylierungs, Adapter-Ligation und PCR-Amplifikation, nach den Standardverfahren von detaillierten Instruktionen des Anbieters.
        1. Günstig wählen PolyA-mRNA mit Oligo-dT-magnetischen Kügelchen und Zersplitterung des mRNA.
        2. Zuführen reverse Transkription unter Verwendung von Zufallsprimern, um die cDNA zu erhalten, und anschließend die Synthese des zweiten Strangs der cDNA, um doppelsträngige cDNA zu erzeugen.
        3. Entfernen Sie die 3'-Überhänge und die 5 zu füllen 'Überhänge durch DNA-Polymerase. Adenylat 3'-Enden von cDNA-Fragmenten aus Ligation miteinander zu verhindern.
        4. Hinzufügen Multiplexschalt Adapter an beide Enden der dscDNA. Zuführen PCR zur Anreicherung von DNA-Fragmenten.
      3. Messung der A260 / A280, um Informationen über die Konzentration der Bibliothek unter Verwendung eines Spektrophotometers erhalten.
      4. Beurteilen Sie die Bibliothek Qualität und messen den Größenbereich von DNA-Fragmenten mit einem Bioanalyzer.

    3. Datenanalyse

    Als Referenz der Software in diesem Teil verwendet wird, finden Sie in (Tabelle 2).

