Synergetische Nutzung von neuralen Vorläuferzellen und Self-Montage Peptide in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Summary

Die Behandlung von zervikalen Rückenmarksverletzungen sowohl mit selbstorganisierenden Peptiden (SAP) als auch mit neuralen Vorläuferzellen (NPC) zusammen mit Wachstumsfaktoren ist ein vielversprechender Ansatz, um die Regeneration und Genesung zu fördern. Es wird ein Kontusions-/Kompressions-Aneurysma-Clip-Rattenmodell für zervikale Querschnittlähmung und eine kombinierte Behandlung mit SAP-Injektion und NPC-Transplantation etabliert.

Abstract

Rückenmarksverletzungen (SCI) zu schweren neurologischen Störungen und psychischen, wirtschaftlichen und sozialen Folgen für die Patienten und ihre Familien. Klinisch mehr als 50% der SCI beeinflussen die Halswirbelsäule ^1. Als eine Folge der primären Verletzung, treten eine Kaskade von Sekundärmechanismen einschließlich Entzündung, Apoptose und Demyelinisierung schließlich zur Narbenbildung des Gewebes und die Entwicklung der Markhöhlen ^2,3 führt. Beide stellen physikalische und chemische Barrieren für Zelltransplantation, Integration und Regeneration. Daher Gestaltung der hemmenden Umwelt und Überbrückungs Hohlräume, eine unterstützende Umfeld für die Zelltransplantation und Regeneration zu schaffen ist ein vielversprechendes therapeutisches Ziel ^4. Hier wird eine Prellung / Druckmodell von Gebärmutterhalskrebs SCI mit einem Aneurysma Clip beschrieben. Dieses Modell ist klinisch relevant als in anderen experimentellen Modellen, da eine vollständige Durchtrennung oder Brüche des Kabels sind selten. Auch in VERGLEICHn dem Gewicht Drop-Modell, das vor allem die Schäden Rücken Säulen, vorteilhaft erscheint Umfangs Kompression des Rückenmarks. Clip Schließkraft und Dauer kann eingestellt werden, um verschiedene Verletzungsschwere zu erzielen. Eine Ringfeder erleichtert die präzise Kalibrierung und Konstanz der Kraft Clip. Unter physiologischen Bedingungen synthetischen selbst organisierenden Peptide (SAP) durch Selbstorganisation von Nanofasern und damit sind ansprechend für den Einsatz in SCI ^5. Sie können direkt in die Läsion Minimierung von Schäden an dem Seil eingespritzt werden. SAPs sind biokompatibel Strukturen errichten Gerüste zu Mark Hohlräume überbrücken und damit schaffen, damit die beschädigten Kabel für regenerative Therapien. K2 (QL) 6K2 (QL6) ist ein von Dong et einer l. ⁶ eingeführt Im Vergleich zu anderen Peptiden neue SAP, QL6 Selbst versammelt in β-Faltblättern bei neutralem pH ⁶ 0,14 Tage nach der SCI, nach dem akuten Stadium, SAPs jeweils in der Mitte der Läsion und neuralen Vorläuferzellen (NPC) injiziert sind injein benachbarte dorsale Säulen cted. Um das Überleben der Zellen zu unterstützen, wird die Transplantation mit kontinuierlicher subduralen Verabreichung von Wachstumsfaktoren durch osmotische Mikropumpen für 7 Tage in Verbindung.

Introduction

Mehr als 50% von Rückenmarksverletzungen an der zervikalen Wirbelsäule. In der klinischen zwei Haupt pathophysiologischen Mechanismen werden beschrieben: das anfängliche Quetschung des Rückenmarks und anschließend den laufenden Kompressionsknochenfrakturen, Blutungen oder Gewebe Schwellung verursacht.