    1. Datendateiverarbeitung für Downstream-Analyse:
      1. Konvertieren .bcl (Basis Call-Datei) Datei zu Datei .fastq Verwendung casava Software (Illumina, Version 1.8.2).
        1. Starten Sie den 'Terminal' im Linux-System. Gehen Sie auf die Datenordner, die die Datendatei von einem Illumina HiSeq2000 Sequenzierungsmaschine enthält. Angenommen das Ergebnis Ordner 'NASboy1 / JiaqianLabData / HiSeq_RUN / 2013_07_11 / 130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX /', Typim Befehl in Abbildung S1A, und geben Sie den Datenordner.
        2. Installieren casava 1.8.2 in das Linux-System. Angenommen, der output ist 'Unaligned', verwenden Sie den Befehl in Abbildung S1B, die Konfigurationsdatei für die Umwandlung vorzubereiten. Verwenden Sie die Option --fastq-Cluster-count 0, um sicherzustellen, nur eine .fastq Datei wird für jede Probe erstellt. Die erzeugte .fastq Datei im .gz-Format. Entpacken Sie es für Downstream-Analyse (Abbildung S1B).
        3. Nachdem der 'Unaligned' Ordner erzeugt wurde, gehen Sie zum 'Unaligned' Ordner (Abbildung S1C).
        4. Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S1D um den Konvertierungsprozess zu beginnen. Der Parameter '-j' liefert die CPU-Nummer, die verwendet werden.
        5. Nachdem das System abgeschlossen Umwandlungsprozess, gehen Sie zu dem Ergebnis, Ordner unter 'Unaligned' Ordner (Abbildung S1E).
        6. Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S1F </ Strong>, um die Datei in .fastq.gz .fastq Datei unter jeder Probe Ordner entpacken.
    2. Detect neuer Transkripte und bewerten das Expressionsniveau mit Tuxedo Suite 26:
      1. Ordnen Sie die Paired-End-RNA-Seq liest zur Maus Referenzgenom (UCSC Version MM9, erhalten aus http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html ) mit Tophat-Software (Version 1.3.3) 27, die verwendet die Bowtie lesen Mapper (Version 0.12.7) 28. Tophat mit der Option "-no-Roman-juncs", um die Schätzgenauigkeit der Expressionsniveau verbessern geliefert.
        1. Setzen Sie die .fastq Dateien in einem Ordner, in dem die Mapping-Prozess umgesetzt werden. Angenommen, es gibt zwei .fastq Dateien (umbenennen Example1.read1, Example1.read2) für eine Paired-End-Sequenzierung Probe, verwenden Sie den Befehl in Abbildung S2, um die Zuordnung (passen Sie die Parameter entsprechend der Systemeinstellung) zu tun.Der Parameter "-p" liefert die CPU-Nummer, die verwendet werden. Die "-r" und "-mate-STD-dev" Parameter können aus der Bibliothek QC erhalten oder aus einer Teilmenge ausgerichtet gefolgert liest (Abbildung S2) werden.
      2. Montieren Sie den abgebildeten liest in RNA-Transkripte mit der Manschettenknöpfe-Software (Version 1.3.0) 29. Führen Manschettenknöpfe mit der Anmerkungsdatei von bekannten Genen (gleiche .GTF Datei Tophat verwendet) und .bam Datei Tophat produziert.
        1. Nach dem Ausführen Tophat abgeschlossen, im selben Ordner, verwenden Sie den Befehl in Abbildung S3A um Manschettenknöpfe laufen Transkriptom und Schätzung Transkript Expressionsniveau zu konstruieren. Die 'mm9_repeatMasker.gtf' und Genomsequenz-Dateien im Ordner "GenomeSeqMM9 'kann von UCSC Genome Browser erreicht werden.
        2. Die resultierenden genes.expr und transcripts.expr Dateien enthalten den Ausdruckswert der Gene und Transkripte (Isoformen). Kopieren und Einfügender Inhalt der Datei in eine Excel-Datei mit Tabellenkalkulationsprogramm (Abbildung S3B) zu manipulieren.
        3. Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S3C die resultierende Datei 'transcripts.gtf' zu dem Aktenzeichen "mm9_genes.gtf 'um neue Transkripte identifizieren zu vergleichen.
        4. Die resultierende Datei enthält .tmap dem Vergleichsergebnis. Kopieren und fügen Sie den Inhalt der Datei in eine Excel-Datei und mit Tabellenkalkulationsprogramm zu bearbeiten. Transkripte mit Klassencode 'u' können als "neue" gegenüber dem Referenz .GTF Datei bereitgestellt (Abbildung S3D) berücksichtigt werden.
          HINWEIS: Für nachgeschaltete Analyse Bequemlichkeit, setzen Sie die FPKM Werte bis 0,1, wenn die Werte unter 0,1.
          HINWEIS: Schritt 3.2.3 - 3.2.6 ist optional für diejenigen, die die Genauigkeit des Ausdrucks Schätzung neuer Transkripte 'verbessern möchten. Dadurch wird eine wesentlich längere Zeit in Anspruch nehmen, weil Kartierung und Transkriptom Konstruktion müssen run mehr als einmal.
      3. Führen Tophat mit Default-Parameter und führen Sie Manschettenknöpfe erzeugt .GTF Datei mit dem Befehl in Abbildung S3E.
      4. Vergleichen Sie die entstandene .GTF Datei in das Referenzgenom .GTF Datei mit dem Befehl in Abbildung S3F.
      5. Analysieren Sie die in Folge .tmap Datei wie in Schritt 3.2.2.4 beschrieben. Kopieren und fügen Sie den Inhalt der Datei in eine Excel-Datei und mit Tabellenkalkulationsprogramm zu bearbeiten. Transkripte mit Klassencode 'u' kann als betrachtet werden "Roman" im Vergleich zum Referenz .GTF Datei zur Verfügung gestellt.
      6. Nach dem Schritt 3.2.5 gibt es eine .combined.gtf Datei in dem Ordner, der als Referenz .GTF Datei verwendet werden kann. Eine zweite Auflage von Tophat und Manschettenknöpfe können wie in Schritt 3.2.1 und 3.2.2 beschrieben, um eine genauere FPKM Abschätzung neuer Transkripte zu erhalten durchgeführt werden.
    3. Detect differentially exprimierten Gene mit DESeq Paket 30.
      1. Der Eingang des DESeq ist eine rohe Lese zählt Tisch. Um eine solche Tabelle zu erhalten, verwenden Sie die htseq-count Skript mit dem HTSeq Python-Paket, das aus HTSeq Website heruntergeladen werden kann verteilt ( http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html ) .
        1. Stellen Sie sicher, dass samtools, Python und htseq-count programsare im System installiert. Erhalten rohen Lesezählung Zahlen von tophat Ausgabe mit dem Befehl in Abbildung S4A.
        2. Bereiten 'Raw_Count_Table.txt', 'ExperimentDesign.txt' Dateien mit Excel. Kopieren und speichern Sie den Inhalt in TXT-Format für die DESeq R-Paket (Abbildung S4B).
        3. Installieren R Programm im System. Im Terminal, zeigten Typ 'R' und drücken ENTER.A Bildschirmmeldung wird appearas in Abbildung S4C.
        4. Lesen Sie 'Raw_Count_Table.txt ',' ExperimentDesign.txt 'in R mit dem Befehl in Abbildung S4D.
        5. Legen DESeq Paket mit dem Befehl in Abbildung S4E.
        6. Factorize Bedingungen in R (Abbildung S4F).
        7. Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S4G negative Binominal Test auf dem normalisierten Zähltabelle laufen.
        8. Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S4H ausgegeben signifikante Differenz exprimierten Genen in einer CSV-Datei.
    4. Lookup Transkriptionsfaktoren "(TFS) FPKM Werte über Proben mit Hilfe von Excel. Intersect DE Gen Tisch und TFs Tisch. Gene gehören beiden Tabelle sind differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren.
      1. Besuchen Sie die Website http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php und laden Sie die Transkriptionsfaktoren. Dann Lookup der DE-Transkriptionsfaktoren in der Excel (< strong> Abbildung S5).
    5. Erzeugen .bigwig Datei für UCSC Genome Browser Visualisierung.
      1. Download 'bedtools' Softwarepaket von der Website https://github.com/arq5x/bedtools2 und installieren Sie die Software im System 31. Laden Sie die UCSC Tools 'bedGraphToBigWig' von der Website http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ und installieren Sie die Software im System.
      2. In dem Ordner mit dem .bam Datei, verwenden Sie den Befehl in Abbildung S6A zu .bam Datei tophat in .bed Datei generiert konvertieren.
      3. Nachdem die .bed Datei erzeugt wird, verwenden Sie den Befehl in Abbildung S6B zu .bigwig Datei zu generieren. Die Datei 'ChromInfo.txt' kann von folgender URL erhältlich:Arget = "_blank"> http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz.
      4. Beachten Sie eine benutzerdefinierte Spur auf UCSC Genome Browser. Siehe die Website http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html auf, wie eine benutzerdefinierte Spur mit UCSC Genom-Browser anzuzeigen.