Die Aneurysmaklammer Quetschung / Kompressionsmodell ahmt sowohl pathophysiologischen Mechanismen: Einrasten des Clips erzeugt eine Quetschung und die Dauer der Clipping stellt die Kompressionskomponente eingeräumt, daß die Verdichtung im klinischen Umfeld von Knochenbrüchen, Blutungen oder Gewebe verursachte Schwellungen letzte signifikante länger. Das verwendete Aneurysmen-Clip wird von einer Ringfeder garantieren exakte und reproduzierbare Clipping Kraft geändert. Insbesondere im Vergleich zu den Hemi-Durchtrennung oder Prellung Modell dieser Aneurysmen-Clip-Modell imitiert besten klinischen Umgebungen. Während Patienten mit Brust-Verletzungen leiden Querschnittslähmung, die meisten Patienten mit zervikaler injuries sind Tetraplegiker und völlig abhängig. Die anatomische Struktur des Zervikalmark jedoch signifikante Unterschiede im Vergleich zu der Brust- oder Lendenwirbelsäule, und somit wird insbesondere des Protokolls.

Die Entwicklung der Markhöhlen und Gewebenarbenbildung sind Hindernisse für die Wiederherstellung und Regeneration. Zur Überwindung dieser Hindernisse den Einsatz von Gerüstmaterial ist ein vielversprechender Ansatz. Selbstorganisierende Peptide können direkt zum Epizentrum der Läsion injiziert werden. Dort werden sie in Nanofasergerüste Überbrückung der Hohlraum zusammenstellen und verbessern die hemmende Umwelt durch die Verringerung Entzündung und Gewebe erschrecken. Während starre Materialien verursachen erhebliche Schäden des Rückenmarks während der Implantation können die Flüssigkeits Peptide sicher und ohne schwere zusätzlichen Schaden eingespritzt werden.

Die Verbesserung der hemmenden Umgebung mit sich selbst organisierenden Peptide vor Stammzelltransplantation daher unterstützt Zelle integration, Differenzierung und schließlich die funktionelle Erholung, nach einer zervikalen Rückenmarksverletzungen.

Protocol

HINWEIS: Die folgenden Versuchsprotokoll wurde von der Tierpflege Ausschuss des University Health Network (Toronto, Kanada) genehmigt und ist in Übereinstimmung mit den Richtlinien in der Anleitung zur Pflege und Verwendung von Versuchstieren durch die kanadische Rat der Tierpflege vorbereitet gegründet .

1. Cervical Aneurysmenclip Prellung / Kompressions Modell

1. Vor der Operation Autoklav Instrumente und sterilen Bedingungen während des gesamten surgcial Verfahren, indem Sie die Instrumente in einem 70% igem Alkohol-Bad.
2. Betäuben Wistar-Ratten (250-270 g) mit einer Kombination aus Sauerstoff (O _2), Distickstoffoxid (N ₂ O) (1: 1), und 1,8-2,2% Isofluran und unterstützen die Spontanatmung über ein Gasnarkosemaske. Zur Einleitung der Narkose beginnen mit 5% Isofluran für 1 Minute und anschließend zu reduzieren. Vor Beginn der Operation, Steuernarkosetiefe, indem sie eine schmerzhaften Reiz (zB. An den Pfoten). Bewerben Fettsalbenin den Augen zur Trockne zu vermeiden und nachfolgende Infektionen zu verhindern.
3. Setzen Sie die Ratten auf ein Heizkissen (37 ° C) und befestigen Sie den Kopf in einen stereotaktischen Rahmen.
4. Rasieren Sie die OP-Region um die Halswirbelsäule und desinfizieren mit Povidon-Jod und 70% Alkohol.
5. Machen Sie eine Mittellinienschnitt über der Wirbelsäule von der Halswirbel (C2) bis an den prominenten processus der Brustwirbelkörper 2 (T2).
6. Durch die äußere Schicht der Wirbelmuskulatur direkt an der Mittellinie geschnitten in einer kraniokaudale Richtung (um Blutungen zu vermeiden) und weiter zu sezieren die tieferen Muskelschichten unverblümt, bis Sie die Dornfort und die Schichten zu erreichen. Legen Wundhaken.
7. Richten Sie die herausragende Dornfort der Wirbelkörper T2, um die angestrebte Niveau für Laminektomie beobachten. Nach der Identifizierung und mikrochirurgische Präparation der ausgewählten Schichten, schneiden durch die ligamenti flavae die Lamellen und der Dornfort lockern. Schließlich cut durch die Lamellen mit einem Knochen Schneidemaschine lateral des Rückenmarks und entfernen Sie diese vorsichtig und vermeiden Sie jede Kompression des Rückenmarks selbst.
   HINWEIS: Die häufigsten Ebenen C5 / 6, C6 / 7, oder C7 / T1. Die perioperative Mortalität erhöht die mehr rostral der Ebene der Verletzung. Blutungen aus dem paravertebral Sinusvenen ist üblich und kann durch sorgfältige Verdichtung mit Schwamm angegangen werden.
8. Vor dem Einsetzen der Clip, um das Kabel zu traumatisieren, Ermittlung neuer Nervenwurzeln, um sie von Clipping (vor allem auf der Ebene der C5 / 6) zu schonen.
9. Um einen reibungslosen Clip Induktion zu gewährleisten, lösen Sie die ventrale Dura von der dorsalen Seite der Wirbelkörper mit einem Haken und bereiten einen Korridor für den Clip.
10. Schließlich legen Sie die offene Klammer und lassen Sie es einrasten herunter (Schnellverschluss), um eine Quetschung Verletzungs erzielen. Clip Schließkraft und die Dauer der Clipverschluß bestimmen die Intensität des Traumas und das Ausmaß der Kompression. Gebräuchlich sind Clip Kräften von 15 bis 35 g und einer clipping Dauer von beispielsweise 1 min. (Abbildung 1).
11. Nach dem Entfernen des Clips Muskeln in 2 Lagen, anzupassen und die Wunde.
12. Stoppen Anästhesie und ließ das Tier aufwachen unter die kontinuierliche Beobachtung, bis es ausreichend, das Bewusstsein für die Brustlage gewinnt. Schließlich legte die Ratte in einem Käfig und folgen der postoperativen Behandlungsrichtlinien.
13. Da Tiere kämpfen mit der Schwere dieser Art von Verletzungen müssen Sie besonderes Augenmerk auf die postoperative Behandlungen zu zahlen:
    1. Verabreichen Schmerzmittel (Buprenorphin und Meloxicam für 3 Tage und 5 Tage betragen und entsprechend den klinischen Symptomen).
    2. Geben Sie zusätzliche Kochsalzlösung subkutan für 3 Tage (2 mal am Tag, 5-10 Milliliter (ml)).
    3. Geben Antibiotika im Trinkwasser 2 Tage vorher und bis 7 Tage nach der Operation (zB Moxifloxacin)
    4. Drücken Sie die Harnblase 2-3 mal pro Tag bis zur Wiederherstellung der Blasenfunktion konstant istly offensichtlich.
    5. Beobachten neurologische Defizite und physiologischen Zustand der operierten Tiere mindestens einmal täglich.

2. Injektion SAPs und NPCs (14 Tage nach der Verletzung)

1. Induzieren Anästhesie wie in 1.1 beschrieben. 1,3, fixieren Sie die Leiter der Ratte in einem stereotaktischen Rahmen, entfernen Sie die Stiche oder Wundklammern, und desinfizieren Sie die Wunde und das Operationsgebiet mit Povidon-Iod und 70% Alkohol.
2. Sorgfältig sezieren die paravertebralen Muskeln stecken Wundhaken, entfernen Narbengewebe mikroskopisch von der Dura, und wieder setzen die Läsion.
3. Bereiten SAPs in einer Konzentration von 1% (w / v), um eine extrazelluläre Matrix-Gel durchzuführen. QL6 SAPs einen physiologisch verträglichen pH-Wert und muss nicht vor der Injektion gepuffert werden. Zur Visualisierung von SAPs im Rückenmark, mit einem fluoreszierenden Derivat des QL6 (QL6-FITC).
4. Injizieren SAPs (5 Mikroliter (ul) in das Zentrum der Läsion, in 2 Portionen zu je verteilten2,5 ul bilateralen von der Mittellinie. Verwenden einer Hamilton-Spritze auf das stereotaktische Rahmen mit einer Mikro Glaskapillare (100 Mikrometer (um) Außendurchmesser (OD)) verbunden ist. Öffnen Sie die Dura vorsichtig mit der Spitze eines scharfen Nadel, und setzen Sie die Glaskapillare stereotaktisch 2 Millimeter (mm) in den traumatisierten Rückenmark.
5. Nach der Injektion 1/3 des Volumens, entfernen Sie die Nadel bis 1,5 mm Tiefe, und nach einer weiteren 1/3 bis 1 mm. Nach dem Einspritzen des gesamten Volumens, und vor dem Entfernen der Spritze 5 Minuten warten, um die Gelbildung zu stabilisieren.
6. Um NPCs zu generieren, verwenden erwachsenen DsRed Mäuse (oder YFP-positiven Mäusen, grün) und zu isolieren und kultivieren sie vom paraventrical Zone ^4,18,21.
7. Beurteilen Lebensfähigkeit NSC durch Trypan-Blau-Färbung, was die Anwesenheit von ~ 90% lebende Zellen in der Zellsuspension. Verdünnen Sie die Zellen in Wachstumsmedium (50 x 103 lebenden Zellen / ul) und nutzen sie für Zelltransplantation.
8. Stellen Sie vier 2 ul (8 ul Gesamt volume, mit 4 x 10 ⁵ NPCs) intraspinale Injektionen bilateral bei 2 mm rostral und kaudal von der Verletzungsstelle. Nach dem Öffnen der Dura, legen Sie die Hamilton Mikro Glaskapillare 1,5 mm unter der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks und injizieren 2 ul der Zellsuspension. Wählen Sie eine Injektionsrate bei etwa 0,5 ml / min (min).
9. Am Ende jeder Injektion und vor der Entnahme der Kapillare aus Kabel Warten für mindestens 1 min Dehnen, um die neue Zellenvolumen unterzubringen ermöglichen Gewebe. (Figur 2)