    figure-protocol-1
    Abbildung S1: Konvertieren .bcl Datei Datei auf .fastq Verwendung casava Software.

    figure-protocol-2
    Abbildung S2: Mapping liest Genom Referenz mit Tophat.

    figure-protocol-3 Abbildung S3: Nachweis von neuer Transkripte und Expressionsniveau Schätzung.

    figure-protocol-4
    Abbildung S4: Aufruf Differential exprimierte Gen mit DESeq Paket.

    figure-protocol-5
    Abbildung S5: Bezeichnung des differentiell exprimierten Transkriptionsfaktoren.

    figure-protocol-6
    Abbildung S6: Konvertieren Mapping-Ergebnis für die Datenvisualisierung.

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    Ergebnisse

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Um differenziell exprimierte Gene in Lin-CD34 + und Lin-CD34- EML Zellen zu analysieren, haben wir RNA-Seq-Technologie. Abbildung 1 zeigt den Workflow der Verfahren. Nach der Isolierung von Lineage-negativen Zellen durch magnetische Zellsortierung, trennten wir Lin-SCA + CD34 + und Lin-SCA-CD34- Zellen mittels FACS Aria. Lin angereicherte EML-Zellen wurden mit anti-CD34, anti-Sca1 und Abstammung cocktail Antikörpern gefärbt. Nur Lin- Zellen wurden für die Analyse von Sca1 und CD34 Expression gated. Zwei...

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    Diskussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Mammalian Transkriptom ist sehr komplex 34-38. RNA-Seq-Technologie spielt eine immer wichtigere Rolle in den Untersuchungen der Transkriptomanalyse, neuer Transkripte Erkennung und single nucleotide Variation Entdeckung etc. Es hat viele Vorteile gegenüber anderen Methoden zur Genexpressionsanalyse. Wie in der Einleitung erwähnt, überwindet sie die Hybridisierung Artefakte der Mikroarray und kann verwendet werden, um neue Transkripte de novo zu identifizieren. Eine Einschränkung der R...

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    Offenlegungen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Die Autoren haben nichts offenzulegen.

    Danksagungen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    JQW, SZ, SD und KC werden durch Zuschüsse der National Institutes of Health und des Staman Ogilvie Fund – Memorial Hermann Foundation unterstützt.

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    Materialien

    Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
    NameUnternehmenKatalognummerKommentare
    Antibiotikum-AntimykotikumInvitrogen15240-062BHK-Zellkultur
    Anti-Maus CD34 FITCeBioscience11-0341-81FACS-Sortierung
    Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1) PEeBioscience12-5981-81FACS-Sortierung
    APC Maus-Abstammung Antikörper-CocktailBD Biosciences558074FACS-Sortierung
    BD FACSAria ZellsortiererBD BiosciencesSonderangebot sysmtemFACS Sortierung
    Corning™ Mit Zellkulturen behandelte Kolben 75 cm2Corning integriert430641Zellkultur
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    Desoxyribonuklease I, AmplifikationsgradInvitrogen18068-015Bibliotheksvorbereitung
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    PferdeserumInvitrogen16050-122EML-Zellkultur
    IMDMHyCloneSH30228.02EML-Zellkultur
    L-GlutaminInvitrogen25030-081Zellkultur
    Lineage Cell Depletion Kit, MausMiltenyi Biotec130-090-858Isolierung von abstammungsnegativen Zellen
    NanoVue Plus SpektralphotometerGE Healthcare28-9569-62Qualitätskontrolle
    Thermo Scientific & trade Napco&Handel; 8000 CO2 InkubatorenThermo Scientific15-497-002Zellkultur
    Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140-122EML-Zellkultur
    TRIzol® ReagenzInvitrogen15596-018RNA-Exraktion
    TruSeq™ RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48 rxn)IlluminaRS-122-2002Vorbereitung der Bibliothek
    2100 Elektrophorese-BioanalysatorInstrument AgilentG2939AAQualitätskontrolle
    0,25% Trypsin-EDTAGibco25200Zellkultur
    0,45 &Mikro; m SpritzenvorsatzfilterNalgene190-2545Zellkultur

    Referenzen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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