3. Die Implantation von Subdurale Pumpen für Growth Factor Anwendung

1. Um die Rückenmarksflüssigkeit (CSF) mit Wachstumsfaktoren zu bereichern unterstützen das Überleben der Zelle, verwenden Mikro osmotischen Pumpen Unter durally Verdünnung Wachstumsfaktoren in ganz 7-14 Tage, mit einer Verdünnungsrate von 0,5 ul / h, eine Katheterdurchmesser von 0,04 cm OD und einem Behältervolumen von 100 ul.
2. Wählen Sie bevorzugte Wachstumsfaktoren(ZB brain derived growth factor (BDGF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)), füllen Sie die Pumpen 6-10 Stunden vor der Implantation und ins Gleichgewicht kommen Pumpen in einem Wasserbad bei 37 ° C.
3. Unmittelbar nach NPC-Injektionen, bereiten eine subkutane Aussparung, um die Pumpe zu platzieren. Bevorzugte Standorte sind die Seitenflanken thoraco- Bauchregion zu vermeiden großen lokalen Beschwerden durch die Pumpe selbst verursacht.
4. Um die höchste Konzentration von Wachstumsfaktoren zu erhalten, dass das offene Ende des Katheters endet in der Nähe der Verletzungsstelle. Daher führen Sie eine Skip-Laminektomie des benachbarten oberen oder unteren Ebene. Zum Beispiel, wenn die SCI ist an C7 / T1, führen eine kleine Laminektomie C5.
5. Bringen Sie die Pumpe in das Unterhaut Aussparung, verkürzen den Katheter auf die notwendige Länge, und sichern Sie sie mit mehreren Fäden (6,0) auf den paravertebralen Muskeln vermeiden jede Bewegung assoziierten Dislokation.
6. Nach dem Öffnen der Dura (zB bei C5) mit der scharfen Spitzeeiner Nadel, die Einführung des Katheters in die Subduralraum und lassen Sie es nach kaudal ohne Widerstand und ohne Verletzung der Schnur gleiten. Die übersprungenen Lamina zB C6 dient als zusätzliche Fixationspunkt und die Stabilisierung des Katheters.
7. Stellen Sie sicher, dass der Katheter einen reibungslosen Ablauf und nicht falten.
8. Schließen Muskeln für Schicht und die Haut, mit Nähten oder Klammern. (Figur 3)
9. Stoppen Anästhesie und ließ das Tier aufwachen unter die kontinuierliche Beobachtung, bis es ausreichend, das Bewusstsein für die Brustlage gewinnt. Schließlich setzte sie wieder in einem Käfig und folgen der postoperativen Behandlungsrichtlinien.
10. Stellen spezielle Nachbehandlung, obwohl möglicherweise teilweise Tieren zu diesem Zeitpunkt Punkt erholt haben:
    1. Verabreichen Schmerzmittel (Buprenorthine und Meloxicam für 3 Tage und 5 Tage betragen und entsprechend den klinischen Symptomen).
    2. Geben Antibiotika in Wasser Flaschen 2 Tage vor bis7 Tage nach der Operation (zB Moxifloxacin).
    3. Fahren Sie das Drücken der Harnblase, wenn immer noch notwendig.
    4. Geben Sie zusätzliche subkutanen Flüssigkeiten, wenn die Ratten dehydriert angezeigt.
    5. Halten Beobachten der neurologischen Funktion und den physiologischen Zustand der operierten Tiere mindestens einmal täglich.
    6. Verwalten Immunsuppression Behandlung 2 Tage vor der NPC Injektion und bis 7 Tage nach der transplanation (Minocyclin) und bis zur Tötung (Sandimmune), auf.

4. Tissue Bewertung

1. Opfern Tiere am Ende der Beobachtungszeit (z. 4 Wochen nach der SCI) in tiefer Narkose (5% Isofluran für 2-3 min) und durchströmen sie transkardial mit 50 ml kaltem (4 ° C) Salzlösung, gefolgt von 150 ml kaltem 4 % Paraformaldehyd in 0,1 M phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
2. Entfernen Sie das Rückenmark und steckte es in 4% Paraformaldehyd in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 24 Stunden.
3. Setzen Sie die Rückenmark in 25% Saccharose-Lösung für die Kryokonservierung für 48 Stunden.
4. Bereitzustellen Längs Kryoschnitte mit einer Dicke von <30 um.
5. Für die immunhistochemische Färbung von allen Zellkerne die eine Hintergrundverarbeitung nutzen DAPI (1: 1000). DsRed positive NPCs erscheinen rot, erscheint QL-6 FITC grün, und beide müssen daher nicht speziell gefärbt werden. (Abbildung 4).
6. Für die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) lassen Proben genießen in Glutaraldehyd bei 4 ° C für 2 Stunden, dehydrieren sie langsam in 10% -Schritten Schritte von Ethanol für 5 Minuten und legen Sie sie in einem unter Druck stehenden flüssigen CO ₂ Siphon 1 Stunde. Coat Gerüste mit Gold mit einem Sputter-Coater. Nehmen Sie Bilder mit einem Hitachi S-3400N Rasterelektronenmikroskop. (Figur 5)

Results

Bei der Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens, wird ein SAP Gerüstbrücken des Hohlraums und bietet eine Verbesserung der inhibitorischen Umgebung weniger Gewebenarbenbildung und eine Erhöhung der Überlebens NPC erhalten, Fig. 4 zeigt einen Längsschnitt eines Rattenrückenmark an das erhaltene Verletzungsstelle 6 Wochen nach der SCI und 4 Wochen nach QL6 SAP Einspritzung und NPC-Transplantation. QL6 Peptide wurden erfolgreich in die Mark injiziert, aggregiert im Epizentrum und diffuses rostro-kau...

Discussion

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um dem Leser zu ermöglichen, um eine Halsverletzung Modell an Ratten durchzuführen und eine kombinierte Behandlungsansatz mit SAPs und NPCs Förderung einer besseren Erholung nach Hals SCI verwenden.

Besonders im Vergleich zu anderen Verletzungen der Halswirbelsäule Modelle, wie der (Hemi) -transection Modell oder den Gewichtsverlust und eine Gehirnerschütterung Modelle, die Clip-Prellung / Kompression Modell stellt die beiden wichtigsten pathophysiologische...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aneurysma-Clip	SharpTech
Operationsmikroskop	Leica
Mikro-Injektionssystem	World Precision Instruments, Inc.
Stereotaktisches Instrument für Kleintiere	David Kopf Instruments
Hamilton-Spritze	Firma
Hamilton Subdural-Pumpen	osmotische Alzet-Mikropumpe 1007D
Chirurgisches Instrument	Werkzeuge
für die FeinmechanikIsoflurane USP	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.
0,9 % Natriumchlorid-Injektion USP	Baxter
7,5 % Povidon-Jod	Purdue Pharma
70 % Isopropylalkohol USP	GreenField Ethanol Inc.
QL6 SAP	Covidien
0,4% Trypanblau	Gibco
Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF)	Sigma
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	Sigma
Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)	Sigma